Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

======

NGUYỄN THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC
BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Người hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn trân thành và sâu sắc tới cô:
TS. Nguyễn Thị Bích Ngọc, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người đã hướng
dẫn, giúp đỡ tôi tận tình trong suốt thời gian làm khóa luận vừa qua.
Tôi cũng xin trân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo của Viện NCKH
và Ứng dụng và Bộ môn Sinh lý người và động vật và các chị học viên cao học
đã cho tôi nhiều lời khuyên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
làm thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán bộ
nhân viên Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 - những người đã dạy bảo và giúp
đỡ tôi trong suốt 4 năm học tại đây.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người thân,

bạn bè, những người luôn bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi những lúc gặp
nhiều khó khăn nhất.
Do bước đầu mới làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót
xảy ra. Tôi rất mong được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận được hoàn
chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2017.
SINH VIÊN
Nguyễn Thị Lan Anh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn nghiên cứu này là của riêng
tôi, các số liệu, kết quả trong khóa luận đều được thu thập từ thực nghiệm, qua
xử lý thống kê, không trùng lặp với bất kì công trình nghiên cứu nào khác.
Những kết quả, số liệu trong khóa luận đều được tôi thực hiện tại Viện
NCKH và Ứng dụng của Trường Đại Học Sư phạm Hà Nội 2.
Hà Nội, ngày 25 tháng 4 năm 2017.
SINH VIÊN Nguyễn
Thị Lan Anh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1
1. Lí do chọn đề tài................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu.......................................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...................................................................... 3
3.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 3
3.2. Phạm vi nghiên cứu...................................................................................... 3

4. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 3
5. Ý nghĩa của đề tài............................................................................................... 3
5.1. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 3
5.2. Ý nghĩa thực tiễn.......................................................................................... 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (CVK) .............................................................. 5
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK ........................................................................ 5
1.1.2. Nguyên liệu để nuôi A. xylinum nhằm thu màng CVK .......................... 6
1.1.3. Môi trường nghiên cứu tạo màng CVK từ nước vo gạo........................... 6
1.1.4. Đặc điểm và ứng dụng của CVK .............................................................. 7
1.1.4.1. Cấu trúc của CVK........................................................................... 7
1.1.4.2. Đặc tính của CVK........................................................................... 7
1.1.4.3. Ứng dụng của CVK ........................................................................ 8
1.2. Giới thiệu về thuốc berberin ........................................................................... 9
1.2.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo................................................................... 9
1.2.2. Tính chất .................................................................................................10
1.2.3. Tác dụng của thuốc .................................................................................10
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của berberin ................................................11
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước...................................................11


1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..........................................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..........................................................12
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................14
2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................14
2.1.1. Giống vi khuẩn........................................................................................14
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất..........................................................................14
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................14
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo........14

2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ........................15
2.2.3.Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ..............................17
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn.......................................................17
2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ qua màng CVK ........19
2.2.6. Phương pháp xử lý thống kê ...................................................................20
2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu .....................................................................20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................21
3.1. Thu màng CVK .............................................................................................21
3.1.1. Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ........21
3.1.2. Thu màng CVK thô sau khi nuôi cấy .....................................................22
3.1.3.Tinh chế màng CVK ................................................................................23
3.1.4. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ...................................................26
3.2. Màng CVK hấp thụ thuốc berberin...............................................................28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................33


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
A. xylinum

Tên đầy đủ
Acetobacter xylinum

CVK

Cellulose vi khuẩn

C

Nồng độ

E. coli

Escherichia coli

h

Giờ

OD

Optical Density

PC

Plant cellulose


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Ứng dụng của CVK ............................................................................... 8
Bảng 2.1: Môi trường tạo màng CVK .................................................................15
Bảng 2.2: Nồng độ berberin và giá trị OD (n = 3)..............................................18
Bảng 3.1: Giá trị trung bình OD của dung dịch berberin 10% khi ngâm màng
CVK (n=3)............................................................................................................29
Bảng 3.2: Lượng thuốc hấp thụ berberin qua màng CVK (n=3) .........................30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của berberin ............................................................. 9
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK.............................................16
Hình 2.2: Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn berberin .............................................18
Hình 3.1: Màng CVK khi nuôi cấy tĩnh sau 4 ngày............................................. 21
Hình 3.2: Màng CVK ở các độ dày khác nhau .................................................... 23
Hình 3.3: Màng CVK thô.....................................................................................24
Hình 3.4: Màng CVK thô ngâm trong NaOH 3% ...............................................24
Hình 3.5: Màng CVK ngâm trong HCl 3% .........................................................25
Hình 3.6: Màng CVK ngâm trong nước cất hai lần trong 48h ............................25
Hình 3.7: Màng CVK sau khi tinh chế................................................................. 26
Hình 3.8: Kết quả thử sự hiện diện của đường glucose .......................................27
Hình 3.9: Màng CVK hấp thụ dung dịch thuốc berberin 10% ............................ 28


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Berberin thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi
Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis. Berberin có nhiều trong thân và
rễ cây vàng đắng với tỉ lệ 1.5 - 3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid
toàn phần.Tác dụng chính của berberin là chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng
đường ruột gây hại cho cơ thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh
vật có lợi của đường tiêu hóa.
Berberin còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau
mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do đau mắt hột gây nên.
Berberin còn có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm, chống
lại tác hại của vi khuẩn tả, E. coli. Khi dùng kết hợp với kháng sinh thì berberin
còn có khả năng hạn chế lại tác dụng không mong muốn của các loại kháng sinh
là diệt hệ vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa .

Tuy nhiên, berberin có sinh khả dụng thấp, trong quá trình sử dụng có thể
bị các tác nhân khác gây ảnh hưởng làm giảm hiệu quả hấp thụ và khả năng hòa
tan nước kém của berberin là một nhược điểm đã hạn chế sự phát triển và ứng
dụng của berberin. Cụ thể đó là làm chậm khả năng hấp thụ của thuốc khi đưa
vào điều trị bệnh. Do đó, cần thiết để thiết kế một loại màng giúp thuốc hấp thụ
một cách nhanh chóng có thể tăng khả năng điều trị bệnh của berberin [11].
Màng CVK được hình thành bởi một số vi khuẩn trong tự nhiên. Khi nuôi
cấy những vi khuẩn này trong môi trường chứa glucose, glycerol hoặc một số
nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề mặt một
lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng sinh học CVK [10].

1


Cellulose vi khuẩn (CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn, được tạo
thành từ Acetobacter xylinum. CVK có cấu trúc hóa học và đặc tính rất giống của
cellulose thực vật ( gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β –
1,4 glucorit), nhưng cellulose vi khuẩn có một số tính chất hóa lý đặc biệt khác
với cellulose thực vật như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường
kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm
ban đầu, .... Có tính chất hóa lý đặc biệt như vậy là do cellulose vi khuẩn không
chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến.Vì
vậy, CVK được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: công nghiệp giấy, thực
phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp dệt, y học,… đáng chú ý nhất trong sự kiểm soát
các hệ thống vận chuyển thuốc như: Almeida, IF., et al. [14] đã sử dụng màng
CVK như hệ thống phân phối thuốc. Hay Amin et al. [15] đã báo cáo việc sử
dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kỹ thuật
phun phủ. Kết quả cho thấy màng CVK giúp cho thuốc được giải phóng một
cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Gần đây hơn, Huang et al.
[21] nghiên cứu việc sử dụng màng CVK cho việc kiểm soát in vitro của

berberine. Ngoài ra, màng CVK còn được dùng làm chất màng đặc biệt cho các
sợi pin và tế bào năng lượng (Brown,1989), làm các sợi truyền quang, là môi
trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí. Trong
lĩnh vực mỹ phẩm màng CVK được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK đã được quan tâm
và đã đạt được những thành tựu nhất định. Trường Đại học Y dược TP. Hồ Chí
Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng CVK làm màng trị bỏng thử nghiệm trên
thỏ. Kết quả cho thấy màng CVK giúp vết thương mau lành và ngăn không cho


vết thương nhiễm trùng [10]. Ngoài ra, sản phẩm CVK còn được ứng dụng trong
phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [16].
Nhờ những đặc tính độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thụ
thuốc có kiểm soát, tăng khả dụng sinh học của thuốc berberin trong điều trị
bệnh, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc
berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
 Tạo được màng CVK từ chủng A. xylinum.
 Tạo hệ thống CVK được lên men từ nước vo gạo.
 Tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc của màng để tìm ra trường hợp hấp thụ
thuốc nhiều nhất nhằm tăng sinh khả dụng, hiệu quả của thuốc.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Khả năng hấp thụ thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi
trường nước vo gạo.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.
4. Nội dung nghiên cứu

 Tạo hệ thống màng CVK được lên men từ nước vo gạo.

 Chế tạo màng CVK dùng để hấp thụ thuốc.
 Khảo sát, đánh giá khả năng hấp thụ thuốc berberin qua hệ thống màng CVK.
5. Ý nghĩa của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
 Tìm hiểu khả năng hấp thụ để có những hiểu biết về tiềm năng hấp thụ của
màng CVK với thuốc.


 Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng CVK.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
 Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum.
 Khảo sát được lượng thuốc berberin hấp thụ qua màng CVK. Chọn ra được
trường hợp hấp thụ tốt nhất để cải thiện nhược điểm của thuốc.
 Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn (CVK)
Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần
chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của vi
sinh vật. CVK là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ [7].
1.1.1. Vi khuẩn sản sinh ra CVK
CVK là sản phẩm của một số loại vi khuẩn, đặc biệt là chủng Acetobacter
xylinum (A. xylinum). A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter,
họ Pseudomonadaceae. Là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và sản xuất
cellulose ngoại bào [7].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc [7]:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae

Họ: Pseudomonadaceae
A. xylinum có hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng 0.6
– 0.8μm, dài khoảng 2 - 3μm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di
động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều
kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to
ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [7].
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 - 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 - 5mm, tròn, nhày, rìa mép
trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe
sữa rồi khô dần [15].


A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát
triển từ 25 – 30oC. Ở nhiệt độ 37oC tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ
thích hợp nhất là 25oC. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối ưu
để sản xuất cellulose là 5.5 [18].
1.1.2. Nguyên liệu để nuôi A. xylinum nhằm thu màng CVK
A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho
hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất
thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [3,7].
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48 giờ
lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 12 ngày [18].
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố
tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [7]. Trong đó, nước vo gạo được xem là môi
trường thích hợp trong nuôi cấy A. xylinum.
1.1.3. Môi trường nghiên cứu tạo màng CVK từ nước vo gạo
Người ta phát hiện ra rằng trong nước vo gạo có hơn 12 loại vitamin và

khoáng chất, bao gồm: chất chống oxi hóa, anthocyannins, các vitamin nhóm B,
chất diệp lục, sắt, lignans, mangan (chất mãnh), magnesium (Ma Nhê), Kali,
Selen, vitamin E, kẽm.
Nước vo gạo sau khi đun sôi lên có thể uống giúp tái tạo năng lượng cho
cơ thể do có nhiều carbohydrates (tinh bột). Ngoài ra, nước vo gạo còn được sử
dụng để hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày, cao máu, phòng bệnh Alzheimer, giảm
thân nhiệt cơ thể, và rất tốt cho hệ tiêu hóa.


Cùng với nước vo gạo, chúng tôi bổ sung thêm chất dinh dưỡng (glucose,
kalihydrophotphat, điamoni sunfat, pepton) với lượng thích hợp tạo môi trường
tối ưu để lên men tạo màng CVK [10].
1.1.4. Đặc điểm và ứng dụng của CVK
1.1.4.1. Cấu trúc của CVK
CVK cấu tạo bởi những chuỗi polyme β - 1,4 - glucopyranose không phân
nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống
cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [7]. Theo
AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose,
đường kính 1.5nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với nhau thành bó,
nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm.
1.1.4.2. Đặc tính của CVK
Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng
lượng nhẹ, độ bền đáng kể.
Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: Khả năng giữ nước đáng kể,
lực ẩm cao. Màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút
60 - 700 lần trọng nước của nó.
Màng cellulose được định hướng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng

hình thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và White
(1989) [25] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng cách
sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống không khí


bên trong môi trường lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung
quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn.
Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có thể
làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi trường
nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá trình tổng
hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen liên
quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng cellulose,
kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose.
1.1.4.3. Ứng dụng của CVK
CVK được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: dược phẩm, mĩ
phẩm, công nghiệp,…được trình bày theo bảng 1.1.
Bảng 1.1: Ứng dụng của CVK
Lĩnh vực

Ứng dụng
Tráng miệng (thạch dừa)

Thực phẩm

Ăn kiêng (kem, salad)
Thịt nhân tạo, vỏ bao xúc xích
Tạo rột giả, lớp màng trị bỏng, da nhân tạo,

Y dược

mạch máu nhân tạo.
Phẫu thuật ghép mô, cơ quan

Mỹ phẩm
Môi trường

Móng nhân tạo
Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn
Hấp thu chất độc


Dầu mỏ

Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn, thu hồi dầu
Sản xuất sợi nhân tạo, quần áo, giày dép tự phân

Trang phục

hủy
Y phục quân đội

Thể thao

Lều lắp ráp
Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ

Sản phẩm rừng

Thùng hàng có độ bền cao
Gỗ nhân tạo

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc
Tã lót có thể tái chế

1.2. Giới thiệu về thuốc berberin
1.2.1. Cấu trúc và công thức cấu tạo
Berberin là một nhóm alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung
là protoberberin [1]. Isoquinolin còn được gọi là penzo pyridin hay 2 - benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic [24], được thể hiện ở hình 1.1.

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của berberin


 Tên hóa học: 5,6 – dihydro - 9 ,10 - dimethoxybenzo [g] - 1,3 - benzodioxolo
[5,6 - a] quinolizinium (1 +), 9CI; clorua.
 Công thức phân tử:

C20H18NO4Cl.2H2O.

 Trọng lượng phân tử: 371.82 [22].
1.2.2. Tính chất
Tính chất vật lý: bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Độ tan
dạng base tan chậm trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng
muối clorid dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong
cloroform và ether. Dạng muối Sulfat dễ tan trong nước, tan trong ethanol [2].
Tính chất hóa học:

Tính chất hóa học của N: Berberin có tính chất như một base yếu, tạo
muối bằng cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống như các
alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có
loại phân tử nước [2].
Tính chất hóa học của oxy: Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm
mạnh, nó không vững bền trong môi trường kiềm mạnh, dễ hỗ biến mở vòng cho
chức andehyd gọi là berberial [2].
Tính chất hóa học mạnh kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa
để cho các hydro alkaloid không màu [2].
1.2.3. Tác dụng của thuốc
Berberin có tác dụng kháng khuẩn với Shigella, liên cầu khuẩn, tụ cầu
khuẩn. Những năm gần đây, một số nghiên cứu ở nước ngoài đã xác định
berberin có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn gram dương (nhuộm theo
phương pháp gram, nó bắt màu tím), gram âm (có màu đỏ), và các vi khuẩn
kháng acid. Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh và


một số động vật nguyên sinh.
Berberin điều trị các nhiễm khuẩn đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự
phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu cũng chứng
minh: khi dùng một số kháng sinh đường ruột, nếu phối hợp với berberin sẽ hạn
chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật
đường ruột.
Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ,
giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đường, giảm viêm cho người bị viêm
khớp.
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định của berberin
Chỉ định: nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ trực trùng, hội chứng lỵ,
viêm ống mật, đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết mạc, các trường
hợp ngứa mắt do dị ứng.

Chống chỉ định: Phụ nữ mang thai và cho con bú. Các nhà nghiên cứu cho
rằng berberin có thể đi qua nhau thai và có thể gây hại cho thai nhi. Vàng da
nhân (kernicterus), một loại tổn thương não, đã phát triển ở trẻ sơ sinh tiếp xúc
với berberin. Không uống berberin nếu bạn đang cho con bú. Berberin có thể đi
vào cơ thể trẻ sơ sinh qua sữa mẹ, và có thể gây ra hại cho trẻ sơ sinh.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
 Màng CVK:
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown [16], 1989, dùng
màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989) và cộng sự


[16], dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền
quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực
phẩm. Đặc biệt Brown (1989) [16], đã dùng CVK làm vải đặc biệt, để sản xuất
giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí.
Harmlyn và cộng sự (1997) [24], Cienchanska (2004) [16], Legara và
cộng sự (2004) [20], Wan và Millonn(2005), Czaja và cộng sự (2006) [17] sử
dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt.
Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí bản quyền về làm màng CVK từ
A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czafa [17] và cộng
sự (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ
nữ.
 Thuốc berberin:
Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc berberin trên thế giới như:
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của berberin trong
điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [19]. Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill
Walter, ND đã nghiên cứu về berberin trong bệnh tiểu đường [23]. Jianping Ye,

Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của berberin trong điều trị bệnh
tiểu đường [20].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
 Màng CVK:
Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố
Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng CVK từ A. xylinum phối hợp
với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực nghiệm cho kết quả
tốt [10].


Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [10] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế
và thu màng CVK từ A. xylinum đạt hiệu cao.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [4] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả cho
thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, dai, độ
bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị
bỏng.
 Thuốc berberin:
Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [12].
Hồ Đắc Trinh - Chiết berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch acid
sufucric loãng [6].
Trần Công Khánh - Góp phần nghiên cứu phương pháp sản xuất berberin
từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [13].
Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử
dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ.
Nguyễn Liêm - Chiết xuất berberin bằng áp lực nóng [8].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
 Nguyên liệu: nước vo gạo ( theo tỷ lệ 1 gạo: 2 nước)
 Hóa chất: các hóa chất đặc biệt (peton) và các hóa chất thông thường như:
đường glucose, pepton, acid acetic, kali hydrophotphat, diamoni sunfat,
NaOH, HCl đđ, nước cất và một số hóa chất khác.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
 Nồi hấp Tommy (Nhật), tủ ấm, tủ sấy Blinder (Đức), máy lắc TEIO TRCH
(Hàn Quốc), máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV - vis 2450 (Nhật), tủ lạnh
Electrolux.
 Buồng cấy vô trùng (Haraeus), máy khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức)
 Thiết bị phân tích: cân phân tích (Sartorius – Đức), cân kỹ thuật (Precisa XT
320M – Thụy Sỹ).
 Hộp nhựa, hộp lồng, ống nghiệm, bình định mức, bình tam giác, pipet các
loại từ 1 – 50ml.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo
Nguyên liệu nước vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó thêm
các chất dinh dưỡng cần thiết tạo màng. Hấp tiệt trùng ở 113⁰C, trong 15 phút.
Để nguội rồi bổ sung 10% dịch giống và 5% acid acetic, được thể hiện ở bảng
2.1.


Bảng 2.1: Môi trường tạo màng CVK
STT

Hóa chất

Khối lượng

1.

Glucose

20g

2.

Kali hydrophotphat

2g

3.

Điamoni sunfat

3g

4.

Pepton

5g

5.

Nước vo gạo

6.

Acid acetic

7.

10% dịch giống A. xylinum

1000ml
5ml

Quá trình lên men tạo màng CVK sử dụng quy trình lên men tĩnh: môi
trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các bình lên men có bề
mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các bình được đậy bằng vải xô có độ
xốp giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài
nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình
lên men 28 - 30oC. Sợi cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và
không khí. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên
trên. Sau 7 - 12 ngày có thể thu CVK thô [7].
2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu được chưa một lượng lớn môi trường lên men và
các sản phẩm của quá trình trao đổi chất acid acetic. Vì vậy, trước khi hấp thụ
thuốc cần phải xử lý màng, theo sơ đồ hình 2.1.


Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%

48h, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48h, rửa và ép
Ngâm trong nước
48h, kiểm tra tạp chất
CVK tnh chế

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK
Tách CVK: Trong nuôi cấy tnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
Ngâm NaOH: Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm
màng trong một NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội
độc tố của vi khuẩn.


Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi ép màng.
Sau đó, ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với rửa nước rồi ép màng. Ngâm nước
đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48 giờ ta thu được CVK tinh khiết.
2.2.3.Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK


Mục đích: đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại được các tạp chất có thể
gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đường glucose trong màng CVK.

 Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của
đường D – glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu
đỏ.
 Tiến hành:
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.

+ Mẫu đối chứng: là nước cất và dung dịch D – glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử
Fehling. Đun dưới ngọn lửa đèn cồn 10 – 15phút.
+ Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.2.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Nguyên tắc: Dựa vào mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu):
Pha thuốc berberin ở các nồng độ là 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch chuẩn đã pha ở bước sóng 345nm [20].
Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần và
đo quang phổ 3 lần lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.