Xác định đột biến lặp đoạn gen Dystrophin bằng kỹ thuật Multiplex Ligation - Dependent Probe Amplification

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN LẶP ĐOẠN GEN DYSTROPHIN BẰNG
KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION
Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh
Trư ng
h YH N
t
g t nn nt Pr
t n(
h n t
n
n
ng n
tr h n h
Ngh n
n
ư t n h nh
ụ t
h th n
nh nh n
ư
h n
nh
th t
t
PC ( PC ) Ch ng t
h th n
n
n
n 51 nh nh n

t
n
nh t
n
ng n
tr h n tr n nh nh n

P )
nh nh
t
n
t
n
ư 2
n

th
n

t
h nh
ư
ng ụng
n ư ng ơ
h nn
r(
ng n
tr h n
ụng
th t

P
n
nh nh n n
ư
ng
nh nh n
t
n
n 1 nh nh n
n 14 - 1
th t
P
th ng ụng

h t
)
0
ng
t

Từ khóa: Đột biến lặp đoạn, gen dystrophin, MLPA

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe
Amplification (MLPA) hay kỹ thuật khuếch đại đầu dò
đa mồi dựa vào phản ứng nối - là một biến thể của phản
ứng PCR đa mồi (Multiplex Polymerase Chain Reaction)
cho phép khuếch đại nhiều đích chỉ với một cặp mồi duy
nhất [1, 2]. Mỗi đầu dò bao gồm hai oligonucleotide, mỗi
đoạn đều chứa một trình tự mồi cho phản ứng PCR và

một trình tự bổ sung với trình tự đích (được gọi là trình
tự lai). Khi các đầu dò được lai chính xác vào trình tự
đích, chúng sẽ được nối lại bởi enzym ligase bền nhiệt.
Phản ứng PCR sẽ chỉ khuếch đại các đầu dò đã được
nối lại hoàn chỉnh. Vì mỗi đầu dò đều được đánh dấu
huỳnh quang và có kích thước riêng biệt, nên có thể
thu được tín hiệu của mỗi đầu dò đã được phân tách
và xác định trên hệ thống điện di mao quản. Kỹ thuật
MLPA có thể định lượng số bản sao của nhiều trình
tự trong một gen với năng suất lên tới 40 trình tự đích
trong một phản ứng [3; 4]. MLPA là một kỹ thuật có độ
chính xác cao được ứng dụng để phát hiện đột biến
xóa đoạn và lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân
DMD/BMD. Tuy nhiên, giá thành cao hơn so với một số
kỹ thuật thông thường khác. Nghiên cứu này lựa chọn
những bệnh nhân đã được xác định đột biến xóa đoạn
bằng kỹ thuật mPCR và xác định các đột biến lặp đoạn
gen dystrophin bằng kỹ thuật MLPA. Gen dystrophin có
chiều dài hơn 3000 Kb nằm trên NST X, mã hóa 14 - kb
h
n h T Th nh
n
YH N
t th nh n h
n
Ng nh n 2
2014
Ng
h th n 1 11 2014
h

nH

nh trư ng

mRNA, bao gồm 79 exon; quy định tổng hợp protein
dystrophin, là một protein nằm trên màng tế bào cơ, có
vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ khi hoạt động.
Đột biến gen dystrophin là nguyên nhân gây bệnh DMD
do sự mất toàn vẹn của protein dystrophin dẫn đến tế
bào cơ bị tổn thương. DMD/BMD là một trong những
bệnh lý về cơ do di truyền thường gặp nhất có tần suất
mắc bệnh vào khoảng 1/3.500 trẻ trai, biểu hiện lâm
sàng nặng với triệu chứng yếu cơ mang tính chất tuần
tiến, trẻ bị teo cơ, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi
trưởng thành do suy tim và rối loạn hô hấp. Đột biến
tạo mã kết thúc sớm hoặc gây lệch khung dịch mã sẽ
gây nên thể nặng DMD trong khi đó đột biến không gây
lệnh khung dịch mã sẽ gây nên thể nhẹ BMD. Xác định
đột biến gen dystrophin có vai trò rất quan trọng trong
tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, đặc biệt giúp
cho liệu pháp điều trị gen [5; 6]. Có nhiều dạng đột biến
trên gen dystrophin bao gồm đột biến xóa đoạn chiếm
50 - 65%, đột biến điểm 20 - 25% và đột biến lặp đoạn
chiếm 5 - 10% [6]. Nghiên cứu được tiến hành với mục
tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA xác định đột biến lặp
đoạn gen dystrophin trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne / Becker.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Đối tượng
30 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD/BMD dựa
vào các dấu hiệu lâm sàng và cận lâm sàng điển hình.
Bệnh nhân có dấu hiệu yếu cơ, đi lại hay vấp ngã, phì
đại cơ cẳng chân, dấu hiệu Gower dương tính. Xét
nghiệm enzym Creatine Kinase (CK) tăng cao (bình
thường 200 UI/l). Bệnh nhân đã được sàng lọc không
mang đột biến xóa đoạn trên gen dystrophin bằng kỹ
19


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
thuật mPCR [7]. 02 người bình thường được lựa chọn
làm mẫu đối chứng đi kèm với mẫu bệnh nhân trong
mỗi phản ứng MLPA.
2. Phương pháp
2.1. Quy trình lấy mẫu: Bệnh nhân sẽ được lấy 2ml
máu tĩnh mạch chống đông trong EDTA. Quy trình đảm
bảo tuyệt đối vô trùng.
2.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số: Quy trình
tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo quy trình
phenol/chloroform [7]. Nồng độ và độ tinh sạch DNA
được kiểm tra nhờ phương pháp quang phổ (OD 260
/ 280).
2.3. Quy trình MLPA xác định đột biến lặp đoạn
Nguyên lý: Sử dụng 79 đầu dò (probe) DNA lai đặc
hiệu với 79 exon của gen dystrophin. Mỗi probe gồm
hai chuỗi oligonucleotide, một chuỗi ngắn và một chuỗi
dài. Mỗi chuỗi có 2 trình tự quan trọng:
- Vị trí liên kết đặc hiệu và liền kề nhau trên trình tự exon

đích tương ứng, tạo điều kiện cho enzym ligase gắn 2
chuỗi lại thành probe hoàn chỉnh. Nếu có đột biến lặp
đoạn trong mẫu DNA.
- Vị trí gắn mồi phản ứng PCR khuếch đại probe, có
trình tự giống hệt nhau, nên chỉ cần một cặp mồi duy
nhất để khuếch đại tất cả các probe.
Quy trình: Sử dụng bộ kit MLPA P034 - A3 và P035 - A3
của MRC - Holland.Chuẩn bị mẫu DNA, đưa về nồng độ
30ng/µl.Biến tính DNA; Cho vào ống 0,2ml; 2µl DNA +
3 µl DW; Biến tính tại 98°C trong 5 phút, giữ ở 25°C.
Lai đầu dò: Thêm 1,5µl MLPA buffer + 1,5 µl ProbeMix

(P034/P035) vào ống mẫu. Để ở 95°C trong 1 phút, sau
đó giữ ở 60°C trong 16 giờ. Phản ứng nối: Giữ ở 54°C.
Thêm vào: 3 µl Ligase - 65 buffer A + 3 µl Ligase - 65
buffer B + 1 µl Ligase - 65 + 25 µl DW. Để ở 54°C trong
15 phút, sau đó là 98°C trong 5 phút và giữ ở 15°C.
Phản ứng PCR: Thêm vào: 7,5 µl DW + 2 µl Cy5 Primer
Mix + 0,5 µl Salsa Polymerase. Chạy chu trình nhiệt : 35
x [95°C/30 giây - 60°C/30 giây - 72°C/60 giây] - 72°C/20
phút – Giữ ở 15°C [4]. Chạy trên máy Beckman Coulter
CEQ600, phân tích trên phần mềm GeneMarker. Tính
toán theo công thức: RPA(Relative Peak Area) = [As/
ΣAs] / [Ac/ΣAc]. X ≥ 1.5: đột biến lặp đoạn.
3. Đạo đức nghiên cứu
Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham
gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút
lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia
vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân
sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp

cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ
điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm
bảo bí mật.

III. KẾT QUẢ
1. Kết quả xác định đột biến lặp đoạn gen bằng
kỹ thuật MLPA
30 bệnh nhân DMD/BMD đã được tiến hành xác
định đột biến lặp đoạn gen dystrophin, kết quả phát hiện
2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin.

Hình 1. Kết quả phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS12 bằng kỹ thuật MLPA (mũi tên
chỉ exon đột biến). A: Kết quả đột biến lặp đoạn exon 14 - 17. B: Tỉ lệ RPA của từng exon bệnh nhân MS 12
so với mẫu chứng nam
20


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
Tỉ lệ RPA của exon 14 - 17 ≥ 1,5, trong khi đó tỷ lệ RPA của các exon còn lại tương ứng với 1, chứng tỏ bệnh nhân
có đột biến lặp đoạn exon 14 - 17 gen dystrophin.

Hình 2. Kết quả phân tích đột biến lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân MS 21 bằng kỹ thuật MLPA
(
t n h
n t
n)
A: Kết quả đột biến lặp đoạn exon 5-7. B: Tỉ lệ RPA của từng exon bệnh nhân MS 21 so với mẫu chứng nam
Tỷ lệ RPA của exon 5 - 7 ≥ 1,5, trong khi đó tỷ lệ RPA của các exon còn lại tương ứng với 1, chứng tỏ bệnh nhân
có đột biến lặp đoạn exon 5 - 7 gen dystrophin.
2. Tỷ lệ đột biến lặp đoạn gen dystrophin

Bảng 1. Tỷ lệ đột biến lặp đoạn gen dystrophin
STT

Bệnh nhân

Đột biến

n

1

Bệnh nhân 12

Lặp đoạn Exon 14-17

1

2

Bệnh nhân 21

Lặp đoạn Exon 5-7

1

3

Tổng

Bệnh nhân có đột biến lặp đoạn

2/30

Bệnh nhân không có đột biến lặp đoạn

28/30
30

2/30 bệnh nhân có đột biến lặp đoạn gen dystrophin chiếm tỷ lệ khoảng 6,5%.

IV. BÀN LUẬN
Loạn dưỡng cơ Duchenne là một trong những bệnh
lý di truyền cơ phổ biến nhất, các đột biến trên gen dystrophin đã được chứng minh in vitro làm mất hoặc giảm
chức năng protein dystrophin - một protein quan trọng

trong quá trình co cơ, từ đó gây bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne. Kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật có độ chính
xác cao được ứng dụng để phát hiện đột biến xóa đoạn
và lặp đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD/BMD.
Tuy nhiên, kỹ thuật này giá thành cao hơn so với một số
kỹ thuật thông thường khác. Để giảm giá thành, chúng
21


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
tôi đã lựa chọn bệnh nhân đã được xác định đột biến
xóa đoạn bằng kỹ thuật mPCR, kỹ thuật này rẻ hơn so
với kỹ thuật MLPA, chỉ những bệnh nhân nào không
có đột biến xóa đoạn mới được chúng tôi lựa chọn để
xác định đột biến lặp đoạn. Đột biến lặp đoạn trên gen

dystrophin chiếm tỷ lệ từ 5 - 10% [3; 4; 6]. Tuy nhiên,
đột biến lặp đoạn không xác định được bằng những kỹ
thuật sinh học phân tử thông thường (PCR, giải trình tự
gen…). Nhóm nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật MLPA để
giải quyết khó khăn này. Kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật
sinh học phân tử mới, có độ nhạy và độ chính xác cao,
tiết kiệm thời gian, đặc biệt là trên một gen dài 79 exon
như gen dystrophin [1; 2; 3; 4; 5]. Kỹ thuật MLPA có độ
tin cậy cao nhờ những mồi nội chuẩn được thiết kế sẵn
để kiểm tra chất lượng mẫu, có độ đặc hiệu cao nhờ
thiết kế đầu dò hai đầu hai trình tự đặc biệt, khuếch đại
dựa vào phản ứng nối. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy
ưu điểm của phương pháp MLPA trong phân tích đột
biến lặp đoạn nhanh chóng, chính xác, giúp ứng dụng
trong chẩn đoán trước sinh bệnh DMD và các bệnh di
truyền, làm rút ngắn thời gian và công sức [8].
Trong nghiên cứu này, 30 bệnh nhân được chẩn
đoán mắc bệnh DMD/BMD và đã được sàng lọc không
mang đột biến xóa đoạn bằng kỹ thuật mPCR. 2/30 bệnh
nhân (6,7%) được xác định mang đột biến lặp đoạn gen
dystrophin kết quả này, tương đồng với những nghiên
cứu khác ở Việt Nam và trên thế giới [4; 5; 6]. Tuy cỡ
mẫu chưa được lớn, nhưng đây là nghiên cứu đầu tiên
áp dụng kỹ thuật MLPA vào xác định đột biến lặp đoạn
gen dystrophin ở Việt Nam.

V. KẾT LUẬN
Sử dụng kỹ thuật MLPA, nghiên cứu đã xác định
được đột biến lặp đoạn gen dystrophin ở 2/30 bệnh
nhân đã được chẩn đoán xác định là DMD/BMD.

Lời cảm ơn
Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ
đề tài cấp nhà nước KC.04.08/11-15 “Nghiên cứu xây
dựng quy trình điều trị gen cho bệnh loạn dưỡng cơ
Duchenne” thực hiện từ năm 2013 - 2015.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R et al (2002).
Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by
multiplex ligation-dependent probe amplification. N 30 (12).
2. Murugan S, Chandramohan A, Lakshmi BR (2010).
Use of multiplex ligation-dependent probe amplification
(MLPA) for Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene
mutation analysis. n n
132, 303 - 311.
3. Kent K.S. Lai, Ivan F.M. Lo et al, (2006).Detecting
exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
(MLPA). C n
h
tr 39, 367 – 72.
4. Marzese D.M., Mampel A., Gomez L.C., (2008).
Detection of deletions and duplications in the Duchenne
muscular dystrophy gene by the molecular method
MLPA in the first Argentine affected families.
n t
n
r
r h 7, 223 - 233.
5. Mendell R.J., Griggs C.R. (1991). Muscular dystrophin. H rr n r n

nt rn
n 12th edition, 2112 - 2118.
6. Takeshima Y, Yagi M, Okizuka Y et al (2010). Mutation spectrum of the dystrophin gene in 442 Duchenne/
Becker muscular dystrophy cases from one Japanese
referral center. H
n t 55(6), 379 - 388.
7. Van Khanh Tran, Van Thanh Ta, Dung Chi Vu, et al
(2013). Exon Deletion Patterns of the Dystrophin Gene
in 82 Vietnamese Duchenne/Becker Muscular Dystrophy Patients. N r g n t
27(4), 170 - 175.
8. Minh-Hieu Ta, Thinh Huy Tran, Ngoc-Hai Do, et al
(2013). Rapid method for targeted prenatal diagnosis
of Duchenne muscular dystrophy in Vietnam.T
n
rn
t tr
n
g 52, 534 - 539.

Summary
MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION FOR
DETECTION OF DUPLICATION IN DYSTROPHIN GENE
The multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) assay is the most powerful tool in screening for
deletions and duplications in the dystrophin gene in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy (DMD/
BMD). The purpose of this study is to detect duplication in dystrophin gene using MLPA technique. 30 unrelated male
patients with DMD/BMD were selected for this study. These patients had already been screened by multiplex PCR
22


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

(mPCR). We detected two duplications that had been missed by mPCR, in one DMD patient showing a duplication
from exon 5-7 and other one showing a duplication from exon 14-17. The results of our study confirmed MLPA to be
the method of choice for detecting DMD duplication in DMD/BMD patients.
Keywords: Duplication, dystrophin gene, MLPA

23