Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN HỮU THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG
NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. CAO BÁ CƢỜNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Cao Bá Cƣờng,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo,
động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn
thành khóa luận.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán
bộ nhân viên Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 - những ngƣời đã dạy bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tại đây. Đặc biệt là gia đình và bạn bè đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ
trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất,

nhƣng do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng nhƣ
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu
sót, tôi rất mong nhận đƣợc sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn
chỉnh hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2017.
Sinh viên

Nguyễn Hữu Thị Quỳnh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định kết quả khóa luận “Khả năng giải phóng thuốc
berberin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo” là
kết quả nghiên cứu của cá nhân dƣới sự hƣớng dẫn trực tiếp của ThS. Cao Bá
Cƣờng, giảng viên khoa Sinh - KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Đề
tài này chƣa từng công bố ở đâu và hoàn toàn không trùng với công trình
nghiên cứu của các tác giả khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2017.
Sinh viên

Nguyễn Hữu Thị Quỳnh


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Tên tiếng việt

Tên tiếng anh

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

CVK

Cellulose vi khuẩn

Bacterial Cellulose

CVK - Berberin

Màng Cellulose vi khuẩn đã
hấp thụ thuốc berberin

cs

Cộng sự

C

Nồng độ

E. coli

Escherichia coli

OD

Mật độ quang phổ

rpm

Tốc độ quay 100 vòng/phút

Optical Density


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 2
3. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu ........................ 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK) ................................................................. 4
1.1.2. Thuốc berberin .................................................................................. 5
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................ 8
1.2.1. Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn ............................... 8
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc berberin ......................................... 10
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 11
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 11
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 11
2.3. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11

2.3.1. Giống vi khuẩn ................................................................................ 11
2.3.2. Nguyên liệu - hóa chất .................................................................... 11
2.3.3. Thiết bị ............................................................................................ 11
2.3.4. Dụng cụ ........................................................................................... 12
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 12
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo 12
2.4.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ................ 14
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ..................... 15
2.4.4. Phương pháp xác định đường chuẩn .............................................. 15


2.4.5. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành ........................ 17
2.4.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK 17
2.4.7. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphate buffered
saline) ........................................................................................................ 18
2.4.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế .............................................................................................. 18
2.4.9. Phương pháp đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng
CVK ........................................................................................................... 19
2.4.10. Phương pháp xử lí thống kê .......................................................... 20
2.5. Cách bố trí thí nghiệm........................................................................... 20
2.6. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 20
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 21
3.1. Thu màng CVK ..................................................................................... 21
3.1.1. Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 21
3.1.2. Tinh chế màng CVK ........................................................................ 22
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ................................................. 22
3.3. Màng CVK hấp thụ thuốc berberin....................................................... 23
3.4. Xác định lƣợng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trƣờng pH
khác nhau ..................................................................................................... 25

3.5. Phân tích động dƣợc học giải phóng của berberin................................ 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 34


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum ......................................................... 12
Bảng 2.2. Kết quả đo đƣờng chuẩn của thuốc berberin ở bƣớc sóng 345nm
(n = 3) .................................................................................................. 16
Bảng 2.3. Môi trƣờng đệm PBS với pH tƣơng ứng là 2, 12 ............................... 18
Bảng 3.1. Khối lƣợng và tỉ lệ thuốc berberin hấp thụ vào màng CVK (n = 3) ........ 24
Bảng 3.2. Giá trị OD345nm trung bình của berberin giải phóng từ màng CVK
qua các thời điểm khác nhau (n = 3) ................................................... 26
Bảng 3.3. Tỉ lệ giải phóng thuốc berberin từ màng CVK – Berberin trong các
độ dày, thời gian và môi trƣờng pH khác nhau (n = 3) ....................... 28
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng quan

, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải

phóng (n) đối với các môi trƣờng pH khác nhau (n = 3) .................... 31


DANH MỤC HÌNH
Sơ đồ 2.1. Quy trình tạo màng CVK thô........................................................... 13
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tinh chế màng CVK ............................................................... 14
Hình 2.3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của berberin (n = 3) ............................... 16
Hình 3.1. Màng CVK đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cao nấm men ............. 21
Hình 3.2. Màng CVK tinh chế .......................................................................... 22
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK................................. 23
Hình 3.4. Màng CVK hấp thụ thuốc berberin 10% .......................................... 24

Hình 3.5. Màng CVK ngâm trong dung dịch đệm............................................ 25
Hình 3.6. Mẫu dung dịch đệm thu đƣợc sau các giờ khác nhau ....................... 25
Hình 3.7. Khả năng giải phóng thuốc berberin của màng CVK - Berberin
trong các độ dày, thời gian và môi trƣờng pH khác nhau ................. 27
Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 2 ........................................................ 29
Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 12 ...................................................... 29


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Berberin là một trong số các loại thuốc đƣờng tiêu hóa dùng qua đƣờng
uống, khó tan trong ethanol và nƣớc, không tan trong ether. Nó có tác dụng
chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đƣờng ruột gây hại cho cơ thể mà
không ảnh hƣởng tới hoạt động của các vi sinh vật có lợi của đƣờng tiêu hóa.
Berberin còn đƣợc bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau
mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trƣờng hoặc do đau mắt hột gây nên.
Berberin còn có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm,
chống lại tác hại của vi khuẩn tả, E.coli. Berberin có tác dụng phụ gây ra táo
bón, nếu dùng với liều cao berberin trên 500mg có thể gây ra đau bụng, buồn
nôn, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó thở, nhịp tim chậm, suy tim, hạ
huyết áp, co giật, tê liệt, co thắt và dẫn đến tử vong.
Tuy nhiên, berberin chủ yếu đƣợc sử dụng qua đƣờng uống và bôi qua
da với sinh khả dụng khá thấp. Do đó cần kéo dài quá trình giải phóng của
thuốc nhằm duy trì nồng độ dƣợc chất trong máu trong vùng điều trị, giảm số
lần dùng thuốc cho ngƣời bệnh, giảm tác dụng không mong muốn, nâng cao
hiệu quả điều trị của thuốc [3].
Cellulose vi khuẩn (CVK) đƣợc tạo thành từ Acetobacter xylinum có
cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhƣng có một số tính chất
hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính
sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm

ban đầu,... Vì vậy, CVK đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: thực
phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học,... đáng chú ý nhất
trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc. CVK đã đƣợc sử dụng nhƣ
trong một vài hệ thống để phân phối thuốc. Amin et al. [17] đã báo cáo việc
sử dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng kĩ
thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng CVK giúp cho thuốc đƣợc giải phóng

1


một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. Gần đây hơn, Huang
et al. [20] nghiên cứu việc sử dụng màng CVK cho việc kiểm soát in vitro của
berberin. Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc
qua màng CVK còn đƣợc thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết
quả thu đƣợc cho thấy rằng thuốc đã đƣợc giải phóng với tốc độ chậm. Ngoài
ra, màng CVK còn đƣợc dùng làm chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế
bào năng lƣợng (Brown, 1989), làm các sợi truyền quang, là môi trƣờng cơ
chất trong sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí. Trong lĩnh vực
mỹ phẩm màng CVK đƣợc sử dụng làm mặt nạ dƣỡng da. Ở Việt Nam, việc
nghiên cứu và ứng dụng màng CVK đã đƣợc quan tâm và đã đạt đƣợc những
thành tựu nhất định. Trƣờng Đại học Y Dƣợc TP. Hồ Chí Minh cũng nghiên
cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng thử nghiệm trên
thỏ. Kết quả cho thấy màng CVK giúp vết thƣơng mau lành và ngăn không
cho vết thƣơng nhiễm trùng [3]. Ngoài ra, sản phẩm CVK còn đƣợc ứng dụng
trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [4, 12].
Môi trƣờng nƣớc vo gạo có nguồn gốc từ thực vật, dễ kiếm, rẻ tiền và
có rất nhiều vi chất dinh dƣỡng, vitamin thuộc nhóm B nhƣ vitamin B1,
B5,…vitamin E và một số thành phần có lợi khác thích hợp cho vi khuẩn
Acetobacter xylinum phát triển.
Với mục đích chế tạo màng sinh học CVK để khảo sát sự giải phóng

thuốc berberin qua màng nhằm giúp thuốc đƣợc giải phóng một cách kéo dài,
đồng thời có thể giúp tăng khả dụng sinh học của thuốc berberin trong điều trị
bệnh, chúng tôi đã chọn đề tài: “Khả năng giải phóng thuốc berberin của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo hệ thống CVK đã hấp thụ thuốc đƣợc lên men từ môi trƣờng
nƣớc vo gạo.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc berberin từ hệ thống trên
nhằm tìm ra hệ thống có khả năng giải phóng thuốc kéo dài.

2


3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có những hiểu biết về tiềm
năng giải phóng của màng CVK. Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK nhằm
làm cho thuốc đƣợc giải phóng kéo dài, qua đó có thể khắc phục hạn chế của
thuốc berberin dạng thƣơng mại sẽ mở ra một hƣớng sản xuất thuốc hiệu quả,
mang lại lợi ích cho việc điều trị.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Từ màng CVK đã đƣợc tạo ra đƣợc dùng làm hệ thống giải phóng
thuốc có thể đƣa vào điều trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng, duy trì nồng
độ thuốc trong máu trong một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho ngƣời
bệnh, giảm tác dụng phụ không mong muốn, nâng cao đƣợc sinh khả dụng
của thuốc.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK)
Vi khuẩn sản sinh ra CVK: Cho đến nay, A. xylinum đƣợc đánh giá là
loài vi khuẩn có khả năng sinh màng CVK hiệu quả nhất trong tự nhiên. Loài
vi khuẩn gram âm sống hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong
những loài tiến hóa nhất của nhóm vi khuẩn tía. Mỗi tế bào A. xylinum có thể
chuyển hóa tới 108 phân tử glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả
năng tổng hợp cellulose là rất lớn [8]. A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay
hơi cong, có thể di động hoặc không và không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn
gram âm nhƣng gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do
điều kiện môi trƣờng nuôi cấy. Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. A.
xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng trƣởng ở bề
mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi trƣờng khí và có khả năng tạo
màng cellulose trên môi trƣờng nuôi cấy [8]. Trên môi trƣờng rắn sau khoảng
3 - 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A. xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi
trong nhƣng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần [8].
Trên môi trƣờng lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng đục dày,
sau 36 - 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày.
CVK là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng A.
xylinum. CVK cấu tạo bởi những chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose không
phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của CVK
giống cellulose của thực vật (plant cellulose - PC), tuy nhiên chúng khác nhau
về cấu trúc đại thể [18]. Theo AJ. Brown (1886), CVK gồm nhiều sợi siêu
nhỏ có bản chất là hemicellulose, đƣờng kính 1.5nm, kết hợp với nhau. Các

sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài
khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm [4, 18]. Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích

4


lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng thành lớp màng mỏng nhƣ da,
sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tƣơng tự nhƣ giấy da với độ
dày 0.01 - 0.5nm.
Tính chất độc đáo của màng CVK: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học
lớn, khả năng thấm hút nƣớc cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme, bề mặt tiếp
xúc lớn hơn gỗ, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt,
đặc biệt là khả năng cản khuẩn 8].... Vì vậy, CVK đƣợc ứng dụng trong rất
nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ
phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,... đặc biệt trong lĩnh vực y học [14, 23].
Trong y học, màng CVK thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy tĩnh đƣợc nghiên cứu
và sử dụng làm da nhân tạo. Ở Brazil, màng CVK ƣớt tinh sạch đƣợc sản xuất
và bán ra thị trƣờng nhƣ một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thƣơng [4]. Trƣờng
Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng
CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Kết quả
cho thấy rằng màng CVK giúp vết thƣơng mau lành và ngăn không cho vết
thƣơng nhiễm trùng [8]. Ngoài ra, sản phẩm CVK còn đƣợc ứng dụng làm
màng băng vết thƣơng, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [4].
Sinh tổng hợp CVK: cellulose đƣợc tổng hợp từ một số nhóm vi khuẩn
và đặc biệt là A. xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dƣỡng cacbon,
phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose
phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose. Ngày nay,
quá trình tổng hợp cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bƣớc liên tiếp, gồm 2
giai đoạn chính: giai đoạn polyme và giai đoạn kết tinh. Phƣơng pháp sản
xuất CVK: lên men tĩnh và lên men động.

1.1.2. Thuốc berberin
1.1.2.1. Cấu trúc
Berberin là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinol có khung proto
berberin 3. Isoquinolin còn đƣợc gọi là benzo pyridin hay 2 - benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic.

5


Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C20H18NO4Cl.2H2O
KLPT: 371.82
Tên khoa học: 5,6 dihydro - 8,9 - dimethoxy- 1,3 - dioxa - 6a - azo
niaindeno (5,6 - a) anthracen clorid dihydrat [4].
1.1.2.2. Nguồn gốc
Berberin là hoạt chất đƣợc chiết từ cây hoàng đằng (còn có tên vàng
đắng, hoàng liên, tên khoa học là Coptis teeta)…(là loại cây dây leo thân gỗ
có phân nhánh, mọc hoang ở nhiều nơi). Trong hoàng đằng có nhiều alkaloid
dẫn xuất của izoquinolein, chủ yếu là berberin tỷ lệ từ 1.5 đến 2 - 3%.
Berberin thƣờng có lẫn các tạp chất alkaloid khác nhƣ: palmatin,
jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá
5% 3, 6, 7.
1.1.2.3. Tính chất vật lý
Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy
khi ở dạng base là 145C (bị phân hủy). Độ tan dạng base tan chậm trong
nƣớc 1/500 7, hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối sulfat
dễ tan trong nƣớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol. Berberin không có C bất đối
nên không có đồng phân quang học 13, 15.

6


1.1.2.4. Tính chất hóa học
Tính chất hóa học của N: berberin có tính chất nhƣ một base yếu, tạo
muối bằng cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống nhƣ
các alkaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại,
nghĩa là có loại phân tử nƣớc 1, 6, 10, 19, 23.
Tính chất hóa học của oxy: berberin kém ổn định trong môi trƣờng
kiềm mạnh, N không bền vững, trong môi trƣờng kiềm mạnh dễ biến mở
vòng, cho chức aldehyd gọi là berberin al 6, 7, 14.
Tính chất hóa học mạch kép: berberin có thể mất mạch kép tại nhân
giữa để cho các hydro alkaloid không màu 6, 7, 19.
1.1.2.5. Tác dụng dược lí và ứng dụng
Các tác dụng chủ yếu của berberin là chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký
sinh trùng đƣờng ruột. Berberin còn đƣợc bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều
trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài nhƣ (gió, nắng, lạnh,
bụi, khói...) và điều trị bệnh mắt hột. Ngoài ra berberin cũng có thể giúp ngăn
ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm và còn có tác dụng chống lại tác hại của vi
khuẩn tả và E. coli ngoại độc tố bền với nhiệt. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra
tác dụng chống ung thƣ của berberin, nó có thể ngăn chặn sự phát triển của
nhiều loại tế bào ung thƣ, bao gồm ung thƣ vú, ung thƣ biểu mô, ung thƣ tụy,
ung thƣ dạ dày mà không làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của các tế bào bình
thƣờng ở nồng độ nhất định 24.
Berberin có một ƣu thế là khi dùng điều trị các nhiễm trùng đƣờng ruột
berberin sẽ không ảnh hƣởng tới sự phát triển bình thƣờng của hệ vi khuẩn có
ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh, khi dùng một số thuốc
kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế đƣợc tác dụng không mong
muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đƣờng ruột.
Hiện nay, nhiều hãng dƣợc sản xuất berberin với tên khác nhau nhƣ:

7


berberine sulfate hoặc chlorhydrate với các biệt dƣợc là thuốc có hoạt tính
kháng sinh, chống viêm với dạng viên nén 10mg và 50mg [2].
Berberin an toàn cho hầu hết ngƣời lớn sử dụng ngắn hạn khi dùng
bằng đƣờng uống hoặc bôi lên da. Liều cao berberin trên 500mg (tƣơng ứng
với 8 - 100g rễ cây vàng đắng khô) có thể gây ra đau bụng, buồn nôn, nôn
mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó thở, nhịp tim chậm, suy tim, hạ huyết áp, co
giật, tê liệt, co thắt và dẫn đến tử vong [29].
1.1.2.6. Chỉ định và chống chỉ định
- Chỉ định: [1, 24]
+ Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chống lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật
và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
+ Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,
gió, lạnh, bụi…) và điều trị bệnh đau mắt hột.
+ Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
- Chống chỉ định: quá mẫn cảm, phụ nữ có thai. Phụ nữ mang thai và
cho con bú: không uống berberin nếu bạn đang mang thai. Các nhà nghiên
cứu cho rằng bererin có thể đi qua nhau thai và có thể gây hại cho thai nhi.
Vàng da nhân (kernicterus), một loại tổn thƣơng não, đã phát triển ở trẻ sơ
sinh tiếp xúc với berberin. Không uống berberin nếu bạn đang cho con bú.
Berberin có thể đi vào cơ thể trẻ sơ sinh qua sữa mẹ, và có thể gây ra hại cho
trẻ sơ sinh.
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.2.1. Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn
*Trên thế giới
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng
CVK trong phân phối thuốc đã đƣợc báo cáo [17], trong đó có 9 nghiên cứu

với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng CVK và 7

8


với các vật liệu nanocomposite. Nhƣ vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục đƣợc
tiến hành nghiên cứu.
Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho
quá trình xử lý nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng
cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng nhƣ là một chất
để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất
trong sinh học, thực phẩm [8]. Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska
(2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử
dụng màng đắp lên các vết thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt [8].
*Ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng
màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng
lại bƣớc đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng CVK hầu nhƣ mới
chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Năm 2006 gần đây, Nguyễn Văn Thanh và
cộng sự [8] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylinum đạt
hiệu quả cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in
vivo trong ứng dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho
thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng
CVK có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị
bỏng là ƣu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [12] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi

cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nƣớc tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.

9


1.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc berberin
*Trên thế giới
Đã có những công trình nghiên cứu về thuốc berberin trên thế giới nhƣ:
- Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của
berberin trong điều trị bệnh nhân tiểu đƣờng loại 2 [21].
- Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về
berberin trong bệnh tiểu đƣờng [26].
- Jianping Ye, Weiping Jia đã tìm hiểu về tác dụng và cơ chế của
berberin trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [22].
*Ở Việt Nam
Việc nghiên cứu thuốc berberin ở Việt Nam có một số công trình
nghiên cứu sau:
- Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những alkaloid chiết xuất từ các cây
thuốc Việt Nam [6].
- Nguyễn Liêm - chiết xuất berberin bằng áp lực nóng [9].
- Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm - góp phần nghiên cứu cải tiến quy
trình sản xuất berberin từ cây vàng đắng [9].
- Hồ Đắc Trinh - chiết berberin clorid trong vàng đắng bằng dung dịch
acid sunlfuric loãng [16].
- Trần Công Khánh - góp phần nghiên cứu phƣơng pháp sản suất
berberin từ cây vàng đắng Coscinium usitatum Pierre [5].

10

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Khả năng giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo ra màng CVK đƣợc lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Cho thuốc đƣợc hấp thu vào màng CVK.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc berberin từ hệ thống đƣợc
tạo ra từ bƣớc trên.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng đƣợc cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh khoa sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.3.2. Nguyên liệu - hóa chất
- Nguyên liệu: nƣớc vo gạo, nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng.
- Hóa chất:
+ Berberin 95%.
+ Màng CVK (99% hàm lƣợng nƣớc) đƣợc sản xuất bằng cách sử dụng
vi khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2) lên
men trong môi trƣờng dinh dƣỡng.
+ Dung môi là etanol 96% và chất phản ứng khác đƣợc cung cấp từ
Viện NCKH & ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
+ Đƣờng glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali
đihiđrophotphat, HCl, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.3.3. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.

11


- Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức).
- Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).
- Kính hiển vi quang học (Carl Zeiss - Đức).
- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu.
Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.3.4. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh,
đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp
gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định mức loại 100ml, 500ml,
1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, thƣớc kẹp panme,... và nhiều dụng
cụ hóa sinh khác.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo
- Lên men thu màng CVK từ môi trƣờng nƣớc vo gạo A. xylinum nuôi
cấy dựa vào môi trƣờng chuẩn Hestrin - Schramm đƣợc cải tiến bằng cách
thay cao nấm men bằng nƣớc vo gạo có thành phần chứa nhiều vitamin B, các
chất khoáng nhƣ sắt, đồng,... đƣợc trình bày nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum
Khối lƣợng

Thành phần
Nƣớc vo gạo

1000ml

Glucose

30g

Diamoni photphat

0.3g

Amoni sulfat

0.5g

Pepton

10g

Acid acetic

2%

Dịch giống A. xylinum

10%

12


Nguyên liệu nƣớc vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó thêm
các chất dinh dƣỡng cần thiết tạo màng. Hấp khử trùng ở 113°C trong 20 phút.
Sau đó môi trƣờng đƣợc khử trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi

trƣờng. Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic. Cuối cùng, ủ tĩnh trong
khoảng 6 - 14 ngày ở 26°C thu đƣợc màng CVK thô. Cụ thể quy trình tạo màng
CVK lên men từ nƣớc vo gạo đƣợc thực hiện theo quy trình ở sơ đồ 2.1.
Nƣớc vo gạo
(đã lọc bã, rác)

Bổ sung dinh dƣỡng
(bảng 2.1)

Hấp thanh trùng
( 113°C , 20 phút)

Để nguội

Đổ giống và acid acetic ( 10%
dịch giống và 2% acid acetic)

Ủ tĩnh 6 - 14 ngày ở 26°C

Thu CVK thô
Sơ đồ 2.1. Quy trình tạo màng CVK thô

13


2.4.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu đƣợc chứa một lƣợng lớn môi trƣờng lên men
và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất nhƣ acid acetic. Vì vậy, cần phải
xử lý màng trƣớc khi hấp thụ thuốc để loại bỏ đƣợc các tạp chất trong môi
trƣờng nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn.

Cụ thể màng CVK đƣợc tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy
trình [8] đƣợc thể hiện ở sơ đồ 2.2 dƣới đây:
Tách màng CVK thô
Ép loại nƣớc
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh chế
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tinh chế màng CVK
- Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng.
- Trong màng chứa một lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3%
để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.

14


- Ngâm HCl: Màng sau khi đƣợc ngâm bằng NaOH rửa nƣớc rồi ép
màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
- Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nƣớc rồi ép
màng. Ngâm nƣớc để trung hòa hết acid trong khoảng 48 giờ ta thu đƣợc
CVK tinh chế [14].
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
- Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại đƣợc các
tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đƣờng glucose trong
màng CVK.
- Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện

diện của đƣờng D - glucose, nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ.
- Tiến hành:
+ Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học.
+ Mẫu đối chứng: là nƣớc cất và dung dịch D - glucose.
+ Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc
thử Fehling. Đun dƣới ngọn lửa đèn cồn 10 - 15 phút.
+ Quan sát tủa xuất hiện trong ống nghiệm.
2.4.4. Phương pháp xác định đường chuẩn
Nguyên tắc: Dựa vào mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu):
Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng: cồn 96º.
Dùng cân kĩ thuật cân chính xác 0.01g berberin cho vào bình 100ml
cồn 96°, hòa tan berberin ta đƣợc C1 = 100%.
Tiếp tục pha loãng C1 ở các nồng độ C2, C3, C4, C5, C6, C7 tƣơng ứng
với nồng độ của berberin là 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%.
Dùng máy đo quang phổ UV - Vis để đo cƣờng độ quang phổ của các
dung dịch đã pha ở bƣớc sóng 345nm [1].
Tiến hành pha thuốc và đo quang phổ 3 lần rồi lấy kết quả trung bình.
Kết quả trung bình giá trị OD345nm của các nồng độ thuốc khác nhau đƣợc
thể hiện ở bảng 2.2.

15


Bảng 2.2. Kết quả đo đƣờng chuẩn của thuốc berberin ở bƣớc sóng
345nm (n=3)
Nồng

Giá trị OD 345nm (n=3)

độ

STT (mg/ml)

Giá trị trung
Lần 1

Lần 2

Lần 3

bình

1

5

0.353

0.355

0.354

0.354 ± 0.003

2

10

0.712

0.714

0.71

0.712 ± 0.002

3

20

1.523

1.522

1.532

1.526 ± 0.006

4

30

2.031

2.299

2.286

2.205 ± 0.151

5

40

2.996

3.004

3.046

3.005 ± 0.040

6

50

3.703

3.641

3.504

3.616 ± 0.102

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn berberin bằng phần mềm
Excel 2007, kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.3.
OD345nm
y = 0.0734x + 0.0074
R² = 0.9986

Mật độ quang OD345nm

4
3.5

3
2.5
2

OD 345nm

1.5

Linear (OD 345nm )

1
0.5
0
0

20

40

60

Nồng độ thuốc berberin (mg/ml)

Hình 2.3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của berberin (n = 3)

16

Phƣơng trình dƣờng chuẩn:
y = 0.0734x + 0.0074 (R2=0.9986)

(1)

Trong đó:
x : Nồng độ berberin (mg/ml).
y : Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x.
R2: Hệ số tƣơng quan.
2.4.5. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành
CVK sau khi đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng, xử lý qua công đoạn hóa
học thu đƣợc CVK tinh chế. CVK tinh chế đƣợc ép áp lực, thu đƣợc khối
lƣợng CVK tạo thành.
2.4.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK
- Cắt các màng CVK có đƣờng kính 5cm với độ dày (0.3cm và 0.7cm)
tƣơng đối đều nhau. Cho 2 mẫu màng CVK đã sấy khô vào 2 bình tam giác có
chứa sẵn 100ml dung dịch berberin 10%. Sau đó cho vào máy rung siêu âm ở
nhiệt độ 37°C, sau 2 giờ tiến hành rút mẫu ra đo quang phổ bằng máy UV 2450 để xác định lƣợng thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm lấy mẫu,
từ đó xác định đƣợc lƣợng thuốc hấp thu vào các màng CVK theo công thức:
mht = m1 - m2 (mg)

(2)

Trong đó:
mht : khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào màng.
m1 : khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch (100mg).
m2 : khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất
định màng hấp thu thuốc.

Tiến hành thực hiện thí nghiệm 3 lần lấy kết quả trung bình để tính toán.
- Hiệu suất thuốc nạp vào màng CVK đƣợc tính theo công thức [25].
EE (%) =

(𝑄𝑡 − 𝑄𝑑 )
𝑄𝑡

17

x 100%

(3)