Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A
Lưu Vũ Dũng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh
Trư ng
h YH N
H
g n

h
nh r
n ng
tr
n n tr n nh
th g t nh g r
t
n tr n
t n
t
nh 1 5000 tr tr Ch
nn
r t nh
ngh n
t
ng n
ư
g
h nh
tN
hư
ngh n

n t n
n
ng t
n
ư
ng
t ngh n
ư th h n nh
nh
ng t
n tr n g n
nh nh n h
h
t
tN
0 nh nh n H
h
ư
h n
n tr n
ng ư
h n
h nt hg n
th t n r n
- PC
t
PC
th t g tr nh t g n ư
ụng
h th n t

n tr n t n
g n
t
h th 2 0 nh nh n
t
ng n
g
9 nh nh n
t
n
n 1
nh nh n
t
n
1 nh nh n
t
n
t n
t
0 nh nh n hư h t h n ư
t
n tr n g n
Từ khóa: Hemophilia A, đột biến gen F8.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền
hay gặp nhất với tần suất mắc 1/5000 trẻ trai [1]. Bệnh
gây nên do thiếu hoặc không có yếu tố VIII trong huyết
tương - đó là một trong những yếu tố tham gia quá trình
đông máu. Gen F8 là một trong những gen lớn nhất cơ

thể, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể giới tính X
(Xq28) và không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể
Y, kích thước 186 kb gồm 26 exon, mỗi exon có chiều
dài từ 69 đến 3106 cặp bp [2].
Kể từ khi trình tự gen F8 được công bố năm 1984,
một số lượng lớn các đột biến gây bệnh Hemophilia A
đã được xác định; phổ biến nhất là đột biến điểm như
đột biến thay thế nucleotid, đột biến vô nghĩa (nonsense
mutation), đột biến thêm nucleotid và mất nucleotid,
chiếm tỷ lệ khoảng 45 - 50%; tiếp theo là đột biến đảo
đoạn intron 1 và intron 22 chiếm tỉ lệ khoảng 30 - 35%,
gặp chủ yếu ở bệnh nhân hemophillia A thể nặng, trong
đó đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỉ lệ cao hơn
(khoảng 30 - 33%); còn lại là đột biến xóa đoạn chiếm
tỉ lệ 10 - 15% [2; 3; 4]. Tùy vào kiểu và vị trí đột biến sẽ
gây ra các thể bệnh nặng và nhẹ khác nhau [2].
Để xác định toàn diện các dạng đột biến gen F8, cần
phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau tùy vào từng
dạng đột biến [5]. Đối với đột biến điểm, kỹ thuật giải
trình tự thường được sử dụng để xác định đột biến,
tuy nhiên do đột biến nằm rải rác khắp chiều dài gen
F8 nên cần phải giải trình tự toàn bộ gen F8 mới có
thể phát hiện được đột biến. Đối với đột biến đảo đoạn,
h n h Tr n n h nh Tr ng t
Pr t n trư ng
h YH N
n h nh
h
Ng nh n 22 2014

Ngh n

n-

có nhiều kỹ thuật xác định như kỹ thuật Southern Blot,
kỹ thuật LD - PCR (Long distance - PCR) và kỹ thuật
I - PCR (Inversion - PCR), mỗi kỹ thuật đều có những
ưu nhược điểm khác nhau, kỹ thuật Southern Blot được
phát triển đầu tiên để phát hiện đột biến đảo đoạn intron
1 và intron 22, tuy nhiên kỹ thuật này khá phức tạp, mất
thời gian thường khoảng 8 - 10 ngày và có sử dụng
chất phóng xạ nên khá độc hại. Kỹ thuật LD - PCR
không phức tạp như kỹ thuật Southern Blot, thời gian
tiến hành nhanh hơn nhưng cần phải khuếch đại đoạn
PCR khá dài (10 - 12 kb) nên đôi khi gặp nhiều khó
khăn, nhất là ở những vùng gen có chứa những đảo
GC. Gần đây, kỹ thuật I - PCR (Invesion - PCR) được
ứng dụng nhiều trong xác định đột biến đảo đoạn intron
1 và intron 22 gen F8, kỹ thuật này có ưu điểm là độ
chính xác cao, dễ tiến hành, sản phẩm PCR có kích
thước ngắn (487 và 559 bp) nên dễ khuếch đại [6; 7; 8;
9; 10; 11]. Với đột biến xóa đoạn, người ta thường dùng
kỹ thuật PCR để xác định đột biến [5].
Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về
lâm sàng và điều trị bệnh hemophilia A, tuy nhiên chưa
có công trình công bố toàn diện các loại đột biến trên
gen F8 gây bệnh Hemophilia A. Vì vậy, nghiên cứu này
được tiến hành với mục tiêu: Xác định các dạng đột
biến trên gen F8 ở một số bệnh nhân hemophilia A tại
Việt Nam.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
- Nhóm chứng: 5 người nam bình thường, tiền sử gia
đình không có người mắc bệnh di truyền.
- Nhóm nghiên cứu: 30 bệnh nhân được chẩn đoán mắc
bệnh hemophilia A dựa vào triệu chứng lâm sàng và
định lượng protein yếu tố VIII trong huyết tương tại viện
13


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
Nhi Trung ương và viện Huyết học - Truyền máu Trung
ương; gồm: 22 bệnh nhân thể nặng, 5 bệnh nhân thể
trung bình và 3 bệnh nhân thể nhẹ.
2. Phương pháp
Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo các bước
sau:
- Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 và intron 1 ở
những bệnh nhân hemophilia A thể nặng.
- Các bệnh nhân thể nặng không phát hiện có đột biến
đảo đoạn cùng với những bệnh nhân còn lại được
khuếch đại 26 exon của gen F8, giải trình tự gen và so
sánh với trình tự gen F8 trên GenBank để phát hiện đột
biến điểm, đột biến mất hoặc đột biến thêm các exon.
2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA
- DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân
hemophilia A, sử dụng QIAGEN Kit.
- Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA được tách
chiết bằng phương pháp đo quang trên máy NanoDrop:

nồng độ DNA 300 - 380ng/ml; đánh giá độ tinh sạch
bằng tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
2.2. Kỹ thuật Inversion – PCR xác định đột biến
đảo đoạn intron 22 của gen F8
Quy trình kỹ thuật gồm 3 bước của Rosetti và cộng
sự [3] :(1) Cắt DNA bằng enzym BclI, (2) Nối DNA bằng
T4 ligate, (3) Khuếch đại DNA bằng phản ứng multiplexPCR với cặp mồi trong gen F8 (IU và ID) và cặp mồi
ngoài gen F8 (IU và ED) . Hình ảnh điện di sản phẩm
PCR của DNA người bình thường có 1 băng kích thước
487 bp, của DNA bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron
22 cho 1 băng kích thước 559 bp.
2.3. Kỹ thuật PCR xác định đột biến đảo đoạn
intron 1 của gen F8
Theo quy trình chuẩn của Tizzano và cộng sự [11]:
DNA được khuếch đại bằng hai phản ứng multiplex PCR cho 2 đoạn int1h - 1 và int1h - 2 với các mồi tương
ứng: 9F, 9cR, int1h - 2F và int1h 2F, int1h - 2R, 9F.
Với DNA người bình thường (không có đột biến đảo

đoạn intron 1): trong phản ứng int1h - 1, mồi 9F và mồi
9cR bắt cặp với nhau khuếch đại 1 đoạn gen có kích
thước 1908 bp và trong phản ứng int1h - 2, mồi int1h
- 2F và mồi int1h - 2R bắt cặp với nhau khuếch đại 1
đoạn gen có kích thước 1191 bp. Người bị đảo đoạn
intron1, mồi 9F và mồi int1h2R nhân đoạn gen tái tổ
hợp giữa exon 1 và trình tự int1h có kích thước 1776
bp, mồi 9F và int1h2R nhân đoạn gen tái tổ hợp giữa
exon 2 và trình tự int1h, có kích thước 1323 bp. Như
vậy, hình ảnh điện di sản phẩm PCR của DNA người
bình thường có 2 băng ứng với kích thước 1908 bp và
1191 bp, của DNA bệnh nhân đảo đoạn intron 1 có 2

băng ứng với kích thước 1323 bp và 1776 bp.
2.4. Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp
26 exon của gen F8 được giải trình tự với 38 cặp mồi
theo quy trình:
- Khuếch đại các exon bằng kỹ thuật PCR với những
cặp mồi tương ứng.
- Chạy PCR sequencing bằng cặp mồi xuôi và ngược.
- Giải trình tự trên máy ABI sequencer.
- So sánh kết quả thu được với trình tự gen F8 trên
Genbank (NG_011403).
3. Đạo đức nghiên cứu
Bệnh nhân và người nhà hoàn toàn tự nguyện tham
gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút
lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia
vào nghiên cứu. Bệnh nhân và người nhà bệnh nhân
sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp
cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ
điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm
bảo bí mật.

III. KẾT QUẢ
1. Kết quả xác định đột biến đảo đoạn intron 22 và
intron 1 của gen F8
Đột biến đảo đoạn intron 22:

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR của DNA bệnh nhân xác định đảo đoạn intron 22 gen F8
22 bệnh nhân hemophilia A thể nặng được xét nghiệm phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 gen F8 bằng phương
pháp Inversion-PCR.
M: Marker kích thước 100bp
14

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
1: Người bình thường
3, 7: đột biến đảo đoạn int22
2, 4, 5, 6, 8: không có đảo đoạn
Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR gen F8 cho thấy: mẫu DNA ở giếng 1 của người bình thường, mẫu
DNA ở các giếng 2, 4, 5, 6, 8 là của những bệnh nhân không bị đảo đoạn intron 22, mẫu DNA ở giếng 3 và giếng 7
là của những bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22.
Kết quả 9/22 bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm tỉ lệ 41%.
Xác định đột biến đảo đoạn intron 1:
13/22 bệnh nhân thể nặng không bị đột biến đảo đoạn intron 22 tiếp tục được xét nghiệm phân tích gen tìm đột
biến đảo đoạn intron 1.

Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex - PCR của DNA của bệnh nhân hemophilia A
xác định đảo đoạn intron 1 gen F8.
M: Marker kích thước 1kb; giếng 1 - 2, 3 - 4, 5 - 6 và
7 - 8 ứng với mẫu DNA của bốn bệnh nhân. Giếng 2,
4, 6, 8: băng điện di kích thước 1191 bp trong phản ứng
int1h - 2 giếng 1, 3, 5, 7: băng điện di kích thước 1908
bp trong phản ứng int1h - 1
.
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của DNA bốn bệnh
nhân với các phản ứng int1h - 1 và int1h - 2 xuất hiện
các băng ứng với các đoạn DNA kích thước 1908 bp và
1191 bp, như vậy DNA của bốn bệnh nhân không có đột
biến đảo đoạn intron 1.

Kết quả 13 bệnh nhân thể nặng không có đột biến đảo
đoạn intron 1

2. Kết quả phát hiện đột biến gen F8 của bệnh nhân
hemophilia A bằng giải trình tự gen
13 bệnh nhân thể nặng được xác định không có đột
biến đảo đoạn intron 22 và intron 1, 5 bệnh nhân thể
trung bình và 3 bênh nhân thể nhẹ (tổng cộng số bệnh
nhân là 21/30) được giải trình tự toàn bộ gen F8 để phát
hiện đột biến điểm.

Hình 3. Hình ảnh giải trình tự gen F8 của bệnh nhân mã số HE05
Kết quả cho thấy exon 23 bệnh nhân mã số HE05 có đột biến thay thế nucleotid G>A tại vị trí 108900 trên gen F8.

15


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
Hình ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân mã số
HE05 có đột biến thay thế nucleotid G thành nucleotid A
(G > A) tại vị trí 108900 trên exon 23 của gen F8 (Hình
3A). Phần mềm CLC xác định thay đổi này trên exon 23

là c.6545 G > A, dẫn đến acid amin tại vị trí p. 2182 của
protein yếu tố VIII từ Arginin thành Histidin (Hình 3B).
Như vậy bệnh nhân có đột biến exon 23 của gen F8 tại
vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His).

Bảng 1. Kết quả giải trình tự phát hiện các dạng đột biến gen F8 của 21 bệnh nhân
Mã số bệnh nhân

Exon

Thay đổi nucleotid

Thay đổi acid amin

Thể bệnh

HE 16

1

c.65 G > T

p.Arg22Ile

Nặng

HE 02

2

c.223 G > T

p.Asp75Tyr

Trung bình

HE 30

3

c.301 G > C

p.Asn101His

Nặng

HE 06

3

c.386 A > T

p.GLu129Val

Nhẹ

HE 12

4

c.446 C > T

p.Pro149Leu

Nặng

HE 28

8

c.1268 insG

p.Asp366Gly*Stop

Nặng

HE 25

12

c.1801 A > C

p.Asn601His

Nặng

HE 03

14

c.2777 - 8 insC

p.Ser927Lys

Nặng

HE 17

14

c.2185 delG

p.Ser729Ile

Trung bình

HE 01

14

c.3388 delA

p.Arg1130Gly*fs

Trung bình

HE 18

14

c.3637 insA

p.Ile1213Asn*fs

Nặng

HE 11

14

c.5093 T > C

p.Ile1698Thr

Nhẹ

HE 04

14

c.5144 - 6 delCTC

p.Phe1672del

Nặng

HE 07

14

c.5177 G > A

p.Trp1726Stopl

Nặng

HE 13

18

c.5953 C > T

p.Arg1985Stop

Nặng

HE 09

22

c.6374 G > C

pSer2125Thr

Nặng

HE 14

23

c.6545 C > T

p.Arg2182Cys

Trung bình

HE 05

23

c.6545 G > A

p.Arg2182His

Trung bình

HE 29

chưa phát hiện được đột biến

Nặng

HE 26

chưa phát hiện được đột biến

Nặng

HE 08

chưa phát hiện được đột biến

Nhẹ

Giải trình tự các exon của gen F8 ở 21 bênh nhân đã
phát hiện 17 bệnh nhân bị đột biến điểm, 1 bệnh nhân
bị đột biến mất 3 nucleotid, 3 bệnh nhân không phát
hiện được đột biến, các đột biến này đã được công bố
là gây nên bệnh.
Trong 30 bệnh nhân hemophilia A được phân tích

gen F8 đã phát hiện: 9 bệnh nhân thể nặng bị đột biến
đảo intron 22, 17 bệnh nhân bị đột biến điểm (11 bệnh
nhân thể nặng, 4 bệnh nhân thể trung bình, 2 bệnh nhân
thể nhẹ), 1 bệnh nhân thể trung bình bị đột biến mất 3
nucleotid và 3 bệnh nhân chưa phát hiện được đột biến
(2 bệnh nhân thể nặng và 1 bệnh nhân thể nhẹ).
16

IV. BÀN LUẬN
Hiện nay việc chẩn đoán hemophilia A được thực
hiện ở một số phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng
các phương pháp gián tiếp như khai thác tiền sử, định
lượng nồng độ các yếu tố máu chảy - máu đông và
nồng độ của yếu tố VIII trong huyết tương. Các phương
pháp này bộc lộ nhiều hạn chế, khó chẩn đoán được
những trường hợp không đủ thông tin từ phả hệ của gia
đình hoặc những trường hợp hemophilia A mới mắc.
Bởi vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
để phân tích gen đã cho phép xác định vị trí đột biến


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
trên gen F8 gây bệnh hemophilia A với độ tin cậy và
chính xác cao. Các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều
dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Đột biến
đảo đoạn intron 22 hoặc intron 1, đột biến xóa đoạn
và thêm đoạn lớn dẫn đến bất hoạt hoặc làm đứt gãy
gen F8 mã hóa sự tổng hợp protein yếu tố VIII và gây
bệnh hemophilia A thể nặng. Các đột biến điểm thay
thế một nucleotid, đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã

kết thúc hoặc đột biến gây lệch khung dịch mã dẫn đến
không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức
năng; những dạng đột biến này là cơ chế chính gây
bệnh hemophilia A thể vừa và nhẹ. Các nghiên cứu về
mối quan hệ giữa vị trí đột biến trên gen F8 gây bệnh
hemophilia A và kháng thể kháng yếu tố VIII có thể cải
thiện việc điều trị bằng yếu tố VIII tái tổ hợp và trong liệu
pháp điều trị gen [12].
Bệnh nhân hemophilia A thể nặng chiếm tỉ lệ cao
và thường bị đột biến đảo đoạn intron 22 hoặc intron 1
trên gen F8, trong đó đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm
30 - 35% và đột biến đảo đoạn intron 1 chiếm khoảng 1
- 2% [2]. Do đó, việc làm trước tiên là phân tích gen tìm
đột biến đảo đoạn intron 22 và intron 1. Nghiên cứu này
đã sử dụng phương pháp Inversion PCR của Rosetti và
cộng sự phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22. Kết quả
9/22 bệnh nhân được chẩn đoán hemophilia A thể nặng
bị đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm 41% và phù hợp
với nghiên cứu của nhiều tác giả trước đây đã công bố.
Áp dụng kỹ thuật của Tizzano và cộng sự, nghiên cứu
không phát hiện trường hợp nào có đột biến đảo đoạn
intron 1, kết quả này có thể do cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ.
Một nghiên cứu gần đây đưa ra tỷ lệ đột biến intron 1
là 1% [10; 11].
13 bệnh nhân hemophilia A thể nặng không phát
hiện có đột biến đảo đoạn intron, 5 bệnh nhân thể trung
bình, 3 bệnh nhân thể nhẹ được khuếch đại 26 exon
gen F8 và giải trình tự để tìm những đột biến khác. Có
17 bệnh nhân (11 bệnh nhân thể nặng, 4 bệnh nhân
thể trung bình, 2 bệnh nhân thể nhẹ) đã tìm thấy bị đột

biến thay thế một nucleotid. Hình 3 minh họa kết quả
xác định đột biến điểm gen F8 của một bệnh nhân bằng
phương pháp giải trình tự gen. Bệnh nhân mã số HE 05
có đột biến thay thế nucleotid G thành nucleotid A (G >
A) tại vị trí 108900 trên exon 23. Để kiểm tra khả năng
làm thay đổi acid amin và xác định vị trí trên mRNA và
trên chuỗi polypeptid bất thường ở bệnh nhân, nghiên
cứu đã sử dụng phần mềm CLC và so sánh trên NBCI.
Phần mềm CLC xác định vị trí nucleotid thay đổi trên
exon 23 là c.6545 G > A, dẫn đến protein yếu tố VIII
tại vị trí p.2182 từ Arginin thành Histidin. Như vậy bất
thường này là đột biến gây bệnh và đột biến này đã
được Tuddenham công bố năm 1994 [5]. Từ đây có thể
kết luận bệnh nhân HE 05 có đột biến exon 23 của gen

F8 tại vị trí c.6545 G > A (p.Arg2182His) và đột biến này
là nguyên nhân gây bệnh hemophilia A ở bệnh nhân
trên. Các bệnh nhân khác có các vị trí đột biến ở bảng 1
đều đã được công bố trên bộ cơ sở dữ liệu HAMSTeRS
hoặc CDC là những trang quản lý thông tin về bệnh
hemophilia A của Anh và Mỹ. Có 3/21 bệnh nhân không
phát hiện được đột biến, chiếm tỷ lệ 10%.
Như vậy, 27/30 bệnh nhân đã phát hiện được vị trí
đột biến trên gen F8, chiếm tỉ lệ 90%, Anne Goodeve và
cộng sự đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để
xác định các đột biến trên toàn bộ gen F8 tại các exon,
các intron và vùng khởi động promoter và tỷ lệ không
phát hiện được đột biến là 2 ÷ 7% [14]. Tỷ lệ không
phát hiện được đột biến trong nghiên cứu này cao hơn
so với Anne Goodeve nhưng phù hợp với công bố của

Maurizio Margaglione nghiên cứu trên 1296 bệnh nhân
Hemophilia A ở Italia là 11% [15].

V. KẾT LUẬN
Với các kỹ thuật xác định đảo đoạn intron 22, intron
1 và giải trình tự toàn bộ 26 exon của gen F8, nghiên
cứu đã phân tích gen của 30 bệnh nhân hemophilia A
và phát hiện được 9 bệnh nhân thể nặng bị đột biến đảo
intron 22, 17 bệnh nhân bị đột biến điểm (11 bệnh nhân
thể nặng, 4 bệnh nhân thể trung bình, 2 bệnh nhân
thể nhẹ), 1 bệnh nhân thể trung bình bị đột biến mất 3
nucleotid và 3 bệnh nhân chưa phát hiện được đột biến
(2 bệnh nhân thể nặng và 1 bệnh nhân thể nhẹ).

Lời cảm ơn
Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí
bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật
sinh học phân tử phát hiện đột biến gen yếu tố VIII gây
bệnh hemophilia A” nhóm nghiên cứu xin tran trọng sự
giúp đỡ của các cán bộ của trung tâm Nghiên cứu Gen
- Protein, bộ môn Hoá sinh, trường Đại học Y Hà Nội.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Miao Liang Liu, Michael EP, Murphy, et al (1998).
A domain mutations in 65 haemophilia A families and
molecular modelling of dysfunctional factor VIII proteins.
rt h
rn
H
t g 103, 1051 - 1060

2. Shin YL, Yi NS, Chia CH, et al (2008). Mutation
spectrum of 122 hemophilia A families from Taiwanese
population by LD-PCR, DHPLC, multiplex PCR and
evaluating the clinical application of HRM.
n t
9 (53), 205 - 220
3. Dezsö D,Célia V, Isabel M, et al (2006). The spectrum
of mutations and molecular pathogenesis of hemophilia
17


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
A in 181 Portuguese patients.H
t g
91, 840
- 843
4. Zhihui H, Juan C , Shiyan X, et al (2013). A Strategy
for the Molecular Diagnosis in Hemophilia A in Chinese
Population. C
h
h
65, 463 – 472
5. Tuddenham EG, Cooper DN. (1994). Haemophilia
A: database of nucleotide substitutions, deletions,
insertions and rearrangements of the factor VIII gene,
second edition. N
22, 3511 - 3516.
6. Liu Q, Nozari G, Sommer S. (1998). Single-tube
polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the
inversion hotspot of mutation in haemophilia A.

92, 1458 – 1459.
7. Tizzano EF, Domenech M, Baiget M. (1995).
Inversion of intron 22 in isolated cases of severe
hemophilia
Thr
H
t 73, 6 – 9
8. Bowen DJ, Keeney S. (2003). Unleashing the longdistance PCR for detection of the intron 22 inversion of
the factor VIII gene in severe haemophilia
Thr
H
t 89, 201 – 202.
9. Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M, et al (1995).
Factor - VIII gene inversions in severe hemophilia - A:
results of an international consortium study.
86,
2206 - 2212

10. Rossetti LC, Radic CP, Larripa IB, De Brasi CD
(2005). Genotyping the Hemophilia Inversion Hotspot
by Use of Inverse PCR. H
t
n Thr
154 – 158.
11. Tizzano EF, Cornet M, Baiget M. (2003). Inversion
of intron 1 of the factor VIII gene for direct molecular
diagnosis of hemophilia A. H
t g
88(1), 118
- 120.

12. Kaufman RJ, Pipe SW. (1998). Can we improve on
nature? Super molecules of factor VIII. H
h
4,
370 - 379.
13. Repesse Y, Slaoui M, Ferrandiz D. (2007).
Factor VIII (FVIII) gene mutations in 120 patients with
hemophilia A: detection of 26 novel mutations and
correlation with FVIII inhibitor development. Thr
H
t 5, 1469 – 1476.
14. Anne Goodeve. (2008). Molecular genetic testing
of Hemophilia A. Thr
n H
t
34, 491
- 501.
15. Maurizio Margaglione, Giancarlo Castaman,
Massimo Morfini, et al (2008). The Italian AICE Genetics Hemophilia A database: results and correlation
with clinical phenotype. H
t g
93(5), 722 - 728

Summary
MUTATION ANALYSIS OF F8 GENE IN HEMOPHILIA A PATIENTS
Hemophilia A is an inherited recessive X-linked disease caused by mutation of gene F8 with an incident rate of
one in 5,000 males. So far, many studies on gene mutations have been reported worldwide, but a study with all types
of mutation has not been published in Vietnam. The aim of this study is to detect mutation of gene F8 in Viet Nam
Hemophilia A patient. 30 Hemophilia A patients were selected for this study. Inversion-PCR, multiplex PCR and direct
sequencing were used to detect mutation in F8 gene. The results showed that 9 patients were found to have intron

22 inversion, 17 patients had point mutation, 1 had small deletion, 3 remaining patients were not detected for any
mutation in F8 gene.
Keywords: Hemophilia A, F8 gene mutation.

18