Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

PHẠM THỊ MONG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ
MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
ThS. CAO BÁ CƯỜNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn
và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin
được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Cao Bá Cường
(Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2).
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình của
các thầy cô của Viện NCKH và ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2, các thầy cô
trong khoa Sinh - KTNN, các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo
cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều
kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện khóa luận này.

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, 20 tháng 4 năm 2017
SINH VIÊN

Phạm Thị Mong


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả và số liệu trong khóa luận “Nghiên cứu
khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ
môi trường nước dừa già” là kết qủa nghiên cứu của cá nhân tôi trong suốt
thời gian qua dưới sự hướng dẫn trực tiếp của ThS. Cao Bá Cường, giảng
viên khoa Sinh - KTNN - Trường ĐHSP Hà Nội 2 và được thực hiện tại
“Viện NCKH và ƯD Trường ĐHSP Hà Nội 2”. Những số liệu và kết quả
trong khoá luận này là trung thực, không có sự trùng lặp hoặc sao chép của
một tài liệu nào khác.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, 20 tháng 4 năm 2017
SINH VIÊN

Phạm Thị Mong


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài....................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu................................................................................. 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ..................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................... 4

1. Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose ............................... 4
1.1. Cellulose vi khuẩn và tính chất của CVK.............................................. 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn............................................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn ............................................. 4
1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn......................................................... 5
1.1.4. Ứng dụng của CVK............................................................................. 6
1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose................................................................ 8
1.2.1. Phân loại A. xylinum ........................................................................... 8
1.2.2. Đặc điểm hình thái của A. xylinum ..................................................... 8
1.2.3. Đặc điểm sinh lý của A. xylinum......................................................... 9
1.2.4. Vai trò của CVK đối với A. xylinum................................................... 9
1.2.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ......................................................... 9
2. Giới thiệu về thuốc berberin ................................................................... 11
2.1. Công thức ............................................................................................. 11
2.2. Tính chất............................................................................................... 12
2.3. Tác dụng dược lý.................................................................................. 12
2.4. Tương tác thuốc ................................................................................... 12
2.5. Chỉ định................................................................................................ 13
2.6. Chống chỉ định ..................................................................................... 13
3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước............................................. 13


3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc ................................................................. 13
3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................... 13
3.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 13
3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK........................................................ 14
3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.................................................... 14
3.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......... 16
1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu........................................................... 16

2. Nội dung nghiên cứu............................................................................... 16
3. Các thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu................................. 16
4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 16
4.1. Phương pháp tạo màng CVK ............................................................... 16
4.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc berberin....... 18
4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK .......................... 20
4.4. Phương pháp dựng đường chuẩn ......................................................... 20
4.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK ..... 22
4.6. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả............................................... 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................. 24
1. Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong môi trường nước dừa già ....... 24
2. Màng CVK thu được sau nuôi cấy.......................................................... 24
3. Màng CVK tinh chế ................................................................................ 25
4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ................................................... 26
5. Màng CVK hấp thụ thuốc berberin......................................................... 27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 31
1. Kết luận ................................................................................................... 31
2. Kiến nghị................................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................... 32


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
A. xylinum

Từ đầy đủ
Acetobacter xylinum

CVK

Celulose vi khuẩn

OD

Mật độ quang phổ

ĐHSP

Đại học Sư phạm

NCKH và ƯD

Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng

Nxb

Nhà xuất bản


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK .......................................................................... 7
Bảng 1.2. Thành phần của nước dừa già......................................................... 10
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK............................................... 17
Bảng 2.2. Kết quả đo dường chuẩn thuốc berberin ở bước sóng 345nm
(n = 3)............................................................................................ 21
Bảng 3.1. Giá trị OD của dung dịch berberin 10% khi ngâm màng CVK
(n= 3)............................................................................................. 28
Bảng 3.2. Lượng thuốc berberin hấp thụ vào màng CVK (n = 3) .................. 29

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của berberin....................................................... 11
Sơ đồ 2.1. Quy trình sản xuất CVK ................................................................ 18
Sơ đồ 2.2. Quy trình xử lý thu CVK tinh khiết............................................... 19
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn berberin ở bước sóng 345nm ......................... 21
Hình 3.1. Màng CVK nuôi ngày đầu (a) và màng CVK nuôi ngày thứ 6 (b). 24
Hình 3.2. Màng CVK thu được sau khi nuôi cấy. .......................................... 25
Hình 3.3. Các quy trình xử lý màng CVK ...................................................... 25
Hình 3. 4. Kết quả thử sự hiện diện của đường glucose ................................. 26
Hình 3. 5. Màng CVK đang hấp thụ thuốc berberin....................................... 27


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là
bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose
được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh
vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK). Một trong những loài
vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là Acetobacter xylinum
(A. xylinum).
Cellulose vi khuẩn có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose
của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết
β-1,4 glucan), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không
chứa các hợp chất cao phân tử như lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến do
vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc [2], [28]. Màng
CVK ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi nó đã được ứng dụng nhiều
trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm môi trường
phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và
năng lượng cho tế bào, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay
thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc cùng nhiều

ứng dụng khác [28]. Gần đây, khả năng ứng dụng màng CVK không ngừng
được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et
al.,2000). Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức
độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy màng CVK được tạo nên từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi
trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum rất đa dạng như nước dừa già, rỉ đường,
nước mía,… Trong đó nước dừa già được coi là môi trường kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum [7].

1


Về mặt tính chất, CVK có độ tinh sạch lớn hơn nhiều so với các loại
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Ngoài ra CVK còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, khả
năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ,... Đồng thời CVK là một hàng rào cản
oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và
ngăn cản tác động của UV, ổn định về kích thước và hướng, màng CVK còn
có ý nghĩa giữ thuốc và giải phóng thuốc kéo dài [27], [20],… Bên cạnh đó,
các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống hấp thu thuốc làm tăng sinh
khả dụng của thuốc [20].
Nước ta thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa: nóng ẩm, mưa nhiều nên vi
khuẩn, nấm mốc và kí sinh trùng rất dễ phát triển, cùng với điều kiện vệ sinh
an toàn thực phẩm cũng như vệ sinh môi trường ở nhiều nơi còn khá thấp nên
dễ tạo thành tạo các bệnh như rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, đau mắt hột.
Berberin là thuốc thông thường mọi người hay sử dụng khi có dấu hiệu tiêu
chảy, thậm chí nhiều người luôn để sẵn trong túi xách.
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác

nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1.5-3%.
Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E. coli, điều trị
bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn, không
ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở ruột. Hiện nay
trên thị trường có các dạng bào chế của berberin như: thuốc nhỏ mắt, viên nén,
viên bao. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc cũng như
thành phẩm là rất quan trọng. Tuy nhiên berberin chủ yếu được sử dụng qua
đường uống với sinh khả dụng khá thấp. Việc đưa thuốc vào cơ thể là mong
muốn của các nhà điều chế thuốc trong nhiều thập kỷ qua nhằm tăng sinh khả
năng hấp thu của thuốc nhưng vấn đề này không hề đơn giản.


Với mục đích khắc phục những tác dụng phụ không mong muốn từ
thuốc berberin và giảm chi phí cho quá trình thí nghiệm và sản xuất. Đó là lí
do chúng tôi đã chọn đề tài: "Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin
của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già".
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu, chế tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum trong môi
trường nước dừa già.
- Thiết kế khả năng hấp thụ thuốc berberin dựa trên màng CVK nhằm
tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể.
- Làm thế nào để lượng thuốc hấp thu vào màng CVK là nhiều nhất.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng
cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già.
- Vật liệu nghiên cứu: màng CVK làm từ môi trường nước dừa già,
thuốc berberin.
- Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật

khoa Sinh - KTNN - Trường ĐHSP Hà Nội 2; Viện NCKH và ƯD Trường
ĐHSP Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu về màng CVK để tăng thêm
hiểu biết về ứng dụng của màng CVK, tìm ra được khả năng hấp thụ thuốc
berberin của màng CVK.
- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: nếu thành công, đề tài định hướng khắc
phục được nhược điểm berberin thông thường như nâng cao tác dụng của
thuốc, rút ngắn thời gian điều trị và giảm chi phí điều trị cho con người,…


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose
1.1. Cellulose vi khuẩn và tính chất của CVK
1.1.1. Cellulose vi khuẩn
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với
nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp
nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5nm [6, 23]. Đây là những
thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng
tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi,
những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 34nm, và chiều dài 130-177nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của
cellulose vi khuẩn có chiều dài từ 1-9µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày dặc,
được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al.,
2001) [7, 23].
1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn
Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định
được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X
giúp xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn.
Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ
hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001).

Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi
hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ. Trong vi sợi cellulose
đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii,
1993). Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu được từ cellulose thực vật
thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn
này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều
tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến


hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào
chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994). Ngược
lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của
một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose Iα chỉ chiếm
khoảng 20%.
Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng
trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có
rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc
tính riêng biệt của cellulose được thực hiện.
1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn
Tính chất của CVK đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả [21, 22]:
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể
mịn, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.
-

Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và

hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài
nguyên có thể phục hồi.

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có
độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao.
- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản
xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian.
Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc
dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
-

Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn

bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ
đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose.


1.1.4. Ứng dụng của CVK
Mặc dù bản chất hoá học của CVK tương tự cellulose thực vật nhưng
nhờ sản xuất dễ dàng, đặc tính cơ học cao, tính ổn định dưới hoá chất và nhiệt
độ cao. Ngoài ra còn nhiều điểm ưu việt như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền
đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và
hút nước cao và một số điểm khác. Với những điểm ưu việt này, CVK còn
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Trong công nghiệp giấy
màu CVK được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao, trong công
nghiệp môi trường đã sử dụng màng CVK làm màng phân tách để xử lý nước
và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998), dùng làm
chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm
các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định
protein.
CVK hiện được mong đợi là vật liệu hoá sinh mới với những ứng dụng
thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển hàng loạt [6, 7, 11, 12, 15, 19,

22, 24, 27, 32, 20] được thể hiện cụ thể trong bảng 1.1.


Bảng 1.1. Ứng dụng của CVK
Lĩnh vực ứng dụng

Sản phẩm
Tráng miệng (thạch dừa)
Ăn kiêng (kem, salad)

Thực phẩm

Thịt nhân tạo
Vỏ bao xúc xích
Nước uống siro không có cholesterol
Thuốc rượu Kombucha hay trà Manchurian
Màng trị thương, màng trị bỏng

Y dược

Tác nhân vận chuyển thuốc
Da nhân tạo
Chất làm co mạch
Màng nhân tạo

Mỹ phẩm

Chất làm dày và tăng cứng cho thuốc đánh
bóng móng tay
Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Môi trường

Hấp thu chất độc
Quần áo, giày dép tự phân hủy

Dầu mỏ
Trang phục
Thể thao

Thu hồi dầu
Sản xuất sợi nhân tạo
Y phục quân đội
Lều lắp ráp
Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

7


1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose
Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng

A. xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp
cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của
cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau.
1.2.1. Phân loại A. xylinum
A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này
bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter,
Gluconobacter và Kozakia. Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các
tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào
giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus.
A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước
quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ
(Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa
(Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928).
1.2.2. Đặc điểm hình thái của A. xylinum
-

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay

không di động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng
riêng rẽ hay xếp thành chuỗi.
-

Nếu A. xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng

biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài,
phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm
giảm hoạt tính một cách đáng kể.
- Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần
giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa
mép khuẩn lạc nhẵn.

8


1.2.3. Đặc điểm sinh lý của A. xylinum
- Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.
- Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.
- Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer.
- Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.
- Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.
- Không sinh sắc tố nâu.
- Tổng hợp cellulose.
1.2.4. Vai trò của CVK đối với A. xylinum
Màng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự
phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên.
- Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn
[21].
-

Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới

được bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào
gần ranh giới lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose [33].
- Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ
chất và bảo vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.
-

Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống

chịu với những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi

sinh vật gây bệnh,…) trong môi trường sống tăng lên.
- Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn
acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiểu
tia UV [21].
1.2.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [26].

9


A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, manitol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, glactose, lactose, sucrose cho
hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate.
Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong môi
trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [26].
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị
sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ
đường, nước dừa già, nước mía,... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A.
xylinum. Trong đó, nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong
nuôi cấy A. xylinum. Thành phần môi trường của nước dừa già [7] được trình
bày ở bảng 1.2 dưới đây:
Bảng 1.2. Thành phần của nước dừa già.
Nước (%)

94.99

Đồng (mg/100g)

0.04

Protein (%)

0.72

Mangan (mg/100g)

0.142

Chất béo toàn phần (%)

0.2

Selen (µg/100g)

1

Cacbohydrat (%)

3.17

Vitamin C (mg/100g)

2.4

Đường (%)

2.16

Vitamin B1 (mg/100g)

0.03

Canxi (mg/100g)

24

Vitamin B2 (mg/100g)

0.057

Sắt (mg/100g)

0.29

Vitamin B3 (mg/100g)

0.08

Magie (mg/100g)

25

Vitamin B5 (mg/100g)

0.043

Photpho (mg/100g)

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0.032

Kali (mg/100g)

250

Vitamin B9 (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0.1

10


Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa chứa nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng như
1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Vì vậy, A.

xylinum thích hợp phát triển trong môi trường này [6].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [7], [13].
2. Giới thiệu về thuốc berberin
Berberin là hoạt chất được chiết từ cây Hoàng đằng (còn có tên vàng
đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teet. Là loại cây dây leo thân gỗ có
phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi. Trong Hoàng đằng có nhiều alcaloid dẫn
xuất của izoquinolein, chủ yếu là berberin tỷ lệ từ 1.5 đến 2-3%. Berberin
chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần [8].
Tên chung quốc tế: Berberin.
Loại thuốc: Kháng khuẩn, chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký sinh trùng
đường ruột.
2.1. Công thức
Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lượng phân tử: 371.82 [29]
Công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của berberin

11


Tên khoa học: 5,6 - dihydro - 8,9 - dimethoxyl - 1,3 - dioxa - 6aazoniaindeno (5,6 - a) anthracen clorid dihydrat.
2.2. Tính chất


Lý tính: tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng.
º

Độ chảy khi ở dạng base là 140 C (bị phân hủy). Độ tan dạng base tan chậm
trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan ở
tỷ lệ 1/400 trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không
tan trong clorofrom và ether. Dạng muối sulfat dễ tan trong nước ở tỉ lệ 1/30,
tan trong ethanol [30].


Hoá tính: berberin có tính chất như một base bậc 4, tạo muối bằng cách

thay thế nhóm-OH, việc tạo muối của berberin không giống như các alcaloid
khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại.
2.3. Tác dụng dược lý
Berberin có tác dụng kháng vi trùng như: vi khuẩn (shigella, tụ cầu và
liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng
gây bệnh ( kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [29].
Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E. coli, đặc biệt khi dùng sẽ
không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột,
khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây
ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đường ruột.
Berberin có tác dụng bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm
cholesterol và trygycerid, chống tiểu đường, ức chế cơn nhịp nhanh thất, giảm
viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm
tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin
[19].
2.4. Tương tác thuốc
Vitamin B6 và Nicotinamid có thể làm mất tác dụng kháng khuẩn của
berberin.

12

2.5. Chỉ định
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật
và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt [15].
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,
gió, lạnh, bụi, khói,...) và điều trị bệnh đau mắt hột [29].
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
2.6. Chống chỉ định
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin.
- Người dị ứng với berberin (rất hiếm gặp).
3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
3.1. Tình hình nghiên cứu thuốc
3.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming
Zhang và Guang [28] nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome
cho việc phân phối uống berberine. Kết quả cho thấy chitosan bọc nanoliposome là hiệu quả hơn so với những người không tráng cho việc cung cấp
bằng miệng của berberin. Ngoài ra, Chu L, Yang Y, Wang X, và cộng sự [34]
đã có công trình nghiên cứu về berberine kích thích vận chuyển glucose thông
qua một cơ chế khác biệt với insulin. Và nhiều nghiên cứu khác.
3.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về berberin như:
Nguyễn Thị Thùy, Vũ Bình Dương, Nguyễn Trang Điệp, Hoàng Văn Lương
[16] đã có công trình nghiên cứu bào chế viên nén berberin giải phóng tại
đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại tràng.
Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm [17] đã có nghiên cứu góp phần
nghiên cứu cải tiến quy trình chiết suất berberin từ cây vàng đắng.
Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn
Văn Thuận, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyến Tuấn Quang [5] (2015) đã nghiên cứu

13

định lượng berberin chlorid trong viên nén đại tràng 105 bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
3.2. Tình hình nghiên cứu màng CVK
3.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989)
dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989)
và cộng sự [23], dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra
các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) [22], đã dùng CVK làm vải đặc
biệt, để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho
sắc kí.
Đặc biệt tác giả Wan (Canada) [22 ] đã được đăng kí bản quyền về làm
màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czafa và cộng sự (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ
dưỡng da cho phụ nữ.
3.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng
các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng,… Từ năm 2000
nhóm nghiên cứu các tác giả Nguyễn Văn Thanh [7] và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng CVK thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh
học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [7].
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [14] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn

14


Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nước tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin
của màng CVK lên men từ nước dừa già.
Nguyên liệu: nước dừa già (không dùng nước dừa để lâu quá 3 giờ sau
khi đập trái để tránh nhiễm khuẩn).
Hóa chất đặc biệt: pepton của hãng DIFCO.
Các hóa chất thông thường có nguồn gốc của Trung Quốc và Việt Nam:
berberin (độ tnh khiết 98%), cồn 96º, đường glucose, (NH4)2SO4, acid axetic,
(NH4)2HPO4, NaOH, HCl, nước cất.
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí
nghiệm.
2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum trong môi trường nước dừa già.
- Cho màng CVK hấp thụ thuốc berberin.
3. Các thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Nồi hấp Tommy (Nhật), buồng cấy vô trùng (Haraeus), máy ép màng,
tủ ấm, tủ sấy Blinder (Đức), máy lắc TEIO TRCH (Hàn Quốc), máy rung siêu
âm, máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV - vis 2450 (Nhật), khuấy từ gia

nhiệt (IKA-Đức), tủ lạnh Electrolux, ...
Thiết bị phân tch: cân phân tch, cân kĩ thuật (Precisa XT 320M). Hộp
nhựa có kích thước 15 x 10 x 4cm, hộp lồng, cốc đong 500ml1000ml, ống nghiệm, bình định mức, bình tam giác, pipet các loại từ 1-50ml,
bình xịt cồn, kéo, giấy bạc và một số dụng cụ khác.
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp tạo màng CVK
Tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già được trình bày trong
bảng 2.1.
16


Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Thành phần

Khối lượng

Glucose

30g

Pepton

10g

(NH4)2HPO4

0.3g

(NH4)2SO4

0.5g

Acid acetic

2%

Nước dừa già

1000ml

Dịch giống A.xylium

10%

Pha môi trường với tỉ lệ như trong bảng 2.1, hấp khử trùng ở 113ºC
trong 15 phút sau đó khử trùng bằng ta UV trong 30 phút để nguội
môi trường rồi bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetc, nuôi cấy tĩnh
trong 6 ngày ở 26ºC thu được sản phẩm màng CVK thô [14]. Cụ thể quá trình
tạo màng CVK với nguyên liệu nước dừa già được thực hiện theo sơ đồ 2.1.

17