Phát hiện một số trường hợp đột biến lặp đoạn Exon 2 xảy ra trong quá trình sao chép gen Dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ppt

12
TCNCYH 34 (2) - 2005
Phát hiện một trờng hợp đột biến lặp đoạn exon 2
xảy ra trong quá trình sao chép gen dystrophin ở
bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne.
Trần Vân Khánh
1
Và Tạ Thành Văn
2
1
, Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học tự
nhiên và Công nghệ Quốc gia
2
, Bộ môn Hóa-Hóa sinh, Trờng Đại học Y khoa Hà nội.
Gen dystrophin là một gen có cấu trúc rất dài, điều này đã làm cho quá trình phiên
mã của gen trở nên phức tạp hơn, đặc biệt là ở đầu gen 5. Trong nghiên cứu này chúng
tôi công bố một bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne có đột biến lặp đoạn exon 2. Điều
rất đáng chú ý là đột biến này không xuất hiện ở ADN (genome). Chính vì vậy, chúng tôi
giả thiết rằng đây là kết quả của quá trình trans-splicing xảy ra trong quá trình sao chép
của gen dystrophin. Nguyên nhân và cơ chế của hiện tợng này cha đợc biết rõ ràng
và hiện đang đợc tiếp tục nghiên cứu.
I. Đặt vấn đề
Duchenne là một loại bệnh gây nên do
đột biến gen dystrophin. Đây là một gen
lớn có chiều dài khoảng 3000 kb, nằm
trên nhiễm sắc thể X, mã hóa 14 kb
mARN là hợp phần của 79 exon [1, 2].
Hơn 90% trình tự gen là tổ hợp các intron,
một vài intron có chiều dài rất lớn điển
hình là intron 2 (khoảng 157 kb). Tại đây

thờng xảy ra một số lỗi trong quá trình
hoàn thiện các tiền mARN. Một trong các
khâu của quá trình hoàn thiện tiền mARN
là cắt bỏ các intron và ghép nối các exon
lại với nhau. Quá trình này đòi hỏi một số
trình tự quan trọng nằm ở đầu 5 tận
(acceptor splicing site), 3 (donor splicing
site) và tại vị trí nhánh của intron (branch
consensus site). Ngoài ra quá trình này
còn cần một số vùng trình tự khác nằm
trong exon bao gồm vùng giàu base
purine (purine-rich region), vùng tăng
cờng quá trình ghép nối (splicing
enhancer sequence- SES) và vùng trình
tự nhận biết exon (exon recognition
sequence). Gần đây ngời ta chứng minh
rằng một số nhóm các protein tham gia
vào quá trình nhận biết SES góp phần
quan trọng trong quá trình hoàn thiện các
tiền mARN. Một số nghiên cứu đã chứng
minh rằng trong quá trình này, đột biến
thêm đoạn thờng gặp hơn cả so với một
số đột biến khác. Cho đến nay một vài
exon đợc sao chép lại từ intron của gen
dystrophin đã đợc công bố nh exon X,
exon 2a và exon 3a. Các exon này lần
lợt đợc sao chép từ intron 1, 2, 3 và
hợp nhất để tạo ra cấu trúc mARN của
dystrophin [3, 7]. Trans- splicing là một
hiện tợng ít đợc biết đến hơn trong quá

trình hoàn thiện các tiền mARN. Trong
nghiên cứu này chúng tôi công bố một
bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne có
đột biến lặp đoạn exon 2. Điều rất đáng
chú ý là đột biến này không xuất hiện ở
ADN. Chính vì vậy, chúng tôi giả thiết
rằng đây là kết quả của quá trình trans-
splicing xảy ra trong quá trình sao chép
của gen dystrophin.

13
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
2.1. Đối tợng
Bệnh nhân DMD đợc chẩn đoán dựa
vào những triệu chứng lâm sàng và cận
lâm sàng điển hình: yếu cơ có tính chất
tiến triển, phì đại cơ cẳng chân, mất khả
năng đi lại ở tuổi 12, nồng độ CK tăng
cao trong máu ngoại vi và sinh thiết cơ có
hình ảnh điển hình của bệnh.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
ADN đợc tách chiết từ máu ngoại
biên theo qui trình phenol/chloroform
chuẩn. Để xác định đột biến xóa đoạn,
lặp đoạn hay thêm đoạn ở mức độ ADN,
phơng pháp Southern blot đã đợc tiến
hành dựa theo quy trình của một báo cáo
trớc đây [2]. mARN tổng số đợc tác
chiết từ máu ngoại biên và tổng hợp

cADN theo kỹ thuật của Chomczynsky
[4]. Để xác định một số đột biến bất
thờng xảy ra trong quá trình phiên mã,
20 cặp mồi khác nhau đã đợc sử dụng.
Toàn bộ chiều dài gen dystrophin đợc
khuyếch đại từ cADN bằng phản ứng
polymerase chain reaction (PCR). Thêm
vào đó một cặp mồi với chiều xuôi bổ
xung với exon 1 (1C: 5-
ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAG-3) và
chiều ngợc bổ xung với exon 4 (c4r: 5-
GTTCAGGGCAGAAGTCTTG-3) đã
đợc sử dụng để định vị rõ ràng hơn đột
biến lặp đoạn ở vùng 5 tận. Sản phẩm
của phản ứng PCR đợc điện di trên gel
agarose với nồng độ từ 2-3%. Để xác
định trình tự, sản phẩm phản ứng PCR đã
đợc cắt ra và tinh chế từ gel sau đó đợc
đa vào vector tạo dòng PT7-blue
(Novagen). Trình tự gen đợc xác định
bằng máy đọc trình tự tự động (model
373A, Applied Biosystems, Foster City,
California, USA).
III. Kết quả
3.1. Phản ứng khuếch đại cADN từ
exon 1 đến exon 4
Sử dụng kỹ thuật PCR với 20 cặp mồi
khác nhau chúng tôi đã khuyếch đại toàn
bộ chiều dài cADN của gen dystrophin.
Kết quả của phản ứng PCR đã cho thấy:

ở vùng 5 của gen này có 2 vạch tơng
ứng với 2 sản phẩm PCR có kích thớc
lớn hơn bình thờng. Sự thay đổi này gợi
ý có sự đột biến thêm đoạn tại vùng gen
tại đầu 5. Với mục đích định vị chính xác
vùng đột biến, chúng tôi đã sử dụng thêm
một cặp mồi khác khuyếch đại vùng gen
nhỏ hơn kéo dài từ exon 1 đến exon 4,
sau đó chạy điện di trên gel với nồng độ
agarose cao (3%) nhằm mục đích phân
tách các sản phẩm PCR. Hai sản phẩm
PCR đợc xác định có kích thớc là 387
bp và 287 bp (hình 1a). Trình tự của các
nucleotide của sản phẩm PCR này đã
khẳng định rằng đầu 3 của exon 2 gắn
trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác
gây ra hiện tợng lặp một đoạn của exon
này, bên cạnh đó 162 bp của exon X
cũng đợc xác định. Đoạn này nằm giữa
exon 1 và exon 2 (hình 1b).








C P Mk
1c-c4r

1
2
2 3
4
1
X
2 3
4
2
1
2 3
4
387bp
287 bp
225 bp

A




}

2 sản phẩm
PCR của bệnh
nhân.

Sản phẩm PCR
bình thờng
tơng ứng với
mẫu đối chứng.
}


B
Exon X
Exon 1 Exon 2 Exon 2


13









Hình 1: A, Sản phẩm khuyếch đại của cADN kéo dài từ exon 1 đến exon 4. Hai sản phẩm
(387 và 287 bp) đợc khuyếch đại từ mẫu cADN của bệnh nhân (dòng P), cả 2 sản phẩm này
đều có kích thớc lớn hơn so với mẫu đối chứng ( 225 bp - dòng C); C, mẫu đối chứng của
ngời bình thờng; P, bệnh nhân. Mk: Marker Hae III-digested Ô 174 phage ADN. B, Trình tự
của vùng đột biến lặp đoạn exon 2 (gi:M18533) và exon X (gi: 306722) ở đầu 5 tận của gen
dystrophin. Hình bên trái: Trình tự đầu 3 của exon 1 gắn trực tiếp với đầu 5 của exon X;
Hình bên phải: Trình tự đầu 3 của exon 2 gắn trực tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác.

3.2. Kết quả phản Southern blot xác
định đột biến trên ADN sử dụng đoạn
dò Bgl II
Exon 2 lặp đoạn ở đầu 5 của gen
dystrophin đã đợc xác định trên một
bệnh nhân DMD. Hiện tợng lặp đoạn
này không xác định đợc ở ADN
(genome) của tế bào bằng kỹ thuật
Southern blot mà chỉ xác định đợc ở
mức độ mARN (transcript). Kết quả
Southern blot của sản phẩm lai tạo exon
2 đã cho thấy: một vạch lai tạo duy nhất
có kích thớc tơng ứng với kích thớc
của sản phẩm bình thờng (hình 2A). Kết
quả mô tả vị trí xác định bởi đầu dò Bgl II
đợc diễn dải ở hình 2B.










A

13

















Hình 2. A, Kết quả lai tạo của phản ứng Southern blot sử dụng đoạn dò Bgl II. Dòng 1: sản
phẩm lai tạo của bệnh nhân; Dòng 2: sản phẩm lai tạo của mẫu đối chứng. B, Quá trình
trans-splicing. Ba mô hình trans-splicing của gen dystrophin đợc chỉ dẫn bằng các dòng
kẻ khác nhau.

IV. Bàn luận
Việc phân tích khởi đầu bằng kỹ thuật
Southern blot. Tuy nhiên đột biến vẫn
cha đợc xác định cụ thể do kỹ thuật
này chỉ dừng ở mức độ phân tích ADN.
Theo nhiều báo cáo đợc tổng kết từ
trớc đến nay thì nhiều trờng hợp đột

biến không xảy ra ở ADN mà phát sinh
trong quá trình sao chép do nhiều nguyên
nhân khác nhau [3, 6, 7]. Để nghiên cứu
sâu hơn ở mức độ mARN, bằng phản ứng
PCR chúng tôi đã dùng 20 cặp mồi khác
nhau khuyếch đại toàn bộ chiều dài của
gen dystrophin từ cADN. Kết quả PCR đã
cho thấy một đoạn gen ở vùng 5 tận có 2
vạch tơng ứng với 2 sản phẩm PCR có
kích thớc lớn hơn bình thờng. Điều này
cho phép chúng tôi đa ra giả thuyết rằng
đột biến thêm đoạn hoặc lặp lại đoạn gen
đã có thể xảy ra ở vùng 5 . Để định vị rõ
hơn vùng đột biến, chúng tôi sử dụng
thêm một cặp mồi khác nhằm mục đích
khuyếch đại vùng gen nhỏ hơn kéo dài từ
exon 1 đến exon 4, sau đó chạy điện di
trên gel với nồng độ agarose cao để có
thể phân tích một cách chính xác các sản
phẩm PCR. Kết quả cho thấy hai sản
phẩm PCR đợc xác định có kích thớc là
387 bp và 287 bp. Kết quả xác định trình
tự nucleotide của các sản phẩm PCR này
đã chỉ ra rằng đầu 3 của exon 2 gắn trực
tiếp với đầu 5 của một exon 2 khác gây
ra hiện tợng lặp một đoạn của exon này,
bên cạnh đó 162 bp của exon X cũng
đợc xác định. Đoạn này nằm giữa exon
1 và exon 2. Trình tự của exon X đã đợc
báo cáo trớc đây bởi Roberts 1993 [6].

Đây là một pseudoexon và đợc coi nh
là một hiện tợng bình thờng trong quá
1 2
Ex 4 (12.8 kb)
B
Ex 2 (6 kb)
Ex 3 (3 kb)
1
X
23
4
1
2
2
3
4
1
X
2
2 3
4
1
2
2 3
4
1
X
4
2 2 3
4

2
3
1

13
trình sao chép và hoàn thiện để tạo
mARN trởng thành của gen dystrophin.
Trong nghiên cứu này, exon 2 lặp
đoạn ở đầu 5 của gen dystrophin đã
đợc xác định trên một bệnh nhân đợc
chẩn đoán là DMD. Điều đáng chú ý là
hiện tợng lặp đoạn này không xác định
đợc ở ADN bằng kỹ thuật Southern blot
mà chỉ xác định đợc ở mức độ mARN.
Kết quả Southern blot cho thấy sản phẩm
lai tại exon 2 có một vạch duy nhất có
kích thớc tơng ứng với kích thớc của
sản phẩm bình thờng. Từ đó, chúng tôi
có thể kết luận rằng hiện tợng lặp đoạn
của exon 2 ở đầu 5 tận của gen
dystrophin là do hiện tợng trans-splicing
xảy ra trong quá trình sao chép của gen.
Trans-splicing là một hiện tợng xảy ra
trong quá trình hoàn thiện các tiền
mARN. Sản phẩm của quá trình này phát
sinh từ 2 sản phẩm tiền mARN của
dystrophin, trong đó 2 đoạn mARN là sản
phẩm của các quá trình sao chép khác
nhau đợc ghép nối với nhau để tạo ra
một sản phẩm mới

Hiện tợng trans-splicing của gen này
lần đầu tiên đã đợc tìm thấy trên loài
khuẩn trypanosomes [8] và nó đã đợc
coi nh là một hiện tợng khác thờng
của quá trình sao chép. Tiếp sau đó nó
đợc phát hiện trên một số loại giun tròn
(nematodes) và tế bào thực vật. Điều này
chứng tỏ rằng đây là một hiện tợng khá
phổ biến và xảy ra tại rất nhiều mô khác
nhau. ở thời điểm đó, một số nhà khoa
học đã nghĩ rằng quá trình trans-splicing
có thể cung cấp cho họ những ý tởng để
nghiên cứu một số liệu pháp điều trị mới
nếu hiện tợng này chỉ xảy ra ở một số tổ
chức nhất định, đặc biệt nếu không xảy ra
trên ngời và động vật có vú. Tuy nhiên
trans-splicing sau đó lại tiếp tục đợc
phát hiện ở tế bào gan chuột bởi
Caudevilla [3]. Tác giả này đã phát hiện
ra rằng rất nhiều dạng mARN khác nhau
của gen cartidine octanoyltransferase có
hiện tợng lặp đoạn của exon 2 hay exon
2 và 3 mà không xác định đợc ở ADN.
Cho đến nay hiện tợng này cũng đã
đợc tìm thấy trên gen của ng
ời, Fluriot
đã tìm thấy hiện tợng lặp đoạn của exon
1a ở vùng 5 của gen estrogen receptor-á
mà hiện tợng này cũng không đợc xác
định ở ADN bằng Southern blot [5]. Cho

đến hiện nay, trans-splicing đã đợc
chứng minh là một hiện tợng xảy ra khá
phổ biến. Tuy nhiên nguyên nhân và cơ
chế của hiện tợng này vẫn cha đợc
biết rõ ràng và hiện vẫn đang đợc các
nhà khoa học tiếp tục quan tâm nghiên
cứu.
Tài liệu tham khảo
1. Trần Vân Khánh và Tạ Thành
Văn. Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne và
Becker: Đặc điểm lâm sàng và cơ chế
sinh học phân tử. Tạp chí thông tin Y học
2004 (đã gửi đăng)
2. Ahn, A.H., and Kunkel, L. M. The
structural and functional diversity of
dystrophin. Nat. Genet. 3, 283-291,
(1993).
3. Caudevilla, C., Serra, D., Miliar,
A., Codony, C., Asins, G., Bach, M.,
Hegardt, F. G. Natural trans-splicing in
carnitine octanoyltransferase pre-mARNs
in rat liver. Proc Natl Acad Sci U S A 95,
12185-12190, (1998).
4. Dwi Pramono, Z. A., Takeshima,
Y., Surono, A., Ishida, T., Matsuo, M.
Novel criptic exon in intron 2 of the
human dystrophin gene evolved from an
intron by acquiring consensus sequences
for splicing at different stages of

14
anthropoid evolution. Biochem biophys
Res Commun 267, 321-328, (2000).
5. Fluriot, G. Natural trans-spliced
mARNs are generated from the human
estrogen receptor-alpha (hER alpha)
gene. J Biol Chem. 277, 26244-26251,
(2002).
6. Roberts, R. G., Bentley, D. R.,
Bobrow, M. Infidelity in the structure of
ectopic transcripts: a novel exon in
lymphocyte dystrophin transcripts: Hum
Mutat 2, 293-299, (1993).
7. Suminaga, R., Takeshima, Y.,
Adachi, K., Yagi, M., Nakamura, H.,
Matsuo, M. A novel cryptic exon in intron
3 of the dystrophin gene was
incorporated into dystrophin mARN with a
single nucleotide deletion in exon 5. J
Hum Genet 47, 196-201, (2002).
8. Sutton, R. E., Boothroyd, J. C.
Evidence for trans-splicing in
trypanosomes. Cell 47, 527-535, (1986).

Summary
Repeating exon 2 mutation caused by trans-splicing dystrophin
gene in Duchenne muscular dystrophin (DMD) patient
The Dystrophin gene is the largest human gene, mutations in this gene cause
Duchenne muscular dystrophin (DMD) disease. This is complex genomic unit exhibiting
many errors splicing during mARN process. More than 10 alternative splicing products

have been identified in the 5’ region of the dystrophin gene. In this study, two dystrophin
transcripts including one containing exon 2 and exon X duplications, other one
containing single exon 2 duplication were identified in peripheral blood lymphocytes of
DMD case. Interestingly, genomic Southern blot analysis ruled out the hypothesis of
duplication of dystrophin at exon 2. Therefore, these data suggested that exon 2
duplication transcripts were likely generated by trans-splicing event that occurring
during the mARN maturation in which RNA segments of two independent transcripts are
spliced together to generate a new mARN species. However, the mechanisms
modulating the trans-splicing activity of the dystrophin exon 2 remain to be clarified.