Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời chlamydia trachomatis và neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real time PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM

ĐỖ TRUNG HẬU

XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI
Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX REAL-TIME PCR
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 06 NĂM 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp. HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Trần Trưng Hiếu

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày 28
tháng 07 năm 2017
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch hội đồng: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng
2. Thư ký hội đồng: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
3. ủy viên Phản biện 1: TS. Trần Trung Hiếu

4. ủy viên Phản biện 2: TS. Hoàng Anh Hoàng
5. ủy viên Hội đồng: PGS.TS. Phan Ngọc Hòa
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau
khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS.TS. Phan Thanh Sưn Nam


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Đỗ Trung Hậu

MSHV: 1570255

Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1985

Nơi sinh: TP. HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201
I. TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis và
Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real-time PCR
II. NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria
gonorrhoeae (NG) bằng phương pháp multiplex real-time PCR với các nội dung chính
sau:
1. Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG.
2. Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR.
3. Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng, in.
NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2017
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017
V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương

Tp. HCM, ngày.... tháng.... năm 20....
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương

PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương

GS.TS. Phan Thanh Sơn Nam


1

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lòi cảm ơn chân thành đến:
Ban Giám hiệu trường Đại học Bách Khoa, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ Thuật Hóa
Học, Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã giảng dạy, truyền đạt
những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Ban Giám Đốc Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương đã tạo điều kiện
cho tôi làm việc và thực hiện đề tài tại công ty.
PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa Học Tự Nhiên
TP. HCM, người hướng dẫn khoa học cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.
ThS. Nguyễn Thị Minh Tâm, các em phòng nghiên cứu, phòng Kiểm định Chất
lượng cùng toàn thể các đồng nghiệp làm việc tại công ty TNHH CNSH Khoa Thương
đã hỗ trợ và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua.
Những người thân yêu của tôi: Ba mẹ, Bà xã, con trai và các anh chị em tôi mến
thương nhất. Cảm ơn Bà xã và con trai đã tạo động lực cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu


TÓM TẮT
Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) là hai tác nhân vi
khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến trên thế giới và thường đi kèm
với nhau. Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ, phát hiện nhanh và chính xác CT và NG
trong bệnh phẩm, chúng tôi xây dựng quy trình multiplex real-time PCR phát hiện
đồng thời hai tác nhân gây bệnh này. Phản ứng multiplex real-time PCR được xây
dựng có giới hạn phát hiện LOD50 là 4 bản sao/phản ứng, với độ đặc hiệu cao cho CT
và NG. Quy trình có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên nội phản ứng nhỏ hơn 1% và hệ
số biến thiên liên phản ứng nhỏ hơn 2%.
Chúng tôi thực hiện trên 100 mẫu dịch phết tế bào, kết quả cho thấy có 20%

trường hợp nhiễm CT, 15% trường hợp nhiễm NG và 8% trường hợp đồng nhiễm
CT/NG. Đồng thời quy trình của chúng tôi có kết quả đúng với kết quả giải trình tự.
Nghiên cứu này là tiền đề cho sự phát triển kit phát hiện đồng thời CT và NG.


ABSTRACT
Chlamydia trachomatis (CT) and Neisseria gonorrhoeae (NG) are the most
common pathogens which cause sexually ửansmitted diseases in the world. In order to
create a toolkit used for a rapid and accurate detection of CT and NG in clinical
samples, we developed a multiplex real-time PCR test that can simultaneously detect
both pathogens. The limit of detection (LOD50) of the real-time PCR was 4 copies per
reaction. The protocol had good repeatability, with intra-assay and interassay
coefficients of variability inferior to 1% and 2%, respectively.
We tested 100 clinical samples for CT and NG. The infection rates were 20 % for
NG and 15% for CT, co-infection of CT/NG accounted for 8% in total. Our results
were confirmed by Sanger sequencing. The study constituted the base for further
development of diagnostic kit simultaneously detecting CT and NG in clinical
samples.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, nếu có gì sai sót tôi xin hoàn toàn chịu
trách nhiệm.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu


V

MỤC LỤC
TÓM TẮT.....................................................................................................................ii
ABSTRACT.................................................................................................................iii
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................iv
MỤC LỤC....................................................................................................................V
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................viii
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................ix
MỞ ĐẦU.......................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3
1.1.

Tổng quan về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae
(NG) ...3

1.1.1. Giới thiệu về CT...........................................................................................3
1.1.2. Giới thiệu về NG...........................................................................................7
1.2...........................................................Một số phuơng pháp phát hiện CT và NG
.........................................................................................................................11
1.2.1. Phuơng pháp nuôi cấy truyền thống...........................................................11
1.2.2. Phuơng pháp kháng thể huỳnh quang trục tiếp...........................................12
1.2.3. Phuơng pháp miễn dịch liên kết enzyme....................................................12
1.2.4. Phuơng pháp PCR và multiplex PCR.........................................................13
1.2.5. Phuơng pháp real-time PCR và multiplex real-time PCR..........................13
1.3.................................................Một số nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam
.........................................................................................................................16
1.3.1. Trên thế giới................................................................................................16
1.3.2. Tại Việt Nam...............................................................................................17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu......................................19
2.1..................................................................Địa điểm và thời gian nghiên cứu

...................................................................................................................19
2.2...........................................................................................................Vật liệu
...................................................................................................................19
2.2.1. Mẩu thực nghiệm........................................................................................19
2.2.2. Mồi, mẫu dò và amplicon...........................................................................19
2.2.3. Hóa chất......................................................................................................19


V

2.2.4. Thiết bị và dụng cụ.....................................................................................20
2.3............................................................................Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
...................................................................................................................20
2.4............................................................................................Bố trí thí nghiệm
...................................................................................................................22




DANH MỤC CÁC BẢNG
•

Bảng 1.1. Tỷ lệ nam nhiễm NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân .................7
Bảng 1.2. Các chất phát và hấp thu huỳnh quang thường sử dụng............................16
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng........................................................................20
Bảng 2.2. Danh sách thiết bị và dụng cụ.....................................................................20
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng monoplex real-time PCR CT, NG và IC.................22
Bảng 2.4. Thành phần hóa chất và phân bố trong đìa/tube tách chiết TANBead DNA
AutoKit........................................................................................................................30
Bảng 2.5. Diễn giải phân tích kết quả multiplex real-time PCR.................................33

Bảng 3.1. Đặc tính của các cặp mồi và mẫu dò..........................................................34
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá hoạt động của mồi và mẫu dò CT, NG và IC.................35
Bảng 3.3. Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nhiệt độ lai khác nhau.........37
Bảng 3.4. Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ MgCl2.....................38
Bảng 3.5. Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ mồi.........................39
Bảng 3.6. Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ mẫu dò...................40
Bảng 3.7. Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ enzyme Taq DNA
polymerase...................................................................................................................42
Bảng 3.8. Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT, NG, IC..........43
Bảng 3.9. Thành phần phản ứng multiplex real-time PCR.........................................45
Bảng 3.10. Kết quả đánh giá tính hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR........46
Bảng 3.11. Bảng kết quả so sánh 3 phưomg pháp tách chiết DNA.............................48
Bảng 3.12. Bảng thống kê hệ số tưomg quan “r” giữa 3 phưomg pháp tách chiết DNA
.....................................................................................................................................49
Bảng 3.13. Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện CT (HEX).............50
Bảng 3.14. Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện NG (FAM)............50
Bảng 3.15. Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện IC (CY5)..............50


Bảng 3.16. Ket quả độ đặc hiệu phân tích của phản ứng multiplex real-time PCR 52
Bảng 3.17. Ket quả phát hiện CT và NG bằng phưomg pháp multiplex real-time
PCRtrên 100 mẫu lâm sàng.........................................................................................56

DANH MỤC CÁC HÌNH
•

Hình 1.1. Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT .................................5
Hình 1.2. Tế bào bị nhiễm vi khuẩn CT........................................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc plasmid LGV440 của CT ...............................................................ố
Hình 1.4. Chu kỳ vòng đừi của vi khuẩn CT ...............................................................ố

Hình 1.5. Viêm kết mạc ở mắt và trẻ mù mắt do NG ...................................................9
Hình 1.6. Vi khuẩn NG ...............................................................................................10
Hình 1.7. Cấu trúc bề mặt của NG..............................................................................11
Hình 1.8. Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR ......................14
Hình 1.9. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan®..............................................15
Hình 2.1. Máy real-time PCR CFX96, Stratagene Mx3005P và AriaMx...................20
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.........................................................................21
Hình 2.3. Máy tách chiết bán tự động Smart LabAssist.............................................30
Hình 2.4. Bố trí đĩa tách chiết (trái) và khay tách chiết dạng tube (phải)...................31
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu dò CT, NG và IC..................35
Hình 3.2. Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò của phản ứng CT, NG và IC.................41
Hình 3.3. Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT........................43
Hình 3.4. Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng NG........................44
Hình 3.5. Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng IC.........................44
Hình 3.6. Kết quả đánh giá tính hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR...........46
Hình 3.7. Biểu đồ đường cong chuẩn màu HEX (phải) và màu FAM (trái)...............48
Hình 3.8. Biểu đồ kết quả so sánh 3 phương pháp tách chiết DNA...........................49
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu phân tích.......................................................51
Hình 3.10. Hệ số biến thiên nội phản ứng...................................................................53
Hình 3.11. Hệ số biến thiên liên phản ứng..................................................................54
Hình 3.12. Kết quả phát hiện CT và NG một số mẫu lâm sàng..................................55


Trang 1

Mở đầu

MỞ ĐẦU
Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) là hai tác nhân vi
khuẩn gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến trên thế giới đặc biệt là ở các

nước đang phát triển [27], [31], Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có
thêm khoảng 131 triệu người nhiễm CT (36,7%) và 71 triệu người nhiễm NG (19,9%)
trong tổng số 357 triệu người nhiễm bệnh lây truyền qua đường tình dục [59], Một
nghiên cứu tại 5 tỉnh biên giới của Việt Nam vào năm 2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm CT là
11,9%; NG là 10,7%; đồng nhiễm CT/NG là 19,9% [57], Một nghiên cứu khác công
bố tỷ lệ nhiễm CT ở phụ nữ đến khám vô sinh tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương năm
2012 là 25,2% [8], Tỷ lệ nhiễm CT khoảng 16,7% và NG khoảng 14,7% trong tổng số
314 nam bán dâm đồng giới tại Hà Nội năm 2014 - 2015 [9], Trong những năm gần
đây, tỷ lệ người mắc bệnh do CT và NG gây ra ngày càng tăng cao nhưng ít được
thống kê đầy đủ và chính xác [21],
Người mắc bệnh Chlamydia do CT và bệnh lậu do NG gây ra nếu không được phát
hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến những di chứng lâu dài ở cả nam và nữ như vô sinh,
viêm hậu môn, trực tràng. Đối với phụ nữ đang mang thai, việc mắc bệnh có nguy cơ
dẫn đến viêm vùng chậu, thai chậm phát triển, chết thai, sinh non, sinh con nhẹ cân và
đặc biệt có thể gây mù lòa ở trẻ sơ sinh do CT và NG lây truyền từ mẹ sang con [22],
Mặc dù dễ điều trị nhưng bệnh lây lan rất nhanh ttong cộng đồng và gây ra những
hậu quả khó lường do bệnh ít có triệu chứng hoặc được phát hiện ở giai đoạn muộn.
Một số phương pháp truyền thống như nuôi cấy, nhuộm, soi tươi, miễn dịch huỳnh
quang thường được sử dụng để phát hiện CT và NG, tuy nhiên các phương pháp này
có độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian [54], [56]. Chính vì vậy các phương pháp nhân
bản gene (PCR, Real-time PCR) đã được sử dụng rộng rãi trong thời gian gần đây vì
có độ nhạy cao so với các phương pháp nuôi cấy định danh [17], [19] và được Trung
tâm Kiểm soát và Phòng chống Dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Conừol and
Prevention - CDC) khuyến cáo sử dụng trong các chương trình giám sát CT và NG
[20].
Hiện nay, việc xây dựng phương pháp multiplex real-time PCR để chẩn đoán CT và
NG vẫn chưa phổ biến tại Việt Nam. Chính vì vậy, việc xây dựng một phương pháp
phát hiện nhanh và chính xác CT và NG tại Việt Nam với chi phí thấp là vấn đề cấp
Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


Trang 2

Mở đầu

thiết nhằm ngăn ngừa, kiểm soát và hướng đến việc điều trị kịp thời các bệnh lây
truyền qua đường tình dục do hai vi khuẩn này gây ra. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng
tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia
trachomatis và Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real-time
PCR” với các nội dung chính sau:
1. Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG.
2. Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR.
3. Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng.
Sự thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho sự phát triển kit chẩn đoán multiplex realtime PCR có khả năng phát hiện nhanh, chính xác CT và NG, tác nhân gây bệnh lan
truyền qua đường tình dục. Đây là cơ sở thuận lợi cho công tác nghiên cứu dịch tễ học
và chẩn đoán bệnh trong lĩnh vực y tế cộng đồng.

Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


Trang 3

Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG)

1.1.1. Giới thiệu về CT
1.1.1.1. Dịch tễ học bệnh Chlamydia
Theo ước tính của WHO, mỗi năm có khoảng 130,9 triệu người nhiễm CT [58], Tỷ
lệ nhiễm CT cao nhất ở thanh thiếu niên trong độ tuổi từ 15-24 [22]. Hầu hết phụ nữ
và nam giới nhiễm CT đều không có triệu chứng. Tỷ lệ nhiễm CT không có triệu
chứng ở nữ (80%) thường cao hơn so với nam (50%) [49],
Theo báo cáo của CDC, năm 2015, tại Mỹ, có khoảng 1.526.658 trường hợp nhiễm
CT, tăng 5,9% so với năm 2014. Trong đó, tỷ lệ nhiễm CT ở nữ tăng 3,8% và ở nam
tăng 10,5% [21],
Tỷ lệ nhiễm CT ngày càng gia tăng nhưng chưa được thống kê đầy đủ và chính xác.
Các nghiên cứu gần đây tại Ấn Độ cho thấy tỷ lệ nhiễm CT chiếm khoảng 23% tại các
phòng khám phụ khoa và chiếm 19,9% ở các bệnh nhân nhiễm trùng qua đường tình
dục. Một nghiên cứu khác ở Anh, trong vòng 20 năm qua, ước tính tỷ lệ nhiễm CT ở
các phòng khám tiết niệu là 17,3%, ở các phòng khám thai là 12,6%, tại các cơ sở phá
thai là 12,3%, tại các phòng khám dành cho thanh thiếu niên chiếm 10,7% và 10% ở
các phòng khám kế hoạch hóa gia đình [41],
Tại Việt Nam, theo số liệu các địa phương báo cáo về Viện Da liễu Quốc gia, số ca
nhiễm CT có xu hướng tăng lên do bệnh này thường diễn biến âm thầm và ít triệu
chứng [10], Nghiên cứu của Lê Hồng cẩm trên 415 phụ nữ viêm cổ tử cung trong độ
tuổi từ 15 đến 45 trong thời gian từ 2/1998 đến 3/1999 tại huyện Hóc Môn, Thành phố
Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ nhiễm CT trên đối tượng này là 18,07% [5]. Nghiên cứu
khác của Phạm Văn Đức và cộng sự về tỷ lệ nhiễm CT ở phụ nữ hút thai 3 tháng đầu
và các yếu tố liên quan tại khoa Kế hoạch hóa gia đình - Bệnh viện Từ Dũ từ
01/08/2007 đến 30/01/2008 cho thấy trong 1003 trường hợp nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm
CT ở phụ nữ hút thai là 9,2% với độ tuổi dưới 30 và có thu nhập trung bình [12], Theo
một báo cáo đánh giá hoạt động phòng chống bệnh lây truyền qua đường tình dục năm
2014 của bệnh viện Phong - Da liễu Trung ương Quy Hòa ở 15 tỉnh khu vực miền
Trung - Tây Nguyên từ Quảng Bình đến Bình Thuận và 5 tỉnh Tây Nguyên (Kon Tum,
Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


Trang 4

Tổng quan tài liệu

Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông, Lâm Đồng), tỷ lệ người mắc bệnh CT trong tổng số
người đến khám chữa bệnh da liễu ở các phòng khám tuyến tỉnh là 288.950 người
chiếm 0,07% [7], Việc tầm soát CT là một trong những biện pháp ngăn ngừa và điều
trị CT hiệu quả nhất.
1.1.1.2, Triệu chứng lâm sàng [2], [49]
CT có khả năng gây ra nhiều bệnh khác nhau do 15 serovars (týp huyết thanh) gây
ra.
a. Bệnh mắt hột: do CT serovars A-C gây ra
Khởi đầu nhẹ: ngứa, nóng rát, chảy nước mắt.
Nhiễm trùng cấp tính: viêm kết mạc thể nang, xung huyết, phù kết mạc và dẫn đến
viêm giác mạc. Chu trình tái diễn với những tổn thương lặp lại, đặc biệt là ở giác mạc
dẫn đến hậu quả là mù. Các nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng cho thấy những biến
chứng thường hay gặp ở các nhiễm trùng mạn tính, đặc biệt là khi nhiễm trùng lần thứ
hai vì cơ thể đã được mẫn cảm do nhiễm trùng lần thứ nhất.
b. Viêm kết mạc thể vùi: do CT serovars D-K gây ra, thường gặp ở trẻ sơ sinh do
mắt tiếp xúc với dịch đường sinh dục có vi khuẩn của mẹ.
c. Nhiễm trùng ở đường sinh dục: do CT serovars D-K gây ra
Ở nam giới: chủ yếu gây viêm niệu đạo nhưng có 40% nam giới bị nhiễm không có
triệu chứng. Viêm mào tinh hoàn và viêm tuyến tiền liệt là biến chứng sau khi nam
giới bị nhiễm CT, có tới 50% trường hợp viêm mào tinh hoàn dưới 35 tuổi.
Ở nữ giới: Thường gặp nhất là viêm niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung. Khoảng 70%
phụ nữ nhiễm trùng sinh dục không có triệu chứng, nếu không điều trị sẽ để lại di
chứng nặng nề và dẫn đến viêm vùng chậu (Pelvic Infection Disease - PID), tắc vòi

trứng, thai ngoài tử cung, vô sinh [2], [49], Các chương trình sàng lọc CT được chứng
minh là làm giảm tỷ lệ viêm vùng chậu ở phụ nữ [49].

Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


Trang 5

Tổng quan tài liệu

Hình 1.1. Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT [62]
d. Viêm khớp do bệnh truyền qua đường tình dục (SARA - sexually bacquừed
reactive arthritis): ảnh hưởng đến các khớp lớn, đặc biệt là khớp chân. Nam
giới bị ảnh hưởng nhiều hơn nữ giới với tỷ lệ 10:1.
e. Nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ', tỷ lệ truyền từ mẹ sang trẻ sơ sinh là
55%, trong đó 45% là viêm kết mạc và 30% viêm phổi [2], [49],
f. Lymphogranuloma Venereum (LGV - hoa liễu): là bệnh lây truyền qua đường
tình dục do CT serovars Ll - L3 gây ra [2],
1.1.1.3. Đặc điểm sinh học của CT
Quan sát dưới kính hiển vi quang học, CT là vi khuẩn Gram âm có màng là
lipopolysaccharide, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước thay đổi. Vi khuẩn thường thay
đổi hình dạng trong chu kỳ sao chép, vỏ vi khuẩn gồm màng trong và màng ngoài,
không có lớp peptidoglycan giữa các màng [3],

Hình 1.2. Tế bào bị nhiễm vi khuẩn CT [66]
1.1.1.4, Đặc điểm bộ máy di truyền CT
CT là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, bộ gene có khoảng 600 gene. CT chứa 7
đến 10 bản sao của plasmid trong mỗi tế bào, cryptic plasmid có kích thước khoảng

7,5 kb được phát hiện trong tất cả các chủng của CT [47], [48], Cryptic plasmid
Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


Trang 6

Tổng quan tài liệu

chứa 8 khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) mã hoá cho
một số protein kháng nguyên đặc trung. Mặc dù chức năng
của 8 gene trên cryptic plasmid còn chưa xác định hoàn
toàn, nhưng trình tự nucleotide và sự có mặt của plasmid
trong tế bào cho thấy nó có vai trò quan trọng đối với vi
khuẩn CT [53],

Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


Trang 7

Tổng quan tài liệu

quang phát ra tương ứng với một trình tự mục tiêu được
nhân bản thành công. Những hóa chất phát huỳnh quang bao
gồm thuốc nhuộm liên kết DNA (Evagreen, SYBR Green I,
SYBR Green II) và một đoạn DNA mạch đơn đặc hiệu cho vùng

gene mục tiêu được gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò
(mẫu dò TaqMan®, molecular beacon, mẫu dò Eclipse,...).
Multiplex real-time PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật real-time PCR nhưng
trong một ống phản ứng đơn có thể nhân bản đồng thời nhiều trình tự mục tiêu khi sử
dụng nhiều hơn một cặp mồi và các mẫu dò khác nhau.
Hiện nay, mẫu dò TaqMan® và thuốc nhuộm liên kết Evagreen, SYBR Green được
sử dụng phổ biến nhất. Mỗi loại đều có những ưu điểm và mặt hạn chế của chúng nó.
1.2.5.2. Các hóa chất phát huỳnh quang thường được sử dụng [16], [18]
a. Thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng chủ yếu là SYBR Green I và
Evagreen cho phép liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi (Hình 1.8). Các chất
này chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu huỳnh quang khi chúng ở dạng tự do trong
dung dịch, nhưng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng lên đến 1000 lần khi chúng liên kết với
DNA mạch đôi. Như vậy, tín hiệu huỳnh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ lệ với lượng
DNA mạch đôi hiện diện và gia tăng khi trình tự mục tiêu được nhân bản.
Phân tử SYBR Green I chưa gắn
chèn
Phân tử SYBR Green I được gắn
chèn

Hình 1.8. Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR [65]

Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu


ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng đơn giản
(chỉ cần 2 mồi, không cần thiết kế mẫu dò), chi phí ban đầu thấp. Tuy nhiên trở ngại lớn
nhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng không đặc hiệu, nghĩa là chúng liên kết
với bất kỳ DNA mạch đôi nào do đó phải thực hiện phân tích melting-curve (đường

cong nóng chảy) để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng nhân bản. Kết quả là sự hiện
diện của các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng realtime PCR có thể làm tăng
lượng tín hiệu huỳnh quang tổng và ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả định
lượng.
b. Hóa chất phát huỳnh quang dựa trên mẫu dò được sử dụng phổ biến hiện nay
là mẫu dò TaqMan®. Đó là một đoạn DNA mạch đơn đặc hiệu cho vùng gene mục tiêu
cùng với phân tử phát huỳnh quang (reporter) và phân tử “dập tắt” huỳnh quang
(quencher) được gắn cộng hóa trị ở hai đầu. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu
huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher dập tắt. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu
dò bắt cặp với vùng gene mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ - 3’
exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách
nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. Sự gia tăng tín
hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra.
ft « ftyurtir Cl

z CuMidur
T

r*!.'l|-iisiir«liu'

“Or

Ĩ—

*-Lrk/

©

A

■ ------------------------------------------------------------------------------- j

Hình 1.9. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan® [64]
ưu điểm chính của mẫu dò TaqMan® là độ đặc hiệu cao và cho phép thực hiện các
phản ứng multiplex. Tuy nhiên giá thành đắt và việc thiết kế phản ứng phức tạp hơn.
Một khía cạnh quan trọng trong việc thiết kế mẫu dò là việc lựa chọn chất phát và
hấp thu huỳnh quang.


Bảng 1.2. Các chất phát và hấp thu huỳnh quang thường sử dụng
Bước sóng kích
thích (nm)

Bước sóng HQ
phát ra (nm)

Quencher

FAM

495

520

TAMRA, DABCYL, BHQ1

HEX

535

556

BHQ1

ROX

586

610

BHQ2, BHQ3, DABCYL

CY5

647

667

BHQ2, BHQ3

VIC

538

554

BHQ1

TEXAS RED

590

610

BHQ2, BHQ3, DABCYL

Tên reporter

1.3. Một số nghiên cứu trên thế giói và tại Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Hiện nay, các phương pháp nhân bản gene được lựa chọn trong các phòng thí
nghiệm lâm sàng trên toàn thế giới để chẩn đoán thường quy CT và NG [27],
Năm 2014, Dhawan và cộng sự đã sử dụng phương pháp real-time PCR để phát hiện
việc nhiễm CT ở những phụ nữ vô sinh tại khu vực Bắc Ấn Độ. Kết quả độ nhạy và độ
đặc hiệu phù hợp với kit COBAS TaqMan c. trachomatis Test (Roche, Mỹ) và có thể
phát hiện CT ở nồng độ 10 bản sao/phản ứng [24],
Đen năm 2015, nghiên cứu của Tayoun và cộng sự sử dụng phương pháp multiplex
PCR và Melt Curve Analysis để phát hiện đồng thời CT, NG, Trichomonas vaginalis
(TV) và chứng nội (Internal Conttol) được bổ sung vào trong quá trình tách chiết DNA
để kiểm soát quá trình tách chiết DNA và PCR. Kết quả phương pháp chẩn đoán này
tiết kiệm được chi phí, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, dễ dàng phát hiện sự đồng nhiễm
của CT, NG, TV và có thể sử dụng nhiều loại mẫu khác nhau: nước tiểu, dịch phết âm
đạo [56],
Tiếp theo đó cũng vào năm 2015, công trình nghiên cứu của Rumyantseva và cộng
sự đánh giá phương pháp multiplex real-time PCR (AmpliSens) phát hiện đồng thời 4
mục tiêu CT, NG, TV và Mycoplasma geneitalium (MG). Phương pháp còn phát hiện
thêm trình tự DNA chứng nội. Kết quả cho thấy phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu
cao với tỷ lệ nhiễm CT, NG, TV, MG lần lượt là 6,3%; 0,3%; 0,08% và 5,7% [51],
Gần đây là nghiên cứu của Meyer và cộng sự năm 2016. Các tác giả thực hiện đánh
giá kit PelvoCheck CT/NG bằng phương pháp PCR để phát hiện CT và NG, kit sử dụng

gene ADAT1 được bổ sung vào master mix làm chứng nội kiểm soát quá trình nhân bản
cùng với DNA CT/NG [43]. Cũng trong năm 2016, nghiên cứu của Jaureguy và cộng sự
sử dụng phương pháp real-time PCR để xác định tỷ lệ nhiễm CT và NG ở những cá
nhân bị tấn công tình dục ở Paris, Pháp. Kết quả phát hiện 15% nhiễm CT, 5% nhiễm
NG và 3% đồng nhiễm cả hai loại vi khuẩn trên [38],
1.3.2. Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu đã công bố về xây dựng các phương pháp phát hiện CT
và NG có phần hạn chế hơn so với thế giới.
Năm 2007, Võ Hồ Hồng Hải đã xây dựng và chuẩn hóa quy trình phát hiện đồng thời
CT và NG sử dụng kỹ thuật PCR-ELISA và chứng nội. Kết quả phát hiện 6% nhiễm
CT, 2% nhiễm NG trong 100 mẫu dịch phết cổ tử cung [14],
Vào năm 2011, Trần Đăng Thắng và cộng sự đã xây dựng thành công quy trình
multiplex PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh HPV và NG. Kết quả cho
thấy 2 trường hợp dương tính với NG chiếm 6% trong 30 mẫu thu thập từ bệnh nhân và
1 trường hợp đồng nhiễm với HPV [13].
Như vậy, các công trình nghiên cứu về phương pháp phát hiện CT và NG đã được
thực hiện rộng rãi trên thế giới dưới nhiều hình thức khác nhau. Tuy nhiên, ở Việt Nam
các công trình nghiên cứu đã được công bố sử dụng phương pháp multiplex real-time
PCR phát hiện CT và NG chưa phổ biến. Phương pháp real-time PCR có nhiều ưu điểm
hơn so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban
đầu với sự chính xác và độ nhạy cao, kết quả real-time được đánh giá không cần phải
điện di trên gel agarose, giúp tiết kiệm thời gian. Đồng thời, việc tiến hành phản ứng và
đánh giá kết quả trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm
và loại bỏ những thao tác sau phản ứng nhân bản.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng mẫu dò TaqMan® và mồi nhân bản vùng gene
đặc trưng của CT và NG. Ngoài ra, trong hỗn hợp phản ứng real-time PCR còn chứa
một cặp mồi nhân bản một đoạn gene ALAS1 của người làm chứng nội nội sinh. Khác
với một số công trình công bố gần đây đã sử dụng chứng nội ngoại sinh, đoạn gene này

được ly trích cùng với DNA CT và NG trong quá trình tách chiết giúp phát hiện các


chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả của quá trình tách chiết DNA cũng như
phản ứng PCR [38], [51], [56],


Trang 12 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu

Luận văn Thạc sĩ

Đỗ Trung Hậu