Định típ phức hợp kháng nguyên bạch cầu người định típ phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới bằng phương pháp giải

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019

Nghiên cứu Y học

ĐỊNH TÍP PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI
(HLA: HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI
Mai Phương Thảo*, Lê Gia Hoàng Linh**, Nguyễn Thế Vinh**, Hoàng Anh Vũ**, Đỗ Đức Minh**

TÓMTẮT
Mục tiêu: Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) là phức hợp các
protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch. Định típ HLA rất cần thiết cho việc
ghép tạng cũng như ghép tế bào gốc. Giải trình tự thế hệ mới là một công cụ hiện đại giúp định típ HLA dễ
dàng, nhanh chóng và dần trở thành xu hướng trên toàn thế giới.
Đối tượng và phương pháp: 66 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu được định típ HLA bằng
phương pháp giải trình tự thế hệ mới kết hợp với phân tích sinh tin học trên phần mềm Assign Trusight
HLA v2,0.
Kết quả: Chúng tôi đã định típ HLA lớp I và lớp II của 66 đối tương tham gia nghiên cứu bằng phương
pháp giải trình tự thế hệ mới và thu thập được phân bố các kiều gen HLA phổ biến ở người Việt Nam.
Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới là một kỹ thuật định típ HLA chính xác, nhanh chóng, hiệu quả
và tiết kiệm chi phí.
Từ khóa: phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA), giải trình tự thế hệ mới, phản ứng PCR

ABSTRACT
HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) TYPING BY NEXT GENERATION SEQUENCING
Mai Phuong Thao, Le Gia Hoang Linh, Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu, Đo Đuc Minh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 23 ‐ No 3‐ 2019: 111‐116
Objectives: Human leukocyte antigen (HLA), a cell-surface protein complex, is responsible for the
regulation of the immune system. HLA typing is necessary step in stem cell and organ transplantation. Next
generation sequencing (NGS) is a modern tool that makes HLA typing fast, simple and becoming global trend.
Material - Methods: HLA complex from 66 objects participated in the study were sequenced by next

generation sequencing. Data later were analyzed with Assign Trusight HLA v2.0 software.
Results: HLA class I and II of 66 objects were typed and the distribution of common HLA variants in Kinh
Vietnamese people were obtained.
Conclusion: HLA typing by NGS is accurate, fast and cost-saving.
Keywords: human leukocyte antigen (HLA), next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR)
hiện diện trên bề mặt hầu hết các tế bào có nhân
ĐẶT VẤN ĐỀ
trong cơ thể với mức độ biểu hiện khác nhau có
Các gen mã hóa cho hệ thống phức hợp
nhiệm vụ chính là trình diện các peptide nội bào
kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được chia
của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm virus hoặc
thành 3 lớp chính, trong đó chủ yếu là lớp I
các tế bào khiếm khuyết, bất thường cho các tế
(HLA‐A, HLA‐B và HLA‐C) và lớp II (HLA‐
bào lympho T CD8 thông qua thụ thể tế bào T
DRB1 và HLA‐DQB1) tham gia vào quá trình
(TCR: T cell receptor) dẫn đến hiệu quả cuối cùng
tương tác giữa mảnh ghép và kí chủ. HLA lớp I
là phá hủy tế bào này (thường thông qua cơ chế
*Bộ môn Sinh lý học – Khoa Y – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
**Trung tâm Y sinh học phân tử ‐ Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS.BS Đỗ Đức Minh
ĐT: 0932999989
Email:

111


Nghiên cứu Y học

gây độc tế bào). Trong khi đó, HLA lớp II thường
biểu hiện giới hạn ở các tế bào đã được hoạt hóa
miễn dịch, bao gồm tế bào B và các tế bào trình
diện kháng nguyên khác (APC: antigen‐
presenting cells) với nhiệm vụ trình diện các
peptide ngoại lai từ các tác nhân gây bệnh cho tế
bào lympho T CD4 và sau đó các tế bào T này sẽ
hoạt hóa các tế bào B và sản sinh ra hàng loạt các
kháng thể trung hòa tác nhân gây bệnh.
Đến nay, trên 12.000 biến thể HLA lớp I và
trên 4.000 biến thể HLA lớp II đã được ghi nhận
và số lượng này dự kiến sẽ tăng dần trong tương
lai, trong số này, một số gen HLA có thể có hàng
trăm alen, chẳng hạn như HLA‐B27. Tuy có vai
trò hết sức quan trọng trong qúa trình cấy ghép
nhưng kỹ thuật định típ HLA hiện tại ở Việt
Nam vẫn dùng phương pháp khuếch đại DNA
bằng chuỗi mồi đặc hiệu (SSP‐PCR: sequence‐
specific primer polymerase chain reaction và
SSO‐PCR: sequence‐specific oligonucleotide
polymerase chain reaction). Hai kỹ thuật này có
nguyên lý tương tự nhau và đã được phát minh
vào khoảng 20 năm trước. Trong phản ứng SSP‐
PCR, các bộ mồi (primer) được thiết kế sẵn để
nhận diện các vùng đa hình ở các locus HLA, các
típ HLA sau đó sẽ được xác định bằng cách điện
di sản phẩm PCR trên thạch agarose, phương
pháp này chỉ cho độ phân giải của HLA ở mức 2
chữ số. Phương pháp SSO‐PCR hiện đại hơn, có
độ phân giải cao hơn đạt mức 4 chữ số, cũng

dựa trên nền tảng thực hiện phản ứng PCR bằng
bộ mồi được thiết kế sẵn, nhưng sau đó sản
phẩm PCR sẽ không được phân tích trên thạch
agarose mà sẽ được chuyển lên một màng lai, tại
đó một bộ các phân tử đầu dò oligonucleotide có
gắn chất chỉ thị sẽ được lai với sản phẩm PCR và
sau đó típ HLA sẽ được xác định dựa vào các
chất chỉ thị gắn trên các đầu dò. Các kỹ thuật
định típ HLA này còn nhiều nhược điểm:
Độ phân giải thấp (2 ‐ 4 chữ số);
Tốn thời gian (một lần phản ứng SSO‐PCR
chỉ xác định được 1 locus HLA);
Không phát hiện hoặc dễ nhầm lẫn trong các
trường hợp bệnh nhân mang các alen HLA

112

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019
hiếm, mới;
Ngày càng có nhiều các alen HLA mới được
phát hiện, do đó các bộ kit này cần được cập
nhật liên tục.
Trong khi đó, trên thế giới, việc định típ
HLA dựa chủ yếu vào phương pháp xác định
trình tự nucleotid bằng phương pháp Sanger
hoặc giải trình tự thế hệ mới (SBT: sequence
based HLA typing) với độ phân giải có thể chấp
nhận trên lâm sàng là 4 chữ số, đây được xem là
phương pháp chính xác và đáng tin cậy nhất
hiện nay và là tiêu chuẩn vàng trong việc xác

định HLA ở các trung tâm cấy ghép lớn(6). Có 2
phương pháp giải trình tự để định típ HLA là
giải trình tự Sanger truyền thống và giải trình tự
thế hệ mới. Có rất nhiều kỹ thuật giải trình tự
thế hệ mới đã được áp dụng để định típ HLA
với các độ chính xác và sai lệch khác nhau. Theo
thống kê tại Hội nghị thế giới lần thứ 16 về HLA
vào năm 2013, nền tảng giải trình tự của hệ
thống Illumina được xem là ưu việt nhất trong
việc định típ HLA với tỉ lệ sai sót vào khoảng
0,32%, tốt nhất nếu so sánh với các nền tảng kỹ
thuật khác như 454 GS (Roche), Ion Torrent
PGM và Pacific Biosciences có tỉ lệ sai sót lần
lượt là 1,2%, 1,71% và 14,1%(1); vì vậy, chúng tôi
quyết định chọn nền tảng kỹ thuật của Illumina
để thực hiện trong nghiên cứu này.
Hiện nay tại Việt Nam, các công trình nghiên
cứu về HLA đại đa số đều dừng ở mức độ phân
giải thấp và sử dụng phương pháp SSO‐PCR(2,8).
Do đó, thông qua nghiên cứu này, chúng tôi
muốn tiến hành nghiên cứu áp dụng quy trình
xác định phức hợp HLA bằng phương pháp giải
trình tự nhằm khắc phục các nhược điểm của
phương pháp PCR truyền thống.

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành định típ HLA các
locus A, B, C, DRB1 và DQB1 cho 66 đối tượng
tình nguyện tham gia nghiên cứu. Tất cả các

đối tượng tham gia nghiên cứu đều là người
Kinh và chưa từng được cấy ghép tế bào gốc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019
tạo máu trước đây.
Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết Genomic DNA
Máu toàn phần của đối tượng tham gia
nghiên cứu sẽ được thu nhận và lưu trữ bằng
ống chống đông EDTA. DNA từ mẫu máu được
tách chiết bằng bộ kit QIAamp DNA Kit
(Qiagen, Mỹ), theo hướng dẫn sử dụng của nhà
sản xuất.
Tạo thư viện cho giải trình tự thế hệ mới: các
bước được thực hiện bằng bộ kit HLA Trusight
(Illumina, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất
Tạo các amplicon HLA bằng phản ứng long‐
range PCR với bộ mồi theo điều kiện của nhà
cung cấp.
Tinh sạch sản phẩm PCR;
Đồng nhất các amplicon HLA;
Phân đoạn sản phẩm PCR thành các đoạn
DNA có chiều dài từ 300 ‐ 500bp;
Hợp nhất mẫu và tinh sạch sản phẩm sau
phản ứng phân cắt;
PCR khuếch đại mẫu và gắn adapter và
vùng nhận diện (index) cho các mẫu;
Tinh sạch sản phẩm PCR;

Hợp nhất thư viện cuối cùng;
Kiểm tra lại thư viện đạt chuẩn bằng Qubit
và pha loãng tới nồng độ phù hợp để chạy máy.
Phương pháp giải trình tự các gen phức hợp
HLA bằng máy giải trình tự thế hệ mới
MiniSeq
Nạp mẫu thư viện và tiến hành chạy với bộ
chip MiniSeq Mid Output Reagent (300‐cycles)
(Illumina, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Khai báo các thông số cần thiết để máy có
thể nhận diện được các mẫu giải trình tự.
Tiến hành chạy máy trong 20 ‐ 24 giờ.
Phương pháp phân tích kết quả giải trình tự
các gen phức hợp HLA bằng máy giải trình tự
thế hệ mới MiniSeq
Nhập file kết quả từ máy giải trình tự
MiniSeq.

Nghiên cứu Y học
Phần mềm HLA Trusight (Illumina, Mỹ) sẽ
tự động so sánh kết quả giải trình tự thu được
với các trình tự chuẩn từ ngân hàng dữ liệu
IMGT/HLA phiên bản 3.23.0.1 cập nhật ngày
19.01.2016.
Phần mềm xuất kết quả định típ HLA cho
các mẫu tương ứng.

Phương pháp so sánh, thống kê, xử lý số liệu
Số liệu sau khi thu nhận được phân tích,
đánh giá bằng phần mềm Excel 2010.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tạo thư viện cho giải trình tự thế hệ mới

Phản ứng long range PCR
Phản ứng long range PCR với bộ mồi và quy
trình thực hiện theo các điều kiện của nhà sản
xuất, sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ
được điện di trên thạch agarose 0.8% cho kết quả
phù hợp với kết quả dự kiến ban đầu về kích
thước các đoạn DNA được khuếch đại tại các
locus HLA, cụ thể như sau:
A: 4,1 kb
B: 2,8 kb
C: 4,2 kb
DPA1: 10,3 kb
DPB1: 9,7 kb
DQA1: 7.3 kb
DRB: 4.6 kb
DQB1: 7.1 kb

Hình 1: Kết quả điện di các sản phẩm long range PCR

Kiểm tra mẫu bằng Bioanalyzer để cho thấy
sự phân bố và kích thước DNA
Sau bước hợp nhất thư viện, sản phẩm cho
thấy có độ phân bố các đoạn DNA phù hợp

113

Nghiên cứu Y học
với khuyến cáo của nhà sản xuất. Nồng độ sản
phẩm cuối cùng được đo bằng máy Qbit và
dựa vào đó để pha loãng mẫu xuống nồng độ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019
DNA cuối cùng đạt được trước khi chạy máy
giải trình tự theo khuyến cáo của nhà sản xuất
là 1,5 – 1,8 pM.

Hình 2: Phân bố kích thước DNA của mẫu bằng phương pháp đo Bioanalyzer
Chạy máy giải trình tự MiniSeq
66 mẫu được tiến hành giải trình tự các locus
HLA trong 3 lần chạy giải trình tự.
Mật độ tạo cụm (cluster density) trên flow
cell trong các lần chạy lần lượt là: 216 k/mm2, 218
k/mm2, 215 k/mm2.
Các thông số của mỗi lần chạy máy đều đạt
mức cho phép với Q30 score > 80%, độ sâu trung
bình đạt mức xấp xỉ 250X và độ sâu tối thiểu đạt
mức 150X.

Hình 4: Độ sâu trung bình của các locus HLA

Dưới đây các thông số tổng hợp của các lần
chạy máy

Hình 5: Chỉ số Q30 của các locus HLA
Sử dụng phần mềm HLA Assign Trusight để

phân tích các kết quả
Hình 3: Độ sâu tối thiểu của các locus HLA

114

Kết quả phân bố tần suất các alen HLA được
tóm tắt trong bảng sau.


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019
Bảng 1: Tần suất các alell HLA lớp 1 trong dân số
nghiên cứu (N=66)
A
Tần suất
(%)
01:01:01
0,8
02:01:01
3,0
02:03:01
8,3
02:03:02
0,8
02:06:01
3,8
02:07:01
9,1
03:02:01
0,8
11:01:01 23,5

11:02:01
1,5
24:02:01 15,2
24:03:01
0,8
24:07:01
3,0
24:10:01
0,8
24:20
1,5
26:01:01
3,0
29:01:01
8,3
30:01:01
0,8
31:01:02
0,8
32:01:01
0,8
33:01:01
0,8
33:03:01
9,8
34:01:01
1,5
68:01:02
0,8
74:02:01

0,8
Alell

Alell

B
Tần suất
(%)

07:02:01
07:05:01
08:01:01
13:01:01
13:02:01
15:01:01
15:02:01
15:11:01
15:12
15:25:01
15:27:01
15:35
18:01:01
18:02
27:06
35:01:01
35:03:01
35:05:01
37:01:01
38:02:01
39:01:01

40:01:02
40:06:01
44:03:02
46:01:01
48:01:01
51:01:01
51:02:01
52:01:01
54:01:01
55:02:01
55:18
56:01:01
56:04
57:01:01
58:01:01

0,8
6,8
0,8
3,8
1,5
1,5
12,1
0,8
1,5
6.8
0,8
0,8
1,5
0,8

1,5
1,5
0,8
3,0
0,8
6.8
0,8
7,6
3,0
1,5
9,8
0,8
3,0
0,8
0,8
1,5
3,0
0,8
2,3
1,5
0,8
7,6

C
Alell

Tần
suất (%)

01:02:01

03:02:02
03:03:01
03:04:01
03:17
04:01:01
04:03:01
04:82
06:02:01
07:01:01
07:02:01
07:04:01
07:06
08:01:01
08:03:01
12:02:02
14:02:01
15:02:01
15:05:02

14,5
7,6
4,6
8,4
0,8
5,3
9,9
0,8
2,3
0,8
18,3

1,5
0,8
13,0
0,8
0,8
2,3
0,8
6,9

DRB1
Tần suất (%)
8.3
0.8
0.8
8.3
1.5

Alell
02:01:01
02:02:01
03:01:01
03:02:01
03:02:02

Alell
07:01:01
08:03:01
08:03:02
09:01:02
10:01:01

11:01:01
11:06:01
11:129
12:02:01
13:01:01
13:02:01
13:12:01
14:04:01
14:05:01
14:18
14:54:01
15:01:01
15:02:01
16:02:01

DRB1
Tần suất (%)
3,8
0,8
5,3
12,1
8,3
1,5
2,3
0,8
22,7
0,8
0,8
2,3
0,8

0,8
0,8
0,8
2,3
8,3
5,3

Alell
03:03:02
03:03:05
04:01:01
04:02:01
05:01:01
05:01:03
05:01:12
05:02:01
05:02:02
05:03:01
05:03:02
05:03:11
05:18
06:01:01
06:02:01
06:03:01
06:09:01

DQB1
Tần suất (%)
11,4
0,8

6,1
1,5
9,8
0,8
0,8
12,1
1,5
2,3
0,8
0,8
1,5
7,6
0,8
0,8
0,8

BÀN LUẬN
Các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam trước
đây về khảo sát tần suất các alen HLA đều được
tiến hành bằng phương pháp SSO‐PCR và cho
độ phân giải 4 chữ số. Kết quả của nhóm nghiên
cứu chúng tôi cũng cho thấy mức độ tương đồng
về các allel HLA lưu hành trong dân số người
Kinh Việt Nam như: A*11:01, A*24:02, A*33:03;
B*15:02, B*46:01, B*38:02; C*01:02, C*07:02,
C*08:01; DRB1*12:02, DRB1*09:01; DRB1*15:02,
DQB1*03:01, DQB1*03:03, DQB1*05:01(2,8).
Như dự đoán ban đầu của nhóm nghiên
cứu, khi thực hiện định típ HLA với độ phân
giải cao bằng phương pháp giải trình tự thế hệ

mới, chúng tôi đạt được những ưu điểm sau so
với phương pháp SSO‐PCR cũ:

Bảng 2: Tần suất các alell HLA lớp 2 trong dân số
nghiên cứu (N=66)
Alell
03:01:01
04:01:01
04:03:01
04:05:01
04:06:01

Nghiên cứu Y học

DQB1
Tần suất (%)
7.6
2.3
27.3
2.3
0.8

Độ phân giải cao: như trong nghiên cứu
trước đó của Hoa và cs(2), chúng ta thấy độ phân
giải chỉ dừng ở mức allel DQB1*05:01,
DQB1*05:02, DQB1*05:03 còn trong nghiên cứu
của chúng tôi, độ phân giải này được chỉ định rõ
lần lượt là 05:01:01, 05:01:03, 05:01:12, 05:02:01,
05:02:02, 05:03:01, 05:03:02, 05:03:11;
Phát hiện một số allel mới chưa được mô tả:

A*24:20, A*31:01:01, A*31:01:02, A*32:01:01,

115


Nghiên cứu Y học
A*33:01:01, B*07:02:01, B*15:11:01, B*15:12,
B*15:35, B*37:01:01, B*40:06:01, B*55:18, C*03:17,
C*07:06, C*03:04:01, C*08:03:01, C*07:02:01,
C*08:01:01,
DRB1*11:06:01,
DRB1*13:12:01,
DRB1*14:18, DRB1*14:54:01, DQB1*02:02:01,
DQB1*03:03:02, DQB1*03:03:05, DQB1*06:09:01;
Do đặc điểm dân số tương đồng của các đối
tượng dân số Châu Á nên tần suất lưu hành của
các allel phổ biến có những nét tương tự. Có thể
thấy trong dân số Châu Á các allel phổ biến là
A*24:02, A*11:01; C*01:02, C*07:02; DRB1*09:01;
DQB1*03:01, DQB1*03:03(3,4,5,7).
Tuy nhiên, khi so sánh các allel có tính đa
hình cao như HLA‐B hoặc HLA‐DRB1, ta có thể
thấy chủng tộc người Kinh Việt Nam có nhiều
nét tương đồng với các dân số lân cận như người
Thái hoặc người Hán Trung Quốc, trong khi đó
người Hàn Quốc lại có nhiều nét tương đồng với
người Nhật Bản hơn(3,4,5,7).

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019
Bên cạnh đó, chúng tôi cũng xác định được một

số biến thể HLA chưa từng được tìm thấy trước
đây trong các nghiên cứu về HLA trên quần thể
người Việt Nam như A*24:20; B*07:02, B*55:18;
C*03:17…

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.

3.

4.

5.

6.

KẾT LUẬN
Định típ HLA độ phân giải cao bằng phương
pháp giải trình tự gen là xu hướng mới trong
tiếp cận định típ HLA phục vụ cho cấy ghép ở
người. Quy trình định típ HLA bằng phương
pháp giải trình tự ổn định, có tính lặp lại cao và
có thể chuyển giao. Thông qua nghiên cứu này,
chúng tôi xác định được tần suất các alell HLA
lớp I và II phổ biến lưu hành trên đối tượng
tham gia nghiên cứu, làm tiền đề cho việc xây
dựng ngân hàng tế bào gốc tuỷ xương sau này.

116

7.

8.

De Santis D, Dinauer D, Duke J et al (2013). 16IHIW HLA typing
by NGS: Workshop review. Int J Immunogenet, 40(1):72–76.
Hoa BK, Hang NTL, Kashiwase K et al (2008). HLA‐A, ‐B, ‐C, ‐
DRB1 and ‐DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population
in Vietnam. Tissue Antigens, 71(2):127–134.
Ikeda N, Kojima H, Nishikawa M et al (2015). Determination of
HLA‐A, ‐C, ‐B, ‐DRB1 allele and haplotype frequency in
Japanese population based on family study. Tissue Antigens,
85(4):252–259.
Lee KW, Oh DH, Lee C, Yang SY (2005). Allelic and haplotypic
diversity of HLA‐A, ‐B, ‐C, ‐DRB1, and ‐DQB1 genes in the
Korean population. Tissue Antigens, 65(5):437–447.
Nakkam N, Konyoung P, Kanjanawart S, Saksit N, Kongpan T,
Khaeso K, Khunarkornsiri U, Dornsena A, Tassaneeyakul W,
Tassaneeyakul W (2018). HLA Pharmacogenetic Markers of
Drug Hypersensitivity in a Thai Population. Front Genet, doi:
10.3389/fgene.2018.00277.
Saber W, Opie S, Rizzo JD, Zhang M‐J, Horowitz MM, Schriber J
(2012). Outcomes after matched unrelated donor versus
identical sibling hematopoietic cell transplantation in adults
with acute myelogenous leukemia. Blood, 119(17): 3908–3916.
Shen Y, Cao D, Li Y et al (2014). Distribution of HLA‐A, ‐B, and ‐
C Alleles and HLA/KIR Combinations in Han Population in
China. J Immunol Res, doi: 10.1155/2014/565296.
Vu‐Trieu A, Djoulah S, Tran‐Thi C, Ngyuyen‐Thanh T et al

(1997). HLA‐DR and ‐DQB1 DNA polymorphisms in a
Vietnamese Kinh population from Hanoi. Eur J Immunogenetics
Off J Br Soc Histocompat Immunogenetics, 24(5):345–356.

Ngày nhận bài báo:

08/11/2018

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

04/12/2018

Ngày bài báo được đăng:

10/03/2019