Phát hiện đột biến gen ATP7B trên gia đình bệnh nhân Wilson

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B
TRÊN GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN WILSON
Phan Tôn Hoàng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Lê Văn Hưng
Nguyễn Ngọc Hùng, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh
Trư ng
h YH N
n
nh tr
tr ng tr ng
tr nh
ụ t
h th n
nh
n TP
ư
t g n
nh t
g n TP
g
n

n n tr n nh
th thư ng g
h
tr nh h th
h n h
t
n g n TP
tr n

nh nh n
h
h
ng 21
h
n
t
h th
nh nh n
4 -4 C
C tr n
n1
45

n n
t
n g n TP
nn
tr
th tr
ng tr ng ơ th Ngh n
ư th
ư
h n
n
nh
n tr ng ng
h 21
n
g n

n h
PC
ư g
ư
h th n
2 t
n
ng h t
tr n
n

n
h n
tg
tr nh
tr n

Từ khóa: gen ATP7B, bệnh Wilson, đột biến gen

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Wilson hay bệnh rối loạn chuyển hóa đồng, là
một bệnh lý liên quan đến tổn thương gen. Đây là bệnh
di truyền lặn trên nhiễm sắc thể (NST) thường, đồng
tích tụ ở một số cơ quan trong cơ thể, đặc biệt là gan
và não, gây nhiều biến chứng. Trên thế giới, tần suất
mắc bệnh dao động trong khoảng 1/30.000 ÷ 1/100.000
người [1]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu lâm sàng chủ
yếu tập trung vào đặc điểm lâm sàng [2]. Năm 2010,
lần đầu tiên chúng tôi phát hiện hai trường hợp bệnh
nhân có đột biến gen Arg778Leu [3]. Các nghiên cứu

sau đó là xác định đột biến ở một số vùng đột biến
trọng điểm và hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen
ATP7B. Năm 2011,trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein
thuộc trường Đại học Y Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu
phát hiện đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson [4; 5].
Về sinh bệnh học phân tử, nguyên nhân gây bệnh
Wilson là do thiếu hụt enzym ATPase typ P (P - ATPase),
được mã hóa bởi gen ATP7B trên NST 13q14.3. Enzym
P - ATPase đóng vai trò vận chuyển đồng qua màng tế
bào. Sự thiếu hụt hoặc giảm hoạt tính của enzym dẫn
đến giảm sự bài tiết đồng từ tế bào gan vào mật và gây
ứ đọng đồng tại gan. Khi lượng đồng trong gan tăng
quá mức, đồng sẽ theo hệ thống tuần hoàn tới các cơ
quan như: não, mắt, thận và gây các tổn thương cho
các cơ quan này.
Chẩn đoán bệnh Wilson có thể dựa trên các triệu
h
YH
h
Ng nh
Ng
h
h

30

n h Tr n H Th nh
N
th nh
h

n 24 2014
th n 1 11 2014

nH

nh trư ng

chứng lâm sàng của gan, não, vòng Kayser - Fleischer
ở mắt và các xét nghiệm hóa sinh trong máu (nồng độ
đồng trong nước tiểu 24 giờ, hàm lượng ceruloplasmin
huyết thanh, nồng độ đồng trong gan) [6]. Đột biến điểm
là đột biến thường gặp trên gen ATP7B và chủ yếu sử
dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến, tuy
nhiên do đột biến nằm rải rác khắp chiều dài gen ATP7B
nên cần phải giải trình tự toàn bộ gen ATP7B với 21
exon mới phát hiện được đột biến nên khá tốn kém và
mất thời gian. Các nghiên cứu ở mức độ sinh học phân
tử là cần thiết đề xác định chính xác các đột biến gây
bệnh giúp cho công tác điều trị và xác định người lành
mang gen bệnh để có những tư vấn di truyền thích hợp.
Bởi vậy đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện
đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân được chẩn đoán
mắc bệnh Wilson.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
Nhóm bệnh: 7 bệnh nhân trong một gia đình, được
chẩn đoán mắc bệnh Wilson dựa vào triệu chứng lâm
sàng và xét nghiệm hóa sinh máu.
Nhóm chứng: 1 người bình thường, tiền sử gia đình

không có người mắc bệnh di truyền.
2. Phương pháp
2.1. Quy trình lấy mẫu: Bệnh nhân sẽ được lấy 2ml
máu tĩnh mạch chống đông trong EDTA. Quy trình đảm
bảo tuyệt đối vô trùng.
2.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số: Quy trình
tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo quy trình
phenol/chloroform. Nồng độ và độ tinh sạch DNA được
kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260/280).


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
2.3. Quy trình giải trình tự gen xác định đột biến
+ Kỹ thuật PCR: Toàn bộ 21 exon của gen ATP7B
được khuếch đại với các cặp mồi đặc hiệu.
Quy trình của phản ứng PCR có thể tích là 20μl chứa các
thành phần: 20ng cDNA, 50ng mỗi primer, 200μmol/L
dNTPs, 2 đơn vị enzym Taq polymerase (do hãng
Qiagen cung cấp), và 2μL GeneAmp 10xBuffer (gồm
10mmol/L Tris- HCl μl 10 X buffer, pH 8,2 và 50 mmol/L
KCl). Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Đầu tiên
là giai đoạn biến tính ở 96°C trong 5 phút, tiếp theo là
35 chu kỳ gồm biến tính ở 96°C trong 1 phút; gắn mồi
ở 60°C trong 1 phút và bước kéo dài 72°C trong 3 phút,
cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5 phút
và bảo quản tạm thời sản phẩm PCR ở 4°C.
+ Kỹ thuật giải trình tự gen: sản phẩm PCR được tinh
sạch từ gel sử dụng Kit của QIAGEN. Sản phẩm sau
tinh sạch được giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100
Genetic Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng

phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection,
DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI.
3. Đạo đức nghiên cứu
Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham
gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu
khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu.
Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân sẽ được thông báo
về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư
vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp.
Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.

III. KẾT QUẢ
21 cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuyếch đại
gen ATP7B trên bệnh nhân mã số W7.00. Kích thước
của các sản phẩm PCR trong khoảng 100÷200 bp. Hình
1 minh họa sản phẩm PCR exon 3 của gen ATP7B.

Hình 1. Hình ảnh đai diện sản phẩm PCR khuếch đại exon 3 của gen ATP7B.
C: mẫu đối chứng, 1 - 7: mẫu bệnh nhân, MarkerФ174
Sản phẩm khuếch đại exon 3 thu được là đặc hiệu, rõ nét và đảm bảo cho phản ứng sequencing tiếp theo để
phát hiện đột biến điểm.
Sản phẩm PCR của toàn bộ 21 exon gen ATP7B của bệnh nhân mã số W7.00 được tinh sạch và được tiến
hành giải trình tự gen. Kết quả cho thấy có 2 đột biến điểm dị hợp tử ins47-48CGGCG ở exon 1 và c.1523G>C
(p.Val456Leu)

Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon 1 và exon 3 của bệnh nhân mã số W7.00
31

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
Chú thích: Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi
Đột biến dị hợp tử thêm 5 nucleotid CGGCG sau vị trí 47 tại exon 1 (NM-000053, GeneBank) làm thay đổi khung
dịch mã. Đây là đột biến mới chưa được công bố tại ngân hàng dữ liệu về bệnh Wilson (wilsondiseas.med.ualberta.
ca). Đột biến dị hợp tử thứ hai là thay thế G > C ở vị trí 1523 (c.1523G > C, NM_000053, GeneBank) tại exon 3 làm
cho bộ ba tại vị trí 456 mã hóa Valine chuyển thành Leucin (p.Val456Leu).

Hình 3. Phả hệ của gia đình bệnh nhân Wilson mã số W7.00
Phả hệ gia đình gồm 5 thế hệ, bệnh nhân được phát hiện đột biến gen ATP7B là thế hệ thứ tư (IV.1). Phả hệ có
7 người mắc bệnh theo chẩn đoán lâm sàng (III - 1, III - 3, III - 5, II - 8, IV - 1, IV - 3, IV - 4), 15 người bình thường
(I.1, I.2, II.1, II.2, II.3, II.4, III.2, III.4, III.6, III.7, III.9, III.10, IV.2, IV.5, V.1.

IV. BÀN LUẬN
Cho đến nay, khoảng hơn 500 đột biến đã được
tìm thấy trên bệnh nhân mắc bệnh Wilson [7; 8]. Mỗi
quốc gia, mỗi chủng tộc người khác nhau có các loại
đột biến khác nhau. Đột biến p.His1069Glu là đột biến
thường gặp nhất trong quần thể nguời da trắng, chiếm
khoảng 37% đến 63% tổng số đột biến. Trên quần thể
người Trung Quốc, đột biến p.Arg778Leu chiếm 34 ÷
38% tống số đột biến [9; 10]. Protein ATP7B mang đầy
đủ các đặc điểm đặc trưng cho một protein thuộc họ
protein P - APTase với 5 vùng chức năng chính: Vùng
MBSs (vị trí bám cho các nguyên tử đồng), vùng N
(vùng bám ATP), vùng P (vùng phosphor hóa), vùng A
(vùng khử phosphor) và vùng xuyên màng (nằm trên 8
exon: exon 6 ÷ exon 12 và exon 19, exon 20) [1].
Đột biến thêm nucleotid c.47 - 48insCGGCG nằm
trên exon 1 của gen ATP7B, đây là vùng nằm ngay
trước vị trí bám của phân tử đồng, đột biến này gây

lệch khung dịch mã và tạo ra mã kết thúc sớm dẫn đến
protein P - ATPase sẽ không được tổng hợp. Với những
32

trường hợp bệnh nhân có đột biến dị hợp tử tức là chỉ
có một alen bị đột biến mất chức năng và alen còn lại
vẫn có chức năng bình thường, thì thường không ảnh
hưởng đến kiểu hình. Tuy nhiên nếu kết hợp 2 đột biến
dị hợp tử sẽ tạo ra sự “cộng hưởng” ảnh hưởng tới sự
hình thành của protein P - ATPase gây nên bệnh lý và
là nguyên nhân ảnh hưởng đến nồng độ ceruloplasmin
huyết thanh.
Đột biến thay thế, p.Val456Leu đã được công bố
là đột biến không gây bệnh (non disease variant). Tuy
nhiên, đột biến này luôn xuất hiện cùng với các đột
biến khác, đây có thể là yếu tố làm tăng thêm mức độ
nặng của bệnh, thể hiện qua sự tụt giảm của nồng độ
ceruloplasmin huyết thanh. Đột biến này chỉ xuất hiện
ở bệnh nhân Wilson, không có ở người bình thường,
điều đó chứng tỏ đây là một biến dị hay SNP (single
nucleotide polymorphism) đặc trưng của quần thể
người mắc bệnh Wilson [11].
Bệnh nhân Wilson có thể nhận một alen bệnh của
người bố hoặc một alen bệnh của người mẹ hoặc cả
hai alen bệnh của người bố hoặc của người mẹ. Bố, mẹ


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
của bệnh nhân có thể mang gen đồng hợp lặn hoặc gen
dị hợp. Các anh chị em của bệnh nhân có thể mang gen

bệnh hoặc không. Những người mang gen bệnh đều có
khả năng di truyền cho con cháu. Một điểm khác biệt
so với nhiều bệnh di truyền khác là người mang gen dị
hợp tử cũng biểu hiện bệnh và thường kèm theo dạng
đột biến khác [1; 12].
Theo nhận định trên, phả hệ gia đình bệnh nhân
Wilson cho thấy: để những người con ở thế hệ IV mắc
bệnh, thì chồng của bệnh nhân (III.2, III.4) phải là những
người mang gen bệnh. Tương tự, cặp vợ chồng ở thế
hệ II(II.2, II.4) phải là những người mang gen bệnh theo
đúng quy luật Menden. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu có
một giả thuyết khác để lý giải tính di truyền trong phả hệ
gia đình bệnh nhân số W7.00: đó là dựa vào tính chất
của cá thể dị hợp (heterozygous). Khái niệm này đôi khi
đã bị nhầm lẫn với người lành mang gen bệnh (Carrier).
Cá thể dị hợp trong y sinh học di truyền là hiện tượng
ở các alen lặn chứa hai đột biến dị hợp tử, nằm ở vị trí
(locus) có khả năng gây bệnh lý di truyền. Ở những cá
thể này, hai đột biến dị hợp tử của cùng một gen nhưng
thuộc hai alen khác nhau (nghĩa là hai allen cùng mang
đột biến nhưng nằm ở vị trí khác nhau) [13]. Đặc điểm
này cho thấy tính đa dạng về di truyền của các bệnh lý
di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Bệnh hình
thành sau nhiều lần trao đổi chéo – hoán vị gen.
So với các các thể mang đột biến đồng hợp tử gen
lặn, ở các cá thể dị hợp tử, bệnh xuất hiện muộn hơn
và biểu hiện lâm sàng cũng nhẹ hơn. Khái niệm này
giải thích rõ hơn sự xuất hiện bệnh ở thế hệ thứ III và IV
của phả hệ gia đình số W7.00. Các bệnh nhân thế hệ
IV có thể mang gen chứa đồng thời hai đột biến dị hợp

tử trên cùng một allen (do trao đổi chéo – hoán vị gen)
được nhận từ người mẹ (thế hệ III). Những người mẹ
này nhận 2 đột biến dị hợp từ người mẹ của mình (thế
hệ II) - là người có thể mang đặc điểm cá thể dị hợp.
Điều này cần được kiểm chứng về lâm sàng ở những
người thuộc thế thệ II.

nghiệp khoa học cấp Bộ Y tế năm 2012 - 2013 và sự
giúp đỡ của các nghiên cứu viên tại Trung tâm Nghiên
cứu Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội.

V. KẾT LUẬN

10. Lei Wan, Chang - Hai Tsai, Yuhsin Tsai (2006).
Mutation analysis of Taiwanese Wilson disease
patients.
h
n
h
r h
C
n t n 345, 734 - 738.

Nghiên cứu đã phát hiện được 2 dạng đột biến điểm
dị hợp tử: ins47 - 48CGGCG trên exon 1 và p.V456L
trên exon 3 ở 7 bệnh nhân Wilson trong một gia đình.

Lời cảm ơn
Nghiên cứu được thực hiện tại với sự hỗ trợ kinh
phí của đề tài cấp Bộ: Nghiên cứu ứng dụng các kỹ

thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen ATP7B
gây bệnh Wilson ở Việt Nam, kinh phí từ ngân sách Sự

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bull P, Thomas G R, Forbes J, Rommens J M,
Cox D W (1993). The Wilson disease gene is a putative
copper transporting P-type ATPase similar to the
Menkes disease gene. N t r
n t 5, 327 - 337.
2. Lê Đức Hinh (1989 - 1990). Một số đặc điểm bệnh
Wilson ở Việt Nam.
ng tr nh ngh n
h
h
3, 316 - 334.
3. Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, Phan Tuấn
Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010). Đột biến gen
R778L ở bệnh nhân Wilson Việt Nam. T
h Nh h
3, 231 - 235.
4. Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ
Thành Văn (2011). Xây dựng quy trình xác định đột
biến gen ATP7B gây bệnh Wilson. T
h Ngh n
Yh
74(3), 26 - 29.
5. Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyên
Phương Mai, và cộng sự (2013). Xác định đột biến
gen ATP7B trên vùng hot-spots ở bệnh nhân Wilson.
T

h Yh
tN
407(2), 132 - 135.
6. Cumings JN (1951), The effects of B.A.L. in
hepatolenticular degeneration. r n 74(1), 10 – 22.
7. Peter Ferenci (2006), Regional distribution of
mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson
disease: impact on genetic testing, H
n t 120,
151 - 159.
8. Aftab Ala, Ann P Walker, Keyoumars Ashkan, et al
(2007).
n
n t 369, 397 – 408.
9. Danadevil Kuppala, Jie Deng, George J. Brewer,
(2009). Wilson Disease Mutations in the American
Population: Identification of Five Novrl Mutation in
ATP7B, Th
nH
t g
rn 1, 1 - 4.

11. Liu HP, Lin WY, Wang WF, Tsai FJ (2013). Genetic
variability in copper-transporting P-type adenosine
triphosphatase (ATP7B) is associated with Alzheimer’s
disease in a Chinese population.
g H
t
g nt 27(2), 319 - 327
12. G. Loudianos, V. Dessi, M. Lovicu, A. and A. Cao

(1999). Mutation analysis in patients of Mediterranean
descent with Wilson disease, identification of 19 novel
33


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
mutations,

n t 36(11), 833 – 836.

13. Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ, Powell LW (2000).
Compound heterozygous hemochromatosis genotype

predicts increased iron and erythrocyte indices in
women, C n
Ch
tr 46 (2), 162 – 166.

Summary
MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN A FAMILY WITH WILSON DISEASE
Wilson disease is an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in the ATP7B
gene that encodes a P-type copper transporting ATPase. The aim of this study was to screen and detect mutations
of the ATP7B gene in a family with Wilson disease (n = 7). 21 exon of ATP7B gene was directly sequenced to detect
mutation. The results showed that 7/7 patients had 2 different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG
in exon 1 and p.V456L in exon 3 of ATP7B gene.
Keywords: Wilson disease, ATP7B gene

34