Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT
KHOA SINH HỌC 

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XÉT 
NGHIỆM 
NÔNG NGHIỆP
Chủ nhiệm bộ môn:  LÊ NGỌC TRIỆU


Danh sách thành viên


Đặt vấn đề

          Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều 

ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp 
cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong 
đó có các nghiên cứu về các lĩnh vực y tế, khoa học đời sống. PCR là 
phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy và tính đặc hiệu rất 
cao; do đó, PCR rất thích hợp cho xét nghiệm chẩn đoán trong lĩnh vực 
y học, pháp y, bệnh lí cây trồng



NHƯ VẬY:



­ TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ?



­ CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐOÁN 
?



­ TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ?



­ Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐOÁN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NÔNG NGHIỆP ?


I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR 
II. Nguyên lí hoạt động của PCR
III. Một số ứng dụng của PCR trong nông 

nghiệp hiện nay


I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR




 Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, 
nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ 
thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 
1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một 

đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi 
oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với 
sự tham gia của DNA polymerase.
 


  Phản ứng PCR được thực 

hiện qua 3 giai đoạn trong 1 
chu kì:
­ Giai đoạn biến tính 
(denaturation)
­ Giai đoạn bắt cặp 
(annealing)
­ Giai đoạn kéo dài 
(elongaction)
         Chu kì này được lặp đi 
lặp lại từ 20 ­ 40 lần và cho 
ra các sản phẩm cuối cùng 
của PCR là các đoạn DNA 
hoặc RNA phiên bản. Số 
lượng các bản sao này được 
tính theo hàm số mũ.
Máy PCR



II.Nguyên lí hoạt động của PCR
1. Các thành phần tham gia vào 
phản ứng PCR ( PCR mix):

 ­  DNA khuôn
 ­ Taq. DNA polymerase.
 ­ d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, 
dTTP).
 ­ Primer ( oligonucleotide).
 ­ PCR buffer.
2. Ba giai đoạn phản ứng PCR 
thực hiện trên máy luân nhiệt 
(Thermalcycles)
 ­ Giai đoạn biến tính 
(denaturation): 92 – 98 độ C
- Giai đoạn bắt cặp (annealing)
45 thoi gian 20s­2phut
-  Giai đoạn kéo dài 
(elongaction) nhiệt độ 68­72 


Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc 
lấy mẫu đem phân tích
Các bệnh phẩm y học
   
Ly trích pre ­ nucleic acide
   
Ly trích acide nucleic tinh khiết
   
PCR ( RT ­ PCR)
   
Thực hiện xét nghiệm chẩn 
Phân tích phát hiện sản phẩm 
đoán bằng PCR

PCR bằng quang phổ hay điện 
di




Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 

1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ 
những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu 
khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, 
da, phân, v.v... Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc 
gửi từ xa hàng nghìn kilômet, mất nhiều 
ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu 
điện, không cần bảo quản lạnh.

Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng 
nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất.
Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm  (từ 1mg 
xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả 
cao .
Kí hiệu­Lấy mẫu đem 

phân tích




2. Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết 
ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên 

cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện 
nước ta. Do vậy, góp phần giảm giá thành, 
tiết kiệm kinh phí. Với mỗi loại mẫu có một 
quy trình tách chiết thích hợp riêng. Đảm bảo 
chất lượng và số lượng ADN từ những lượng 
mẫu nhỏ. 

Tách chiết ADN 

Tinh sạch ADN 


 3. Nhân ADN đặc hiệu: 


Đây là khâu quan trọng nhất của quy 
trình. Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và 
các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử 
nghiệm cho từng cặp mồi. Trên cơ sở đó, 
đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn 
hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp 
mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên 
thị trường trong nước 

 Nhân ADN đặc hiệu 




4. Điện di: Điện di được dùng để tách biệt các 

đoạn ADN có độ dài ngắn khác nhau. Độ tách 
biệt này phụ thuộc nhiều yếu tố. Các yếu tố đã 
được lựa chọn và tối ưu hoá trên cơ sở vật liệu 
sẵn có, hạ giá thành đáng kể và tăng độ phân 
giải lên hàng trăm lần, giúp phân biệt rõ các 
đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau bốn nucleotid. 

Điện di 




5. Nhuộm màu ADN: Chất lượng điện di và 
kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ 
trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được 
tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp 
được lựa chọn. Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ 
năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp 
phần hạ giá thành chung 

 Nhuộm màu ADN 




6. Phân tích kết quả: Bản gel sau khi nhuộm 
xong sẽ có dạng như hình trên. Các đoạn ADN có 
độ dài khác nhau hiện rõ trên bản gel, có thể quan 
sát bằng mắt thường và đo đếm. Trong một số 
trường hợp, có thể xác định trình tự ADN để có 

kết luận cuối cùng. Hàng nghìn bản gel như thế đã 
được phân tích và hiện được lưu giữ tại Phòng thí 
nghiệm. 

Phân tích kết quả 


­ TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP 
XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ?
Ý NGHĨA TRONG NÔNG NGHI
Ệ
P ?
 Độ tinh sach của mẫu không cần cao 
ü
ü

 Dễ thực hiện

ü

 Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn

ü

 Độ chính xác cao đáng tin cậy

ü

Trong nông nghiệp hiện đại có nhiều loại bệnh cần phải được chuẩn đoán 
sớm ngay tại vườn ươm hay trên nguồn hạt giống để loại bỏ tác nhân gây hại 

trước khi được đưa ra trồng trọt và sản suất đại trà mặt khác trên những đối 
tượng nghi ngờ đã bị lây nhiễm mầm bệnh có thể loại trừ sớm để tránh việc 
lây lan nhầm giảm thiểu thiệt hại đến mức thấp nhất. Vì thế những ưu thế 
của kĩ thuật này giúp đưa ra kết quả một cách chính xác và kịp thời để có thể 
giải quyết mầm móng các nguồn bệnh.




­ CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU 
CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN 
ĐOÁN ?
Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một 

mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu 
vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch 
bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ 
đặc hiệu và năng suất của phản ứng.


Việc thiết kế mồi đặc hiệu cho một phản ứng đựa vào trình tự bảo tồn nằm trong vùng bảo tồn genome của 
sinh vật, trình tự bảo tồn thể hiện đặc trưng riêng biệt cho từng sinh sinh vật cụ thể mà dựa vào đó có thể 
thiết kế các mồi đặc hiệu cho từng loài sinh vật. 

­  Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật
­  Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh 
    vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài 
riêng biệt.

Thiết kế mồi đặc hiệu cho 

loài


TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ 
NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ?


Hoạt tính RNase H: hoạt tính RNase cho phép phá hủy đặc hiệu RNA trong phức hợp (RNA­
RNA bổ trợ), hiện tượng này không có lợi cho PCR nếu quá trình phá hủy khuôn mẫu RNA 
cạnh tranh với quá trình tổng hợp DNA  khi tạo sợi DNA đầu tiên. Nói cách khác nếu trong 
phản ứng test virus ta bổ sung thêm RNase thì phản ứng chuyển RNA sẽ không đạt kết quả



Enzmye phiên mã ngược ( ReverseTransciptase): các enzyme ReverseTransciptase phụ 
thuộc RNA, xúc tác quá trình tổng hợp RNA­>DNA đầu tiên sau đó DNApolimerase mới thực 
hiện phản ứng tổng hợp chuỗi DNA của virus.


MỘT VÍ DỤ VỀ XÉT NGHIỆM VIRUS 
DÂU TÂY(Strawberry)

-

Bảy virus rệp truyền qua đường 
được tái chuyển trong dâu tây:
Strawberry crinkle virus (SCV)
SMYEV
Strawberry mottle virus (SMoV)
Strawberry vein banding virus 

(SVBV)
Strawberry pseudo mild yellow 
edge virus (SPMYEV)
Strawberry chlorotic fleck virus 
(SCFV)
Strawberry latent C virus (SLCV)

Trong đó: SCV, SMYEV, SMoV, và SVBV đã được coi 
là bốn virus quan trọng nhất về kinh tế của dâu tây.
A: xuất hiện hóa đỏ trên toàn vườn, tang trưởng không đều
B: các dãi đỏ lây lan
C: cận cảnh sự hóa đỏ, còi cọc, méo mó quả nhỏ của dâu




Các triệu chứng suy giảm trong cây dâu tây:

A: mạch dẫn hóa đỏ
B: lá biến dạng, mạch dẫn hóa đỏ, tổn thương trên cuống 
lá



Ảnh điên di phân tích kết quả test virus trên một số 
chủng dâu tây phổ biến tại Đà Lạt


MỞ RỘNG: PCR ĐA MỒI­ MULTIPLEX PCR



Multiplex PCR là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi cùng lúc để khuếch đại 
nhiều khu vực trên trình tự DNA đích, có thể sử dụng kĩ thuật này để định nhóm 
hoặc phân loại virus bằng các trình tự Nucleic acid



Trong một xét nghiệm để tăng độ tin cậy cho kết quả và tiết kiệm thời gian, chi phí, 
phản ứng cần được “Mix” hỗn hợp mồi ta có thể phát hiện cùng lúc nhiều virus trên 
cùng một mẫu. Do tính chất đặc hiệu của mồi nên việc phối hợp sẽ đạt hiệu quả 
cao trong xét nghiệm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

Phản ứng multiplex PCR có thể chia thành 2 loại:


a) Phản ứng multiplex PCR dùng một khuôn



Phương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen, cùng với các cặp 
mồi (các mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một vùng gen cụ thể có chứa trong 
sợi khuôn.



b) Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuôn



Có thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiều cặp mồi. 


Phản ứng 
ELISA


Đặt vấn đề:


Ngoài việc xét nghiệm các bệnh lí do sinh vật gây ra, trong nông nghiệp việc sử dụng các 
loại hóa chất, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) cũng là một yếu tố hết sức quan trọng. Dư 
lượng thuốc BVTV trong nông sản hiện nay là vấn đề của xã hội. ELISA­ một phương pháp 
xét nghiệm đã được ứng dụng từ lâu trong xét nghiệm các bệnh lí, gần đây phát triển theo 
hướng kiểm tra, đánh giá mức độ ô nhiểm dư lượng các hợp chất BVTV trong nông sản và 
trong môi trường sinh thái nông nghiệp


Định nghĩa:
ELISA ( Enzyme­Linked 

ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm 
hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) 
dựa trên sự kết hợp giữa kháng 
nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản 
ứng tạo sản phẩm có màu hay phát 
sáng. Trong đó tính chất họat hóa của 
enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể 
là không đổi.

Nguyên tắc:
Sử dụng KT đơn dòng(Mabs) phủ bề 
mặt những đĩa giếng. Nếu có sự hiện 
diện của KN trong mẫu,KN sẽ tạo 
phức hợp với KT cố định trên giếng và 
KT tự do có gắn enzyme tạo thành  
một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ 
sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào 
giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy 
phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm 
có màu hay phát sáng.