Tối ưu hoá phương pháp Tetra-ARMS (tetra primer amplification refractory mutation) nhằm phát hiện đột biến Canton trong các trẻ sơ sinh mắc bệnh thiếu men G6PD tại thành phố Hồ Chí Minh

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Nghiên cứu Y học

TỐI ƯU HOÁ PHƯƠNG PHÁP TETRA-ARMS (TETRA PRIMER
AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION) NHẰM PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN CANTON TRONG CÁC TRẺ SƠ SINH MẮC BỆNH THIẾU MEN
G6PD TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Nguyễn Vũ Hoàng Uyên*, Nguyễn Thị Huệ**, Đặng Thị Lan Anh*

TÓM TẮT
Bối cảnh: Thiếu men G6PD là bệnh lý khiếm khuyết enzyme ở tế bào hồng cầu hay gặp nhất ở người với
nhiều biến chứng nghiêm trọng, đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Vì đây là bệnh di truyền, nên việc phát hiện sớm đột biến
gây bệnh rất có ý nghĩa trong công tác phòng ngừa và điều trị các biến chứng. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài
này là tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR trong việc phát hiện đột biến Canton gây bệnh thiếu men
G6PD.
Phương pháp: Trước tiên các thành phần chính của phản ứng Tetra-ARMS PCR được tối ưu hóa. Sau đó,
quy trình Tetra-ARMS chuẩn được áp dụng để phân tích kiểu gene của đột biến Canton trên ba mươi mẫu bệnh
bao gồm kiểu đồng hợp và dị hợp tử (kiểu gene đã được xác định trước bằng xét nghiệm ARMS PCR thông
thường). Những mẫu cho kết quả không trùng nhau về kiểu gene giữa hai phương pháp được kiểm tra lại bằng kỹ
thuật giải trình tự gene.
Kết quả: Trong số 13,33% mẫu bất đồng về kiểu gene giữa hai phương pháp Tetra-ARMS PCR và ARMS
PCR thông thường, Tetra-ARMS cho thấy sự chính xác 100% so với kết quả giải trình tự, trong khi sự phân tích
của ARMS lại không trùng hợp.
Kết luận: Phương pháp Tetra-ARMS là một kỹ thuật đáng tin cậy, chính xác và có thể được sử dụng như
một phương pháp phân tử bổ sung bên cạnh phương pháp sinh hoá trong việc chẩn đoán bệnh thay vì dùng
phương pháp ARMS thông thường.
Từ khóa: G6PD, Tetra-ARMS, ARMS, đột biến Canton, so sánh, độ đặc hiệu,độ chính xác.

ABSTRACT
OPTIMIZING TETRA- ARMS PCR FOR THE DETECTION OF CANTON MUTATION IN GLUCOSE-6PHOSPHATE DEHYDROGENASE DEFICIENCY (G6PD DEFICIENCY)

Nguyen Vu Hoang Uyen*, Nguyen Thi Hue, Dang Thi Lan Anh
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - No 5 - 2015: 297 - 305
Background: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is the most common enzyme defect in
human erythrocytes with a lot of serious manifestations, especially in newborns. Since this is a genetic disease, so
early detection of causative mutations is significant for the prevention and treatment of severe symptoms.
Therefore, the objective of this project is to optimize the Tetra-ARMS PCR method for detecting Canton mutation
– one of the point mutations causing G6PD deficiency.
Methods: The main and primary task of this study is optimizing the key components of Tetra-ARMS PCR.
The size for genotyping of Canton mutation in G6PD deficiency is thirty samples including homozygote and
heterozygote which were genotyped by ARMS PCR assay. After all the essential work done, results analysis and
* Trường ĐH Quốc Tế, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh
** Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Đặng Thị Lan Anh ĐT: 0932.040.074 Email:

297


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

final DNA sequencing outcomes are two evidences to prove that Tetra-ARMS PCR is surpassing than
conventional ARMS PCR. It means that both specificity and accuracy of Tetra primer ARMS PCR are higher
than ARMS-PCR.
Results: In 13.33% disagreement of genotype between the two methods, Tetra primer ARMS PCR
represented 100% agreement with ADN sequencing results, while conventional ARMS PCR technique
contradicted all four discordant samples.
Conclusion: Tetra primer ARMS PCR method is a reliable and accurate technique and it is suggested that it
can be used as a complementary method beside biochemical tests for diagnostic cases instead of conventional
ARMS PCR method. This suggestion originated with perfect rate of agreement between Tetra-ARMS outcomes

with the ones. For future research, this study will be useful for later accuracy improvement, sensitivity test and
enhancement of Tetra-ARMS PCR.
Key words: G6PD, Tetra-ARMS, ARMS, Canton mutation, validating, specificity, accuracy.
cầu, điều kiện bên ngoài và có thể dẫn đến kết
GIỚI THIỆU
quả dương tính giả hoặc âm tính giả(11,15). Hơn
Thiếu men G6PD được xem là một trong
nữa, các xét nghiệm này cũng rất khó để phát
những bệnh lý khiếm khuyết enzyme ở hồng
hiện người mang gen bệnh (người nữ dị hợp
cầu hay gặp nhất với 500 triệu người mắc bệnh
tử) những người mà bị ảnh hưởng bởi hiện
trên toàn thế giới, chiếm khoảng 7,5% dân số thế
tượng bất hoạt nhiễm sắc thể giới tính X. Vì
giới(9). Bệnh thiếu men G6PD có những biểu hiện
vậy, để ngăn ngừa các biến chứng nặng (suy
nặng nề ở trẻ sơ sinh, trong đó chủ yếu là gây
thận, bại não, chậm phát triển tâm thần, và
vàng da sơ sinh và thiếu máu do tan máu cấp,
thậm chí tử vong) từ bệnh và sự phát tán của
mạn tính, chậm phát triển tâm thần vận động và
bệnh trong quần thể, các phương pháp chẩn
có thể tử vong.
đoán phân tử đơn giản và ít tốn kém với độ
Thông thường, bệnh thiếu men G6PD
chính xác cao để phát hiện thiếu men G6PD
được phát hiện nhiều ở những vùng dịch tễ
đang không ngừng phát triển. Theo các
sốt rét. Việt Nam cũng là nước có tỉ lệ bệnh sốt
nghiên cứu trước đây, bệnh thiếu men G6PD

rét cao, nên bệnh thiếu men G6PD tương đối
xảy ra bởi các đột biến trên gen G6PD làm
phổ biến ở đất nước ta với tỉ lệ bệnh là từ 0,5 thay đổi cấu trúc enzyme G6PD. Cho tới nay,
31%(13) cho các nhóm dân tộc phía Bắc và 1,9 đã có hơn 184 đột biến gene được phát hiện(4)
4,4%(3) ở các nhóm dân tộc phía Nam. Chính vì
và đa phần là các đột biến điểm nằm trong
lí do đó mà việc sàng lọc sơ sinh cho bệnh lý
vùng mã hóa của gene G6PD, dẫn đến làm
này là vô cùng thiết yếu nhằm ngăn chặn
thay đổi các amino acid trên protein(2,10). Vì
những biểu hiện bệnh nguy hiểm xảy ra ở trẻ
vậy, thông qua việc phát hiện những đột biến
sơ sinh. Từ năm 2002, chính phủ Việt Nam đã
này, các nhà khoa học có thể sàng lọc các
thực hiện "Chương trình sàng lọc sơ sinh" ở
thiếu men G6PD với độ chính xác cao. Tại
một số bệnh viện sản khoa lớn, hầu hết là
Việt Nam, theo kết quả từ một nghiên cứu
bằng các phương pháp sinh hoá. Nhưng
năm 2007 cho thấy đột biến mất nghĩa thuộc
những phương pháp này mặc dù nhanh, dễ
phân lớp II-Canton xảy ra với tần suất cao ở
ứng dụng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt
những bệnh nhân thiếu G6PD: 26,3%(3) ở
tiền, độ chính xác của chúng lại không cao, vì
thành phố Lâm Đồng và 26,67% ở thành phố
có thể bị ảnh hưởng từ nhiều yếu tố như hồng
Hồ Chí Minh(6).
cầu lưới, các tế bào bạch cầu, tuổi của hồng

298


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Nghiên cứu Y học

Hình 1: Để tăng cường độ đặc hiệu cho mồi, một nucleotid không liên kết ở vị trí số 2 từ đầu 3’ được tích hợp
trong hai mồi bên trong. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước
khác nhau đã biết trước(5).
sàng lọc trên 300 bệnh nhân(7) bằng phương
Chính vì vậy, Canton trở thành đối tượng
pháp ARMS PCR thông thường. Đây là một
của nghiên cứu này. Đột biến Canton nằm trên
phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện
exon 12 của gen G6PD và là dạng đột biến
nghiên cứu ở các nước đang phát triển; tuy
điểm thay thế nucleotid G ở vị trí 1376 thành T
nhiên, tính chuyên biệt của nó chưa cao vì hai
trên cDNA, làm cho acid amin Arginin ở vị trí
mồi chuyên biệt cho hai alen cần xác định chỉ
459 trên phân tử protein bị biến đổi thành
(12)
khác nhau tại một nucleotide ở đầu 3’, do đó
Leucin . Đột biến này cũng đã được chứng
xác suất các mồi có thể bắt cặp sai nucleotide
minh là một trong những đột biến gây bệnh
là rất cao(1). Một nhược điểm khác của phương
trong quần thể người Kinh- Việt Nam qua

299


Nghiên cứu Y học
pháp này là để phát hiện một mẫu cần phải
thực hiện hai phản ứng PCR trong hai
eppendorf riêng biệt: một để phát hiện alen
bệnh và một để phát hiện alen lành; điều này
đã làm tăng chi phí, thời gian thực hiện, cũng
như tăng nguy cơ sai sót của phương pháp.
Ngược lại, phương pháp giải trình tự DNA
có thể coi là một phương pháp đáng tin cậy nhất
và chính xác nhất để phát hiện các đột biến,
nhưng nó cũng là phương pháp tốn kém nhất và
đòi hỏi nhiều trình tự và điện di, với nhiều thiết
bị phức tạp. Do đó, kỹ thuật này không thể áp
dụng rộng rãi trong một số lượng lớn cá thể.
Ngoài ra, còn có một số kỹ thuật khác đang được
phát triển như phân tích dựa trên enzyme cắt
giới hạn (RFLP) hay phân tích đường cong nóng
chảy (HRM) lại yêu cầu nhiều thời gian để tối ưu
hóa, đòi hỏi những thiết bị và hóa chất đắt tiền,
không phù hợp với các nước đang phát triển(1,14).
Tetra-primer
amplification
refractory
mutation system (Tetra-ARMS hoặc T-ARMS) là
một sự kết hợp của Tetra-ARMS và kỹ thuật
ARMS thông thường(5,16). Đây là một phương
pháp đáp ứng được các tiêu chí được đặt ra (giá

thành thấp, không phức tạp, không đòi hỏi thiết
bị đắt tiền và đảm bảo độ chính xác cao). Kỹ
thuật này bao gồm một phản ứng PCR theo sau
là phân tích bằng điện di. Phản ứng PCR được
vận hành chỉ trong một eppendorf nhỏ sử dụng
đồng thời 2 cặp mồi đặc hiệu: một bộ mồi (mồi
bên trong) được thiết kế và đặc hiệu cho khu vực
đa hình, trong khi bộ còn lại (mồi bên ngoài) là
để làm tham chiếu chuẩn trong phản ứng PCR.
T-ARMS PCR có cải tiến hơn với hai mồi bên
trong và thêm một nucleotide không liên kết đặt
tại nucleotide số 2 ở đầu 3’ (Hình 1). Trong
những năm gần đây, phương pháp này đã được
sử dụng bởi các nhà khoa học trên thế giới vào
việc xác định đột biến điểm bằng cách sử dụng
chỉ một phản ứng PCR duy nhất để có thể phát
hiện cả hai alen, mà không cần dùng enzyme
hạn chế. Đặc biệt hơn, phương pháp này có thể

300

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
phân biệt chính xác kiểu gene đồng hợp hay dị
hợp tử.
Tetra-ARMS PCR có thể giúp chúng ta giảm
số lượng phản ứng và chi phí vì chỉ có một phản
ứng PCR được thực hiện cho từng mẫu. Vì vậy,
mục tiêu chính của nghiên cứu này là tối ưu hóa
phương pháp Tetra-ARMS PCR để phát hiện đột
biến Canton, sau đó so sánh độ đặc hiệu và độ

nhạy của phương pháp với ARMS truyền thống.
Kết quả của phương pháp này sẽ là điều kiện
tiên quyết để phát triển các xét nghiệm phân tử
với độ đặc hiệu cao và chi phí hiệu quả cho việc
xác định kiểu gene gây bệnh đột biến của bệnh
thiếu men G6PD ở quy mô lớn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượng và phương pháp thu thập mẫu
Đối tượng của nghiên cứu này là quần thể
người Kinh bị thiếu men G6PD. Mẫu máu khô từ
các em bé sơ sinh tại bệnh viện Phụ Sản Từ Dũthành phố Hồ Chí Minh được thu thập và kiểm
tra mức độ hoạt động của enzyme cũng như các
biểu hiện lâm sàng đặc trưng và được tuyển
chọn bởi các bác sĩ của bệnh viện. Tất cả các mẫu
thu thập đều có phiếu đồng thuận từ bố mẹ của
các em tham gia và được lưu trữ lại tất cả các
thông tin dữ liệu lâm sàng.

Tách chiết DNA bộ gene
DNA bộ gen được tách bằng bộ kit QIAamp
DNA Mini Kit của hãng Qiagene với một số chỗ
điều chỉnh để lượng DNA tách chiết từ máu khô
cao hơn.

Tối ưu hóa thành phần và quy trình nhiệt
cho Tetra-ARMS PCR
Để tầm soát đột biến Canton, một bộ bốn
mồi đặc biệt đã được thiết kế bằng phần mềm
Primer1(16) để khuếch đại 3 phân đoạn của gen

G6PD có kích thước từ 200-800bp. Mồi xuôi và
mồi ngược bên trong được dùng để phát hiện
alen đột biến, trong khi mồi xuôi và mồi ngược
bên ngoài dùng cho alen không bệnh, đồng thời
làm khuôn cho hai mồi bên trong và sản xuất ra
sản phẩm PCR có chứa đột biến. (Hình 2)


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Nghiên cứu Y học

Hình 2: Vị trí bốn mồi trên gen G6PD
Trong quá trình nghiên cứu, từng điều
kiện: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ
DNA được điều chỉnh nhằm tối ưu hoá phản
ứng và để đảm bảo chất lượng sản phẩm cho
bước chạy PCR trên 30 mẫu. Phản ứng PCR
được thực hiện trên hệ thống máy
Eppendorf® PCR (6325ZH804133). Thành
phần cho mỗi phản ứng PCR bao gồm: 2,5ul
của mồi xuôi và ngược bên ngoài 10uM – 0,5ul
của mồi xuôi bên trong 10uM - 1ul của mồi

ngược bên trong 10uM - 12,5ul TopTaq Master
Mix 2x (của hãng Thermo Scientific) - khoảng
150ng DNA và thêm nước cho đủ 25ul. Chu
trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 1 bước
biến tính ở 95oC cho 4 phút; và được theo sau
bởi 40 chu kỳ gồm 3 bước: 95oC trong 30 giây,

nhiệt độ bắt cặp (Ta) trong 30 giây, 72oC trong
1 phút; 1 bước kéo dài cuối cùng tại 72oC trong
10 phút. Bảng 1 dưới đây thể hiện nhiệt độ bắt
cặp (Ta) của mỗi phản ứng khuếch đại.

Bảng 1. Trình tự của 2 cặp mồi và nhiệt độ bắt cặp (Ta) được dùng để khuếch đại 3 phân đoạn gen G6PD đồng
thời để phục vụ cho việc giải trình tự
Tên của Primer
Outer Forward
Outer Reverse
Inner Forward
Inner Reverse

Trình tự của primers (5’-3’)
5’- ATCTTCCACCAGCAGTGCAAGC-3’
5’- GTAGGTGCCCTCATACTGGAAC-3’
5’- GTCCCCTCAGCGACGAGCTTCT-3’
5’- GGTGAAAATACGCCAGGCCTTAC-3’

Chiều dài của sản phẩm PCR
Chứng nội: 750 bp
Alen G: 530 bp
Alen T: 265 bp

Tm
o
69,7 C
o
70,0 C
o

72,0 C
o
68,1 C

Ta
o

64 C

Hình 3: Sản phẩm PCR được phân tích trên gel. 3 vạch biểu thị cho kiểu gen dị hợp tử (GT), 2 vạch cho kiểu gen
đồng hợp tử (GG hoặc TT)

301


Nghiên cứu Y học
Sau đó, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng
điện di trên 1,5% agarose gel có chứa Ethidium
Bromide và kích thước của những sản phẩm
PCR mong muốn là 750bp cho đoạn tham chiếu
chuẩn, 530bp cho đoạn khuếch đại có alen G và
265bp cho đoạn khuếch đại có alen T sẽ được
đọc dưới tia tử ngoại. Kết quả chỉ được đọc nếu
có băng chứng nội hiển thị.
Sự hiện diện của 3 vạch trên gel cho thấy
kiểu gen dị hợp tử (GT) và 2 vạch cho thấy kiểu
gen đồng hợp tử (GG hoặc TT). (Hình 3)

Đánh giá hiệu quả hai phương pháp
Để so sánh độ đặc hiệu và độ chính xác giữa

ARMS thông thường và Tetra-ARMS, quy trình
PCR đã tối ưu hoá được áp dụng cho TetraARMS trên 30 mẫu G6PD bệnh, sau đó kết quả
kiểu gen các mẫu Tetra-ARMS sẽ được đem so
sánh với cùng những mẫu đó đã thực hiện bằng
phương pháp ARMS(8). Những mẫu không trùng
khớp về kiểu gen sẽ được đem giải trình tự DNA
để có thể kết luận về độ chính xác giữa hai
phương pháp. Dùng hai mồi ngoài xuôi và
ngược trong bộ bốn mồi của Tetra-ARMS để
phục vụ cho việc giải trình tự gen (Outer
forward và outer reverse, với kích thước sản
phẩm là 750bp). Phản ứng giải trình tự sử dụng
bộ Kit “ABI prism BigDye Terminator cycle
sequencing ready reaction” và tiến hành trên hệ
thống 3130xl Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, France).
Kết quả của quá trình giải trình tự được
phân tích bằng phần mềm SeqScape v2.5. Trình
tự của ba phân đoạn gen được so sánh với trình
tự của gen G6PD trên Ensemble (số Accession
No.ENSG00000160211) để xác định các đột biến.

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015

Hình 4: Kết quả xác định kiểu gen ở một số mẫu bằng
phương pháp Tetra-ARMS. Vạch trên cùng là vạch
chứng nội ở 750bp. Vạch ở giữa(530bp) và vạch dưới
cùng (265bp) là hai vạch biểu thị cho alen G và alen T
của đột biến Canton
Hình 4 cho thấy kết quả xác định kiểu gen

của một số mẫu tiêu biểu của hai phương pháp.
Các vạch điện di đều rõ nét, đúng kích thước,
không có sản phẩm phụ không đặc hiệu. Điều
đó chứng tỏ các cặp mồi được sử dụng là đặc
hiệu và các điều kiện của phản ứng PCR đã được
tối ưu hóa.
Bảng 2: Bảng thống kê số mẫu giống/khác nhau và
tần số của mẫu không khớp trên tổng số
ARMS PCR
Tetra-ARMS PCR
Kết quả trùng khớp
Kết quả không trùng khớp

YG GG
14
0
14
4
26/30
4/30

YT
11
11

TT GT
0
5
0
1

86,67%
13,33%

Sau khi phân tích có 4 mẫu khác và 26 mẫu
giống nhau về kiểu gen giữa hai phương pháp.
Như vậy 13,33% là các mẫu khác kiểu gen trên
tổng số 30 mẫu bệnh (Bảng 2).

Đánh giá hiệu quả của Tetra-ARMS PCR

Xác định kiểu gen

Bốn mẫu của Tetra-ARMS cho thấy kết quả
khác với ARMS được giải trình tự để kiểm tra
kiểu gen chính xác và rút ra kết luận cuối cùng.
ARMS PCR hiển thị bốn mẫu này có kiểu gen dị
hợp tử (GT), trong khi đó, kết quả của T-ARMS
PCR đọc được trên gel là đồng hợp tử (GG) cho
cả bốn mẫu.

Quy trình Tetra-ARMS PCR đã tối ưu hoá
được áp dụng trên 30 mẫu bệnh G6PD, dùng 3
mẫu đã biết kiểu gen YG, YT và GT làm đối
chứng dương để xác định 2 alen của đột biến
Canton.

Hình sắc ký trình tự DNA rất rõ ràng, không
bị nhiễu và đã khẳng định rằng kết quả hoàn
toàn phù hợp với kết quả của Tetra-ARMS. Chỉ
có một đỉnh màu đen đại diện cho các nucleotide

G xuất hiện tại vị trí điểm đột biến hiển thị trên

KẾT QUẢ

302


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
hình. Điều này có nghĩa rằng chỉ có các
nucleotide G có mặt tại vị trí đó, vì thế nó có kiểu
gen GG. Do đó, kết quả T-ARMS PCR là chính
xác 100% với kết quả giải trình tự DNA (hình 4).

Hình 4: Kết quả giải trình tự
Ngoài ra, độ nhạy và độ đặc hiệu của hai
phương pháp cũng được tính toán theo thống kê
của mẫu có mang alen bệnh, không mang alen
bệnh và tổng số từng loại. Mặc dù ARMS thông
thường và Tetra-ARMS có cùng chỉ số độ nhạy
(1,0), nhưng độ đặc hiệu của ARMS chỉ đạt 0,778
trong khi T-ARMS lại tiếp tục đạt chỉ số tối đa là
1,0 (bảng 3). Như vậy có thể chắc chắn rằng độ
đặc hiệu của phương pháp Tetra-ARMS cao hơn
so với ARMS truyền thống và đủ độ tin cậy để
phát triển xa hơn trong tương lai.
Bảng 3: Bảng thống kê các mẫu bệnh/không bệnh,
tổng số từng loại, chỉ số nhạy và đặc hiệu của ARMS
và Tetra-ARMS

THẢO LUẬN

Với mục tiêu tầm soát đột biến Canton xuất
hiện trên gen G6PD trong quần thể người KinhViệt Nam, trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ

Nghiên cứu Y học
thực hiện trên những bệnh nhân thiếu men
G6PD mà không tiến hành trên nhóm chứng
(những người khỏe mạnh). Nguyên nhân của
việc này là vì theo nhiều nghiên cứu trước đây
thì đột biến gen là nguyên nhân gây bệnh thiếu
men G6PD, do đó việc khảo sát trên nhóm bệnh
sẽ làm tăng xác suất bắt gặp các đột biến hơn so
với nhóm đối chứng. Nhằm góp phần hoàn
chỉnh cơ sở dữ liệu về đột biến G6PD trên quần
thể người Kinh tại thành phố Hồ Chí Minh và
phát triển một phương pháp chẩn đoán bệnh
hiệu quả mà tiết kiệm và nhanh chóng hơn so
với các phương pháp truyền thống khác, nghiên
cứu này tập trung vào việc tối ưu hoá quy trình
PCR của Tetra-ARMS và xác thực độ đặc hiệu
cũng như tính chính xác của kỹ thuật này đối với
đột biến Canton (G1376T).
Nghiên cứu này được tiến hành để điều tra
độ đặc hiệu và độ chính xác của phương pháp
Tetra-ARMS-PCR so với ARMS PCR thông
thường dựa trên kết quả kiểm lại bằng giải trình
tự DNA - một phương pháp tiêu chuẩn trong
việc xác định đột biến. Trong số 30 mẫu đã biết
kiểu gen bằng ARMS từ nghiên cứu trước đó(8),
chỉ có bốn mẫu có kết quả mâu thuẫn giữa
ARMS thường và Tetra-ARMS được quan sát.

Tất cả các kết quả không khớp đều mang kiểu
gen dị hợp tử dưới sự phát hiện của ARMS PCR,
nhưng phương pháp truyền thống này đã không
chẩn đoán một cách chính xác dù chỉ một trong
số bốn mẫu vì khi so sánh với sắc ký đồ của trình
tự DNA, kết quả đúng phải là kiểu gen đồng
hợp tử.
Nguyên tắc của phản ứng trong ARMS-PCR
là dựa trên tính đặc hiệu của mồi trong phản
ứng PCR. Để xác định một đột biến điểm, cần
phải thiết kế 3 mồi. Trong đó một mồi được sử
dụng chung cho cả mẫu bình thường và mẫu có
đột biến, có thể là mồi xuôi hoặc mồi ngược. Hai
mồi còn lại có trình tự giống nhau, trừ vị trí
nucleotide ở đầu tận cùng 3’. Mồi bình thường
có trình tự nucleotide ở đầu tận cùng 3’ bổ sung
với trình tự DNA của người bình thường. Mỗi
đột biến có nucleotide ở đầu tận cùng 3’ bổ sung

303


Nghiên cứu Y học
với trình tự DNA của người có loại đột biến
điểm đó. Theo nguyên tắc này, mồi bình thường
chỉ khuếch đại đoạn DNA của người bình
thường mà không khuếch đại đoạn DNA của
người có đột biến; và ngược lại mồi đột biến chỉ
khuếch đại đoạn DNA của người có đột biến mà
không khuếch đại đoạn DNA của người bình

thường. Như vậy, phương pháp này chỉ thành
công khi chúng ta thiết kế được mồi đặc hiệu
hoàn toàn với DNA đích ở đầu 3’. Do đó, kết quả
xác định kiểu gen có sai sót chắc chắn là vì mồi
đột biến không hoàn toàn hoạt động hiệu quả
cho alen đột biến. Mặc dù ARMS PCR vẫn có thể
hiệu chỉnh thêm các nucleotide gần đầu 3’ của
mồi nhưng sẽ tốn thời gian và không đảm bảo có
thể phân biệt chính xác kiểu gene đồng hợp hay
dị hợp tử.
Nhìn từ kết quả thực tế, ARMS PCR cho thấy
cả bốn kiểu gen dị hợp tử trong khi tất cả chúng
phải là đồng hợp tử. Điều này đã cho thấy độ
đặc hiệu của ARMS thấp hơn so với Tetra-ARMS
– kỹ thuật xác định chính xác bốn kiểu đồng hợp
tử từ bốn mẫu không khớp kết quả. Rõ ràng
phương pháp ARMS thông thường có độ chính
xác và độ tin cậy thấp hơn so với Tetra-ARMS,
đặc biệt khi xác minh các trường hợp có kiểu gen
đồng hợp.
Như vậy, có thể nhận thấy phương pháp
Tetra-ARMS có sự vuợt trội hơn so với phương
pháp ARMS thông thường. Trong phạm vi
nghiên cứu của đề tài trên 30 trẻ sơ sinh, khi so
sánh với kết quả của ARMS và kiểm tra lại bằng
giải trình tự gen trực tiếp thì kết quả hoàn toàn
trùng khớp và chính xác. Đó là minh chứng rõ
ràng nhất cho độ tin cậy của phương pháp TetraARMS. Vì vậy mà Tetra-ARMS ngày càng được
áp dụng rộng rãi không chỉ trong các lab mà còn
trên thực tế lâm sàng, không chỉ trong xác định

đột biến điểm gây thiếu men G6PD mà còn
trong các bệnh như β - thalassemia, xác định tính
đa hình của HLA, apoprotein E trong bệnh
Alzeimer.
Từ đó, phương hướng của chúng tôi trong
những nghiên cứu tiếp theo là thiết kế các cặp

304

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
mồi tương ứng với các vị trí đột biến điểm khác
trên gen G6PD gây thiếu men enzyme G6PD.
Với thời gian ngắn để đạt được kết quả, sẽ rất
thuận lợi cho bệnh nhân và người nhà khi có
nhu cầu xác định đột biến gây bệnh, sàng lọc
trước sinh, chẩn đoán sàng lọc sau sinh, tư vấn
di truyền, tư vấn tiền hôn nhân. Đồng thời, đối
với nghiên cứu trong tương lai, tiến hành thực
hiện trên một cỡ mẫu lớn hơn - kiểm tra trên một
số lượng lớn các mẫu sẽ là công việc cần thiết để
tìm mối liên quan giữa các đột biến điểm khác
với bệnh thiếu men G6PD ở Việt Nam và phát
triển tiềm năng của Tetra-ARMS PCR để trở
thành một phương pháp chẩn đoán sử dụng
rộng rãi trong tương lai.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu
hóa thành công một quy trình cho Tetra-ARMS
PCR để tầm soát đột biến Canton - dạng đột biến

điểm thay thế nucleotide G ở vị trí 1376 thành T
trên cDNA - trong các mẫu DNA của các bệnh
nhân thiếu men G6PD ở Việt Nam. Phương
pháp này vừa tiết kiệm và hiệu quả vì không
những tiết kiệm được thời gian và hoá chất, mà
kết quả đánh giá phương pháp từ nghiên cứu
này cũng giúp cho các cải tiến mới sau này. So
với các phương pháp khác, đặc biệt ARMS PCR,
T-ARMS PCR là một kỹ thuật tiết kiệm thời gian,
linh hoạt hơn trong khâu chuẩn bị PCR và hiệu
quả trong chi phí. Căn cứ vào các kết quả trong
nghiên cứu này, nên nghĩ đến việc phát triển
Tetra-ARMS trong chẩn đoán trước sinh và tư
vấn di truyền, tư vấn tiền hôn nhân. Áp dụng
phương pháp Tetra-ARMS - PCR trong sàng lọc
trẻ sơ sinh để phát hiện bệnh sớm, từ đó có biện
pháp dự phòng thích hợp, đặc biệt đối với trẻ
nữ. Nếu chỉ đơn thuần đo hoạt tính của enzyme
G6PD, chúng ta dễ dàng bỏ sót các trường hợp
nữ dị hợp nhưng có hoạt tính của enzyme G6PD
trong giới hạn bình thường.
Cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn các bác sĩ và
bệnh nhân tại bệnh viện Từ Dũ đã tham gia trong nghiên
cứu này. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Trường Đại học
Quốc tế, ĐHQG - HCM trong đề tài mã số T2014-16-BT.


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

5.

6.
7.
8.

9.

Mason PJ, Bautista JM and Gilsanz F, (2007) G6PD deficiency:
the genotype-phenotype association. Blood Rev. 21(5): p. 267-83.
Matsuoka H et al. (2007) Seven different glucose-6-phosphate
dehydrogenase variants including a new variant distributed in Lam
Dong Province in southern Vietnam. Acta Med Okayama. 61(4):
p. 213-9.
Minucci A et al. (2012) Glucose-6-phosphate dehydrogenase
(G6PD) mutations database: review of the "old" and update of the
new mutations. Blood Cells Mol Dis. 48(3): p. 154-65.
Newton CR et al. (1989) Analysis of any point mutation in DNA.
The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic
Acids Res. 17(7): p. 2503-16.
Nguyen Thi Hue et al. (2013) Common mutations in G6PD of
Vietnamese-Kinh deficient patients. African Journal of
Biotechnology. 12(12): p. 1318-1325.
Nguyen Thi Hue et al. (2013) The Canton mutation in G6PD

deficient Vietnamese. Wulfenia Journal. 20(11): p. 229-249.
Nguyen Thi Hue et al. (2013) The Viangchan-G6PD Mutation in
Vietnamese-Kinh. Int J Hum Genet. 13(2): p. 85-92.
Noori-Daloii MR and Daneshpajooh M, (2008) Molecular basis
of G6PD deficiency: current status and its perpective. Acta Medica
Iranica. 46(3): p. 167-182.
Peters AL and Van Noorden CJ, (2009) Glucose-6-phosphate
dehydrogenase deficiency and malaria: cytochemical detection of
heterozygous G6PD deficiency in women. J Histochem Cytochem.
57(11): p. 1003-11.

Nghiên cứu Y học
10.

11.
12.

13.

14.

15.

16.

Tagarelli A et al. (2006) Reliability of quantitative and qualitative
tests to identify heterozygotes carrying severe or mild G6PD
deficiency. Clin Biochem. 39(2): p. 183-6.
Verle P et al. (2000) Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency
in northern Vietnam. Trop Med Int Health. 5(3): p. 203-6.

Weiying J, Guolong Y, and Peng L. (2006) Structure and
function of glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency variants in
Chinese population. Hum Genet. 119: p. 463-487.
Wittwer CT. (2009) High‐resolution DNA melting analysis:
advancements and limitations. Human mutation. 30(6): p. 857859.
Wolf BH et al. (1987) Detection of glucose-6-phosphate
dehydrogenase deficiency in erythrocytes: a spectrophotometric assay
and a fluorescent spot test compared with a cytochemical method.
Clin Chim Acta. 168(2): p. 129-36.
Ye S, Humphries S and Green F, (1992) Allele specific
amplification by tetra-primer PCR. Nucleic Acids Res. 20(5): p.
1152.
Ye S et al. (2001) An efficient procedure for genotyping single
nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29(17): p. E88-8.

Ngày nhận bài báo:

25/05/2015

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

09/06/2015

Ngày bài báo được đăng:

05/09/2015

305