Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại viện khoa học hình sự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

Học viên:
Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60 42 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Hà

HÀ NỘI - 2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>
HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN

–

PGS.
–

–

tôi

nghiên cứu và

này.
Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo

Tôi xin ch
Trung Tâm và toàn thể
–

–
.

.

.
11 năm 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

M
................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................6
1. Một số vấn đề về giám định gen ti thể ...............................................................6
.........................................6
1.2. Khái niệm về giám định gen ti thể ..................................................................7
1.3. Cơ sở khoa học và thực tiễn ............................................................................7
1.3.1. Ti thể và hệ gen ti thể ...............................................................................7
1.3.2. Cơ sở khoa học của giám định gen ti thể ...............................................10
1.4. Dị chất (heteroplasmy) trong ti thể ...............................................................15

1.5. Vùng chỉ thị ADN ti thể (vùng có tính đa hình cao) và các phương pháp
giám định ADN ti thể ...........................................................................................15
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về lĩnh vực liên quan đến đề tài .17
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................17
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................18
NG PHÁP NGHIÊN CỨU ................22
..............................................................................................................22
1.1. Thiết bị ...........................................................................................................22
1.1.1 Th

....................................................................................22
...................................................................................................23

1.2. Hóa chất .........................................................................................................23
2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................23
2.1. Phương pháp làm sạch mẫu ..........................................................................24
2.2. Phương pháp nghiền mẫu..............................................................................24
2.3. Phương pháp tách chiết ADN ti thể ..............................................................24
2.4. Phương pháp tinh sạch ADN ti thể ...............................................................25
2.5. Phương pháp định lượng ADN ti thể............................................................25
2.6. Phương pháp PCR .........................................................................................25
2.7. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR, gắn BigDye ...................................26
2.8. Phương pháp chạy điện di, giải trình tự ADN ti thể ....................................26
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2.9. Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng và xương người..26
2.9.1. Tối ưu hóa nồng độ chelex 100TM ........................................................26
......................................27

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN...........................28
1. Kết quả nghiên cứu..........................................................................................28
1.1. Kết quả tách chiết ADN ti thể .......................................................................28
1 đến 5 năm): ............28
từ 5 đến 10 năm): ..........29
1.2. Kết quả tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng và
xương người..........................................................................................................30
1.2.1. Kết quả tối ưu hóa nồng độ Chelex 100TM ..........................................30
..........................31
.......................32
1.3.1. Làm sạch mẫu răng và xương ................................................................32
1.3.2. Nghiền mẫu răng và xương ....................................................................32
1.3.3. Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng chelex 100™................33
1.3.4. Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng tách hữu cơ ..................33
1.3.5. Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng Kit Prepfiler .................34
1.3.6. Tinh sạch ADN sử dụng bộ kit DNA IQTM System ............................36
1.3.7. Định lượng ADN sử dụng bộ kit Human DNA Quantification ............36
1.3.8. Chuẩn bị và chạy phản ứng Nested PCR nhân bội sản phẩm ADN .....37
1.3.9. Phản ứng Sequencing (gắn Big Dye) .....................................................38
1.3.10. Chuẩn bị mẫu cho điện di giải trình tự.................................................38
1.3.11. Giải trình tự trên máy ABI 310 ............................................................39
..........................................................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................43
1. Kết luận:............................................................................................................43
2. Kiến nghị: .........................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................45
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

- ADN

: Axit deoxyribonucleic

- ARN

: Axit ribonucleic

- CSĐT

: Cảnh sát điều tra

- DTT

: Dithiothreitol (tên hoá chất)

- KHHS

: Khoa học hình sự

- PCR

: Polymerase chain reaction (phản ứng nhân bội gen)

- PrK

: Proteinaza K

- STR

: Short tandem repeat (đoạn lặp lại ngắn)

- TS

: Tiến sĩ

- VNTR : Variable number of tenderm repeat (đoạn lặp có độ dài
trung bình)
-X
-R

: xương
: răng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Số hiệu bảng

Tên Bảng

1.1
3.1

Trang
12

Kết quả định lượng 3 phương pháp tách chiết đối với

28

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm)
3.2

Kết quả định lượng 3 phương pháp tách chiết đối với

30

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm)
3.3

Kết quả định lượng tối ưu hoá nồng độ chelex đối với

31

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm)
3.4

Kết quả định lượng tối ưu hoá thể tích d/d hạt từ đối

32

với mẫu răng, xương(thời gian chôn cất từ 5-10 năm)

HÌNH
Số hiệu hình

Tên hình

Trang

1.1

Ti thể trong tế bào người

8

1.2

Cấu trúc hệ gen ti thể người

11

1.3

Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ti thể

14

inheritance (maternal)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

:
Giám định gen
90

20
không chỉ khắc phục được

những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học trước đây mà còn giải
quyết được những vụ án bế tắc trước đó, những vụ án mà ADN là bằng chứng
duy nhất. Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cá thể người,
xác định huyết thống cha-con, xác định hài cốt…

giám định gen

tách chiết ADN nhân trong
máu, lông, tóc, tế bào niêm mạc miệng....Tuy nhiên, trong
công tác giám định kỹ thuật hình sự nói chung và đặc biệt là giám định ADN
hình sự nói riêng, đối tượng giám định thường là những mẫu vật đã ít nhiều
biến tính không còn nguyên vẹn nhiều khi chỉ là một chiếc răng hoặc một
mảnh xương gẫy vỡ lẫn trong môi trường tự nhiên một thời gian dài, với
những mẫu vật như vậy ADN nhân tế bào hầu như không còn tồn tại, để giải
quyết các yêu cầu điều tra đặt ra là xác định tung tích nạn nhân, đòi hỏi phải
tiến hành giám định ADN ti thể. Năm 2003 Viện Khoa học hình sự (KHHS)
được viện trợ một máy giải trình tự nhằm nâng cao năng lực giám định ADN
tại Viện, khi chuyển giao công nghệ các chuyên gia có giới thiệu về phương
pháp giám định ADN ti thể với một số hóa chất và thiết bị phụ trợ do họ sản
xuất, sau khi được tiếp cận với phương pháp giám định ADN ti thể mặc dù
chưa được trang bị hoàn chỉnh, thiếu qui trình chuẩn nhưng trước đòi hỏi ngày

càng cấp thiết của công tác điều tra phá án, phòng giám định gen Viện KHHS
đã vừa làm, vừa học thực hiện thành công một số vụ giám định ADN ti thể
nhưng kết quả nhiều khi không ổn định do chưa có qui trình phù hợp từ khâu

Nguyễn Xuân Quyền

1

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

xử lý mẫu đến tách chiết, tinh sạch ADN ti thể. Tham khảo một số phương
pháp tách chiết ADN ti thể cả trong và ngoài nước nhận thấy có những
phương pháp tách chiết tận thu được ADN ti thể, bảo đảm chất lượng cho
phản ứng nhân gen (PCR) và giải trình tự, xong đều không phù hợp với điều
kiện chất lượng mẫu vật gửi giám định ADN ti thể ở nước ta hoặc cả về thời
gian tính, giá thành cũng như

.C

, các phương pháp tách chiết ADN ti thể thực hiện tại Viện KHHS - Bộ
không cho kết quả ổn định bởi vì đây là những phương pháp

Công an

được ứng dụng tự phát mang tính chất thăm dò và

, chưa đồng bộ

và có tính rủi ro cao, chưa trở thành quy trình chuẩn để áp dụng rộng rãi,
trong khi yêu cầu giám định ADN ti thể từ các mẫu răng và xương người
nhằm giải quyết các vụ án ngày một cao[16]. Theo thống kê tại phòng thí
nghiệm giám định gen tại Viện KHHS cho thấy năm 2004 có 4 yêu cầu, năm
2005 có 7 yêu cầu, năm 2006 có 12 yêu cầu, năm 2007 có 14 yêu cầu
17 yêu cầu

20 yêu cầu và năm 2012 là 22 yêu cầu với số

lượng ngày một nhiều
10 năm.
,

:

“Tối ƣu hoá phƣơng pháp tách chiết ADN
phục vụ công tác

từ răng, xƣơng ngƣời
–

”.
:

1. Đề tài hoàn thành sẽ đưa ra phương pháp tách chiết ADN ti thể hoàn
chỉnh từ mẫu răng và xương người ,

tối ưu

t

phù hợp với điều kiện phßng thÝ nghiÖm hiÖn cã t¹i ViÖn KHHS.
2. Góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể từ các mẫu
xương, răng người và

sẽ là quy trình chuẩn được áp

dụng để giám định ADN ti thể phục vụ giải quyết các vụ án hình sự cũng

Nguyễn Xuân Quyền

2

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

như các yêu cầu dân sự. hoàn thiện hoá tính pháp lý của các quy trình
giám định ADN hình sự.
3. Hoàn thiện cơ sở lý luận về giám định ADN nói chung và ADN ti thể
nói riêng phục vụ cho công tác thực tiễn cũng như nghiên cứu và giảng dạy.
2. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN ti thể khác
nhau trên các mẫu răng, xương thu từ 02 bộ hài cốt người
1-5 năm và từ 5-10 năm.
- ADN tổng số bao gồm cả ADN nhân và ADN ti thể, trong khuôn khổ hạn
hẹp của đề tài, chúng tôi chỉ đặt ra mục tiêu và tập trung tối ưu hoá phương
pháp tách chiết ADN ti thể, để thu được lượng ADN ti thể có chất lượng cao
nhất, thu từ 02 bộ hài cốt người
1-5 năm và từ 5-10 năm, với tổng số 12 mẫu nghiên cứu là bột
răng và xương

phục vụ cho quá trình thực nghiệm.

- Quá trình nghiên cứu được tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện KHHS.
3. Nội dung nghiên cứu
Tham khảo tài liệu, dựa trên nguyên lý tách chiết ADN; nghiên cứu các
phương pháp tách chiết đang được sử dụng đề xuất 3 phương pháp tách chiết
có tính ưu việt khác nhau để tiến hành thử nghiệm đối với 12 mẫu răng xương
hài cốt gửi giám định.
1. Sử dụng 3 phương pháp:
+ Phương pháp 1: sử dụng chelex 100™ ở các nồng độ khác nhau (5%,
10% và 20%)
+ Phương pháp 2: sử dụng hỗn hợp Phenol-clofom-izoaminalcohol theo tỉ
lệ 25:24:1.
+ Phương pháp 3: sử dụng kit tách chiết Prepfiler (ABI System - Mỹ) với tỉ
lệ

Nguyễn Xuân Quyền

là 10µl, 15µl và 20µl.

3

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

* Từ mẫu răng, xương

khoảng

(

từ 1 năm tới 5 năm) trên cùng một vị trí, sau khi nghiền, bột được chia đều
vào 6 ống ependoff 1,5ml để thực hiện đủ cho ba lô nghiên cứu với 3 phương
pháp tách chiết: 1 ống sử dụng chelex 100™ 10%, 1 ống sử dụng phương pháp
tách chiết hữu cơ sử dụng hỗn hợp phenol-clorofom-izoamilalcohol theo tỉ lệ
25:24:1 và 1 ống sử dụng bộ kit tách chiết Prepfiler với
là 10µl. như vậy trong mỗi lô, cả 3 phương pháp tách chiết đều
được tiến hành trên xương, răng của cùng một người với số lượng và chất
lượng như nhau. đây là điều kiện cần thiết để đánh giá, so sánh chính xác hiệu
quả của từng phương pháp tách chiết, tiến hành thực nghiệm 3 lần. Từ đó
.
* Từ mẫu răng, xương

khoảng từ 5

(

năm tới 10 năm) cũng sử dụng phương pháp tách chiết như trên để đánh giá
tối ưu được phương pháp tách chiết nào là hiệu quả nhất
.
2. Sản phẩm tách chiết được tinh sạch bằng kit tinh sạch IQ SystemTM và
định lượng bằng phương pháp Real-time PCR. Mỗi lô sau khi tách chiết ADN
bằng 3 phương pháp khác nhau sẽ được chạy phản ứng PCR tất cả các mẫu để
nhân bội đoạn HVI hoặc HVII.
3.Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi các phương pháp khác nhau được so
sánh, đánh giá bằng hình ảnh điện di đồ trên máy ABI 310 từ đó rút ra
phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất.
4. Đánh giá tổng kết rút ra phương pháp tách chiết tối ưu.
5. Hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể đạt tiêu chuẩn trong khuôn
khổ đề tài.

Nguyễn Xuân Quyền

4

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG THỂ VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN

Nguyễn Xuân Quyền

5

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Một số vấn đề về giám định gen ti thể
1.1
Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người,
trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể được xếp thành
23 cặp tương đồng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể
giới tính. Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn
bội). Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và
23 nhiễm sắc thể từ

. Có
nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận biết qua vân
tay, nhận biết các yếu tố di truyền có bản chất là protein (xác định nhóm máu,
xác định một số yếu tố trong huyết thanh, xác định một số emzym) nhưng nói
chung khả năng phân biệt còn thấp. Phải đến cuối thế kỉ 20, đặc biệt là thập
kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sự mới ứng dụng công nghệ gen (ADNTechnology) vào trong xác định tội phạm. Năm 1984 Alec Jeffreys và các
cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khi nghiên cứu các đoạn ADN mã
hoá cho hemoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự các bazơnitơ

được lặp lại một số lần với chiều dài trong đoạn lặp từ 10-15 bp các đoạn lặp
này được gọi là tiểu vệ tinh (minisattelite), ông cũng phân lập được hai đoạn
và nhân bội chúng sử dụng là đầu dò (probe) đ phát hiện ra những vùng gọi
là vùng biến thể cao ở cá vật liệu di truyền khác nhau. Đây được coi là bước
ngoặt trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và sinh
học hình sự nói riêng. Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào
và ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người. Điều đáng chú ý là số lần lặp
lại trong các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau là khác nhau. Đây được coi

Nguyễn Xuân Quyền

6

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

là đặc điểm quan trọng phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá
thể). Giám định gen cho mục đích tư pháp bắt đầu từ đây.
1.2. Khái niệm về giám định gen ti thể
Trong mỗi cơ thể sinh vật, mọi tổ chức mô, các cơ quan đều được hình
thành từ những đơn vị nhỏ nhất là tế bào, ADN chủ yếu có trong nhân tế bào,
ngoài ra trong ti thể – một bào quan ở ngoài nhân cũng có chứa ADN được
gọi là ADN ti thể. Giám định ADN nhân tế bào trong sinh học pháp lí hiện
nay là khai thác tính đa hình về các đoạn lặp (VNTRS, STRS) và đa hình về
trình tự nucleotit (SNPS) trong cấu trúc ADN của hệ gen nhân tế bào. Đối với

giám định ADN ti thể, người ta đi sâu vào phân tích những thay đổi trình tự
nucleotit trong hệ gen ADN ti thể ở các mẫu sinh học cần giám định ADN ti
thể. Do vậy ta có thể định nghĩa giám định ADN ti thể là phân tích và so sánh
trình tự nucleotit của ADN ti thể trong dấu vết, mẫu vật sinh học hoặc trong
các cá thể người khác nhau để tìm ra mỗi liên quan giữa chúng trong các vụ
án hình sự, dân sự và xác định tung tích nạn nhân, truy tìm hài cốt[9;12;16].
1.3. Cơ sở khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ti thể và hệ gen ti thể
Trong mỗi cơ thể sinh vật, mọi tổ chức mô, các cơ quan đều được hình
thành từ những đơn vị nhỏ nhất là tế bào, ADN chủ yếu có trong nhân tế bào,
ngoài ra trong ti thể (mitochondria) - một bào quan ở ngoài nhân tế bào cũng
có chứa ADN được gọi là ADN ti thể, ADN ti thể có dạng hình gậy hoặc hình
hạt nằm trong nguyên sinh chất của tế bào, ti thể có vai trò quan trọng trong
việc tạo năng lượng phục vụ cho mọi hoạt động sống của tế bào. Số lượng ti
thể trong các loại tế bào không cố định, có thể từ 200-300 hoặc tới hàng nghìn
phụ thuộc vào loại tế bào. Hệ gen ti thể là một cấu trúc tạo bởi ADN hai sợi
khép kín tạo thành vòng tròn định vị trong ti thể. Trình tự nucleotit của gen ti
thể thường ổn định qua một thời gian dài trong lịch sử tiến hoá và sự khác biệt

Nguyễn Xuân Quyền

7

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

trình tự của gen ti thể giữa các thành viên có quan hệ di truyền theo dòng
mẹ là hiếm[6],[8].

Hình 1.1: Ti thể trong tế bào người
Ở người ADN ti thể chứa nhiều đặc điểm cấu trúc riêng biệt đặc trưng,
cho các cá thể trong một nhóm cá thể có cùng nguồn gốc theo dòng mẹ. Hệ
gen ti thể là hệ gen có tính bảo thủ rất cao, nó bền vững qua các thế hệ khác
nhau, tuy nhiên theo các nghiên cứu cho biết vẫn xảy ra hiện tượng đột biến
trong hệ gen ti thể qua các thế hệ dù tần số đột biến là rất thấp. Cấu trúc ADN
ti thể lần đầu tiên được Anderson và các cộng sự giải trình tự vào năm 1981
tại phòng thí nghiệm của Fredrick Sanger ở Cambridge nước Anh, ngày nay
trình tự gốc này được sử dụng như một trình tự chuẩn để thông qua đó so sánh
trình tự ADN ti thể giữa các mẫu giám định. Trình tự này được gọi là trình tự
Anderson hay trình tự Cambridge. ADN ti thể có giá trị trong khoa học hình
sự vì trong một tế bào số lượng ti thể là rất nhiều (từ 200-300 hoặc nhiều hơn
tuỳ từng loại) trong đó nhân tế bào chỉ có một, cấu trúc ADN ti thể là mạch

Nguyễn Xuân Quyền

8

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

vòng, ngắn tương đối bền vững ít bị phá huỷ trong đó ADN nhân tế bào có
cấu trúc mạch thẳng, rất dài và dễ bị đứt gãy. Kể cả trong điều kiện môi
trường thời tiết không thuận lợi, dưới tác dụng của các Enzym vi khuẩn hoặc
Enzym nội bào cũng như các tác nhân lý hoá khác, ADN nhân dễ bị phân huỷ
hoàn toàn theo thời gian. Trong đó ADN ti thể tồn tại bền vững hơn, có thể
một số ADN ti thể cũng bị phân huỷ song vì mỗi tế bào có rất nhiều ti thể nên
vẫn có thể tách được ADN ti thể từ những ti thể còn nguyên vẹn. Có thể nói,
trong quần thể người ADN ti thể duy truyền nghiêm ngặt theo dòng mẹ, vì khi
thụ thai sau khi đầu tinh trùng chui qua màng trứng thì phần cổ và đuôi sẽ
rụng ra ngoài không chui vào trong trứng, mà ADN ti thể của tinh trùng lại
chủ yếu tập trung ở phần cổ và đuôi. Do đó trứng đã thụ tinh không chứa
ADN ti thể có nguồn gốc từ tinh trùng (người bố) mà chỉ có ADN ti thể của
trứng (người mẹ). Từ tế bào trứng được thụ tinh này, trong quá trình phát triển
chúng được phân chia và nhân đôi lên theo cấp số nhân. Các tế bào mới tạo
thành đều có chứa toàn bộ hệ gen ti thể không thay đổi và có đặc điểm giống
hoàn toàn ADN ti thể trong tế bào trứng của mẹ. Vì trong toàn bộ các tế bào
của thai nhi chỉ chứa ADN ti thể của người mẹ nên sau này ra đời, phát triển,
trưởng thành các tế bào, mô, tổ chức của cơ thể đều có trình tự nucleotit trong
ADN ti thể giống nhau, do đó giám định ADN ti thể có thể là xương, răng,
tóc, máu….Giám định ADN là một phương pháp hữu hiệu để xác định danh
tính một cá thể. Giám định ADN nhân tế bào trong sinh học pháp lý hiện nay
là khai thác tính đa hình về các đoạn lặp STR của ADN nhân tế bào thì giám
định ADN ti thể là phân tích và so sánh trình tự nucleotit vùng D-Loop (vùng
siêu biến) của ADN ti thể trong mẫu răng xương người của các vụ án hình sự,
xác định tung tích nạn nhân, truy tìm danh tính hài cốt. Tuy nhiên, cơ thể con
người sau khi chết sẽ nhanh chóng biến đổi và phân huỷ dẫn tới sự biến tính
cấu trúc ADN trong tế bào. Thời gian càng lâu ADN càng biến tính và mai
một đi đặc biệt là ADN nhân tế bào. Trong những bộ hài cốt lâu năm, ADN
Nguyễn Xuân Quyền

9

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

chỉ tồn tại một lượng không nhiều trong ti thể ở những bộ phận có cấu trúc
bền vững như răng, xương cứng. ADN tồn tại trong các bộ hài cốt bao lâu mà
vẫn có thể phục vụ giám định được phụ thuộc rất nhiều yếu tố như: thời gian,
địa điểm, chôn cất, thể trạng người khi còn sống, tình trạng khi chết (do bệnh
tật, đầu độc…). Với những mẫu gửi giám định là răng, xương việc tách chiết
ADN trong quá trình giám định là vô cùng quan trọng, tách chiết ADN nhân
từ răng, xương người là hết sức khó khăn, bởi ADN nhân đã phân huỷ, biến
tính gần như hết. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN khác
nhau, nhưng qua nghiên cứu chúng tôi thấy chưa có phương pháp nào thật sự
tối ưu. Đề tài đặt ra là nghiên cứu tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN
tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện KHHS
nhằm góp phần tạo ra một phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng,
xương tối ưu nhất.
1.3.2. Cơ sở khoa học của giám định gen ti thể
Ngoài phương pháp xác định tính đa hình các đoạn lặp ngẫu nhiên đối với
hệ gen nhân (STR, VNTR) trong giám định ADN hình sự còn sử dụng tính đa
hình của những nucleotide đơn trong cấu trúc của hệ gen nhân và hệ gen ti thể
để truy nguyên cá thể, chủng tộc và xác định sự di cư của các tộc người trên
thế giới.
Phần lớn hệ gen của người là nằm trong nhân của mỗi tế bào, có cấu trúc

mạch thẳng xoắn kép với chiều dài thường rất lớn, còn trong ti thể ở tế bào
chất của mỗi tế bào hệ gen ti thể (ADN ti thể) có cấu trúc mạch vòng nhỏ. Ở
người, ADN ti thể có 16569 cặp bazơ (nucleotide) trong đó có chứa tổng cộng
37 mã gen mã hóa các sản phẩm, ngoài ra còn có vùng không mã hóa gọi là
vùng kiểm soát hay vùng D - Loop có chứa nhiều đặc điểm cấu trúc ADN
riêng đặc trưng cho các cá thể trong một nhóm cá thể có nguồn gốc theo dòng
mẹ và vì vậy nó được sử dụng cho mục đích giám định hình sự truy nguyên
theo nhóm[7;9;12].
Nguyễn Xuân Quyền

10

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen ti thể người
Hệ gen ti thể là một hệ gen có tính bảo thủ rất cao, nó bền vững qua các thế
hệ khác nhau, tuy nhiên theo các nghiên cứu cho biết, trong hệ gen ti thể
người thì vùng có số biến thể hay tính đa hình cao nhất là vùng HVI và HVII
(vùng siêu biến I và II) nằm trong vùng điều khiển toàn bộ hoạt động của ti
thể (vùng D - Loop).
Cấu trúc ADN ti thể người lần đầu tiên được Anderson và cộng sự giải
trình tự vào năm 1981 tại phòng thí nghiệm của Fredrick Sanger ở Cambridge
nước Anh, ngày nay trình tự gốc này được sử dụng như trình tự chuẩn để
thông qua đó so sánh trình tự ADN ti thể giữa các mẫu giám định. Trình tự

này được gọi là trình tự Anderson hay trình tự Cambridge[12;16].
ADN ti thể có giá trị trong Khoa học hình sự vì chỉ cần một lượng mẫu rất
ít thậm chí hầu hết đã bị biến tính, hư hỏng do điều kiện môi trường vẫn có
thể tách chiết được ADN ti thể và nhân bội sản phẩm đạt kết quả phục vụ
giám định, trong khi đó từ những mẫu này ADN nhân tế bào dường như
không tồn tại. Sở dĩ có hiện tượng này là vì trong một tế bào số lượng ti thể
rất nhiều (từ 200 - 300 hoặc nhiều hơn tùy loại tế bào) trong đó nhân tế bào
chỉ có một, cấu trúc của ADN ti thể là cấu trúc mạch vòng, ngắn - tương đối
Nguyễn Xuân Quyền

11

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

bền vững, ít bị phân hủy trong khi đó ADN nhân tế bào có cấu trúc mạch
thẳng, rất dài, dễ bị phân hủy. Trong điều kiện môi trường thời tiết không
thuận lợi, dưới tác dụng của các enzym vi khuẩn hoặc enzym nội bào cũng
như các tác nhân lý hóa khác nhau, ADN nhân tế bào dễ bị phân hủy hoàn
toàn theo thời gian trong khi đó ADN ti thể thường tồn tại bền vững hơn hoặc
có thể một số ADN ti thể cũng bị phân hủy song vì mỗi tế bào có rất nhiều ti
thể nên vẫn có thể tách được ADN ti thể từ những ti thể còn nguyên vẹn.
Chính vì vậy trong các vụ mà mẫu giám định là xương, răng, móng, tóc không
còn gốc vv... chỉ có thể giải quyết được bằng giám định ADN ti thể[5].
Tuy nhiên nếu mẫu giám định còn có thể tách chiết được ADN nhân tế bào

có chất lượng tương đối đảm bảo phản ứng nhân bội với các mồi Short
Tandem Repeat (STR) cho kết quả thì việc giám định ADN nhân tế bào có giá
trị truy nguyên cao hơn và giá thành cũng rẻ hơn (Bảng dưới đây cho thấy
một số đặc điểm khác nhau giữa ADN nhân tế bào và ADN ti thể)
1.1:
Các đặc điểm
Kích thước hệ
genome
Bản sao (copy)
Cấu trúc
Di truyền
Khả năng tái tổ hợp ở
các thế hệ
Tính đồng nhất trong
một cá thể
Tỷ lệ đột biến

ADN nhân tế bào
Khoảng 3 tỉ nucleotide

ADN ti thể
16596 nucleotide

2 (1 alen từ bố và 1 từ mẹ)
Mạch xoắn thẳng
Từ cha và mẹ
Có

> 1000
Mạch vòng

Từ mẹ
Không

Có

Không

Thấp

Cao gấp 5 – 10 lần
ADN nhân
Được Anderson giải
trình tự năm 1981.

Trình tự

Được xác định khi thực
hiện dự án giải mã hệ gen
của người

Nguyễn Xuân Quyền

12

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Trong quần thể người ADN ti thể di truyền nghiêm ngặt theo dòng mẹ, vì
khi thụ thai, sau khi đầu tinh trùng chui qua màng trứng phần cổ và đuôi sẽ
rụng ra ngoài không chui vào trong trứng, mà ADN ti thể của tinh trùng lại
chủ yếu tập trung ở phần cổ và đuôi, do đó trứng đã thụ tinh không chứa ADN
ti thể có nguồn gốc từ tinh trùng tức từ người bố mà chỉ có ADN ti thể của tế
bào trứng tức của mẹ. Từ tế bào trứng đã được thụ tinh này trong quá trình
phát triển chúng được phân chia và nhân đôi lên theo cấp số nhân, các tế bào
mới tạo thành đều có chứa toàn bộ hệ gen ti thể không thay đổi và có đặc
điểm hoàn toàn giống ADN ti thể trong tế bào trứng của người mẹ, sau từ 1
đến 2 tuần kể từ thời điểm thụ tinh số lượng tế bào đã được nhân lên đáng kể
mà ta thường gọi là tế bào gốc, lúc này các tế bào bắt đầu biệt hóa dần để tạo
ra các mô và tổ chức khác nhau, một số đám tế bào hình thành nên tổ chức da,
một số hình thành nên tổ chức xương, cơ quan nội tạng vv.. trong tất cả các
mô và tổ chức này tế bào đều có chứa ADN ti thể với cấu trúc như ADN ti thể
của mẹ. Sau này khi thai nhi được sinh ra, phát triển và trưởng thành các trình
tự đó luôn luôn được bảo tồn trong các thế hệ tế bào. Ti thể nằm rải rác trong
toàn bộ nguyên sinh chất của tế bào, khi phân chia thành hai tế bào con, hai tế
bào con này chứa các ti thể như của tế bào mẹ. Số lượng tế bào con không
ngừng được tăng lên thông qua việc phân chia trực phân dưới sự kiểm soát
của các gen trong nhân tế bào.
Vì trong toàn bộ các tế bào của cơ thể thai nhi chỉ chứa ADN ti thể của
người mẹ và sau này khi ra đời, phát triển, trưởng thành, trong tế bào của toàn
bộ cơ quan, mô, tổ chức của cơ thể đều có trình tự nucleotide trong ADN ti
thể giống nhau và giống ADN ti thể của người mẹ, do đó mẫu giám định ADN
ti thể có thể là xương, răng, máu, da, tóc… thì ADN ti thể đều đồng nhất.
Mặc khác, toàn bộ tế bào trứng cũng như các loại tế bào khác trong một cơ
thể người mẹ đều có chứa các trình tự bazơ-nitơ trong ADN ti thể giống nhau,
nên (về lý thuyết) mọi người con sinh ra từ cùng một mẹ (cả con trai và con

Nguyễn Xuân Quyền

13

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

gái) đều có trình tự nucleotide của ADN ti thể đồng nhất với nhau, ngoại trừ
trường hợp xảy ra đột biến. Quá trình di truyền này được lặp lại tương tự khi
người con gái lấy chồng và truyền ADN ti thể cho các con của mình như vậy
ở các cá thể người con thì trình tự ADN ti thể đều giống hệt mẹ và bà ngoại,
sự di truyền đó được gọi là sự di truyền ADN ti thể theo dòng mẹ, ADN ti thể
chỉ di truyền theo cách này mà thôi. Phụ thuộc vào chức năng của các cơ
quan, tổ chức mô khác nhau mà số lượng ti thể trong tế bào chất của mỗi tế
bào cũng sẽ khác nhau, ở những cơ quan, tổ chức mà trong quá trình hoạt
động cần nhiều năng lượng chẳng hạn mô cơ thì số lượng ti thể cũng sẽ nhiều
hơn. Điều này có ý nghĩa trong việc thu mẫu gửi giám định.

1.3: Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ti thể inheritance (maternal)
Qua đó chúng ta thấy rằng, ADN ti thể có ý nghĩa rất lớn trong giám định
các vụ việc liên quan đến người mất tích, giám định hài cốt mà giám định
ADN nhân tế bào không còn thực hiện được.

Nguyễn Xuân Quyền

14

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Tuy nhiên, giám định ADN ti thể không có khả năng truy nguyên cá thể,
nó chỉ có tính chất loại trừ hay truy nguyên theo nhóm cá thể có quan hệ
huyết thống với nhau theo dòng mẹ.
1.4. Dị chất trong ti thể
Dị chất là hiện tượng trong một cá thể ngoài trình tự ADN ti thể nguyên
thủy còn tồn tại nhiều hơn một kiểu trình tự ADN ti thể, dạng trình tự ADN
ti thể gốc được gọi là kiểu nguyên thủy (wild-type) hay trình tự gốc còn
dạng kia được gọi là kiểu đột biến (mutated-type), tỉ lệ dị chất không giống
nhau ở các cơ quan khác nhau trong cùng một cá thể. Thậm chí tỉ lệ dị chất
còn khác nhau trên chiều dài của một sợi tóc. Hiện tượng dị chất nếu tồn tại
trong các gen chức năng của ti thể có thể gây ra một số bệnh cho con
người. Dị chất có khả năng di truyền theo dòng mẹ từ thế hệ này sang thế
hệ khác, nhưng tỉ lệ dị chất ở các cá thể, các thế hệ khác nhau thường khác nhau.
Nếu hiện tượng dị chất xảy ra ở các vùng liên quan đến quá trình giám
định ADN ti thể với các mẫu giám định sẽ dẫn đến một số khó khăn trong
việc kết luận mối liên quan giữa chúng.
Hiện nay có nhiều giả thuyết giải thích hiện tượng dị chất, nhưng chưa
có giải thuyết nào có tính thuyết phục. Có giả thuyết cho rằng trong quá
trình tiến hóa của loài người để lại trong tế bào chất một số ti thể của tổ
tiên. Giả thuyết đó cho rằng dị chất là ti thể của tổ tiên. Có giả thuyết cho

rằng đó là ti thể của xác vi khuẩn được di truyền qua các thế hệ, cũng có
giả thuyết cho rằng dị chất là do một vài ti thể của tinh trùng đưa vào trong
tế bào trứng trong quá trình thụ tinh [2;3;8].
1.5. Vùng chỉ thị ADN ti thể (vùng có tính đa hình cao) và các
phƣơng pháp giám định ADN ti thể
Toàn bộ tính đa hình ADN ti thể giữa các cá thể trong quần thể dân cư
được tìm thấy trong vùng kiểm soát hay còn gọi là vùng D - Loop, vùng
này được chia thành 2 vùng nhỏ có số biến thể cao nhất (tính đa hình cao
Nguyễn Xuân Quyền

15

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

nhất) đó là vùng HVI và HVII, bằng phương pháp nhân bội (PCR) phân
tích được trình tự hai vùng này và xác định được có tổng cộng khoảng 610
nucleotide, trong đó vùng HVI có khoảng 342 nucleotide và vùng HVII có
khoảng 268 nucleotide.
Trong vùng D-Loop, các nucleotide được sắp xếp theo một trình tự nhất
định, trình tự này hoàn toàn giống nhau trong một cá thể và giữa các cá thể
có cùng di truyền theo dòng mẹ. Các nghiên cứu thống kê cho thấy rằng
giữa các cá thể không có di truyền theo dòng mẹ có khoảng 1% đến 3%
nucleotide bị biến đổi (trung bình cứ 100 nucleotide có từ 1 đến 3 vị trí
trình tự bị thay đổi). Sự biến đổi đó được phân bố rải rác khắp trong vùng

HVI và HVII và được xác định thông qua giải trình tự. Tuy nhiên có những
“điểm nóng” hoặc những vùng nhỏ mà sự biến đổi luôn tập trung tại đó.
Dựa vào đặc điểm này, các nhà nghiên cứu đã đưa ra một số phương pháp
phát hiện điểm thay đổi trình tự để loại trừ các mẫu không có quan hệ,
chẳng hạn phương pháp dò trình tự oligonucleotide đặc hiệu, phương pháp
Miniseq, phương pháp điện di biến tính gradient để phân tích vùng HVI và
phương pháp lai ngược để phân tích vùng HVII [12].
Trong giám định ADN ti thể, bước đầu tiên cũng là quan trọng nhất là
tách chiết ADN ti thể.
Tách chiết ADN ti thể phải được thực hiện trong phòng thí nghiệm có
môi trường rất sạch vì ADN ti thể có lượng bản sao rất lớn nên có khả năng
nhiễm cao hơn nhiều so với ADN nhân. Do vậy khi giám định nên tiến
hành riêng rẽ các mẫu trong cùng một vụ hoặc xen kẽ các mẫu giữa các vụ
khác nhau để tránh tối đa khả năng gây nhiễm và nhầm lẫn.
Sau khi phân tích, trình tự ADN ti thể của các mẫu cần giám định được
so sánh với nhau hoặc với những mẫu đã được lưu trong cơ sở dữ liệu, sự
so sánh này đều thông qua một trình tự chuẩn chẳng hạn Anderson để tìm
ra mối quan hệ giữa chúng.
Nguyễn Xuân Quyền

16

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Hiện nay, ở nhiều nước đã xây dựng bảng cơ sở dữ liệu ADN ti thể với
số lượng mẫu tương đối lớn từ các chủng tộc người khác nhau, số lượng
mẫu trong bảng cơ sở dữ liệu có ý nghĩa rất quan trọng để xác định tần suất
đột biến điểm trong quần thể những người được nghiên cứu. Số lượng này
càng lớn thì khả năng tính xác suất trùng hợp ngẫu nhiên càng cao [4;6;].
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về lĩnh vực liên quan đến đề tài
2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Theo khảo sát và đánh giá, hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu
về phương pháp tách chiết ADN ti thể trong khảo cổ học, truy tìm những ngôi
mộ cổ, nghiên cứu về tiến hoá, xác định quan hệ huyết thống di truyền giữa
các tộc người... Lĩnh vực được ứng dụng nhiều nhất là giám định ADN ti thể
từ các dấu vết, truy tìm tung tích của nạn nhân trong các vụ án hình sự, các
thảm hoạ xảy ra, việc xác định và quy tập hài cốt liệt sĩ, xác định mộ cổ... Khi
giám định ADN chưa ra đời, việc giám định và đánh giá, so sánh những mẫu
vật chủ yếu dựa trên thống kê tổng kết về mặt hình thái, so sánh những đặc
điểm đặc trưng về mặt chủng tộc của răng, xương, tóc. Những đặc điểm này
có rất nhiều biến động và gặp rất nhiều khó khăn khi truy nguyên đến nhóm
cá thể khi các mẫu vật đều rất gần nhau về mặt địa lý, chủng tộc[10;11].
Từ khi giám định ADN ra đời, cụ thể là từ khi có những nghiên cứu sâu
về cấu trúc ADN ti thể của người, tìm ra được những vùng có tính đặc trưng
cá thể cao (Vùng HVI vùng HVII) thì những vấn đề trên đã cơ bản được giải
quyết. Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật trong công nghệ ADN,
các nhà khoa học đã tìm ra nhiều phương pháp tách chiết ADN khác nhau,
tăng cường khả năng phân tích những mẫu khó, những mẫu xương răng cổ, sử
dụng nhiều hoá chất thiết bị để tăng số lượng bản sao ADN từ mẫu giám định,
nhằm phát hiện bằng những máy móc, thiết bị dùng trong phân tích ADN. Các
phòng thí nghiệm có ưu thế về nghiên cứu và ứng dụng lĩnh vực giám định
Nguyễn Xuân Quyền

17

Mã số: 60.42.01 14


Tối ưu hoá phươ

từ răng, xương người phục vụ công
tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

ADN ti thể thường ở những nước có nền khoa học phát triển cao như phòng
thí nghiệm của Bộ quốc phòng Mỹ, các phòng thí nghiệm ở các trường Đại học
cũng như các Trung tâm nghiên cứu của Đức, Anh, Úc.... [1;10;13].
2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam cho đến nay đã có một số nghiên cứu về phương pháp tách
chiết, tinh sạch và xác định trình tự ADN ti thể để phục vụ tìm kiếm hài cốt
liệt sĩ, đó là nghiên cứu của PGS. TS Lê Quang Huấn,
, nếu được nhà nước đầu

-

tư có thể xây dựng thành dự án tàng thư gen hài cốt liệt sỹ sẽ có ý nghĩa rất
nhân văn trong việc truy tìm hài cốt liệt sỹ[15].
Ngoài ra còn có Dự án cấp nhà nước của PGS. TS Phan Văn Chi, Viện
Công Nghệ sinh học -

, mục

tiêu của đề tài này là xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ gen ti thể của các tộc người
khác nhau tại Việt Nam nhằm bước đầu xác định tần số các đột biến điểm của
hệ gen ti thể phục vụ cho công tác nghiên cứu chủng tộc.

Tại Trung tâm giám định sinh học pháp lý Viện KHHS – Bộ Công an tuy
gặp rất nhiều khó khăn trong việc tìm ra phương pháp giám định phù hợp
trưng giám định ADN ti thể được triển khai từ năm 2003 đến nay, công tác
giám định đã bước đầu có hiệu quả trong việc xác định tung tích nạn nhân,
phục vụ cho công tác điều ta, truy tố và xét xử[16]. Trong đó có thể kể đến
các vụ án điển hình:
1. CA TP. Vinh, tỉnh Nghệ An yêu cầu.
Ngày 08.12.2004 công nhân xí nghiệp 479, Liên Hiệp giao thông 4
thuộc Tổng công ty công trình giao thông 4 đóng tại xã Nghiã Phú, TP.
Vinh, tỉnh Nghệ An đào mương thoát nước đã phát hiện một bộ xương
người chưa rõ tung tích. CA TP. Vinh, tỉnh Nghệ an đã thu 04 răng từ bộ hài

Nguyễn Xuân Quyền

18

Mã số: 60.42.01 14