Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của người
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.42 MB, 103 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Đặng Thị Kiều Oanh
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Đặng Thị Kiều Oanh
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH
HƯƠNG
Hà Nội 2013
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Phan Lê Thanh Hương, Trưởng Khoa Vi Khuẩn, Trưởng Phòng Vi
khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã tận tình hướng dẫn,
động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Thủy –
Trưởng Khoa An toàn sinh học Quản lý chất lượng, Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ương và tập thể Khoa đã tạo mọi điều kiện về thời gian cho tôi
thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Vi khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ương học đã chỉ bảo, giúp đỡ, chia sẻ tận tình cho tôi những kinh
nghiệm chuyên môn trong quá trình làm thực nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong Khoa
sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi
trong quá trình học tập.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn luôn động viên tinh thần để tôi
hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Học viên
Đặng Thị Kiều Oanh
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
MỤC LỤC
Capsular polysaccharide .................................................................................
10
Deoxyribonucleic acid ....................................................................................
10
Polymerase chain reaction ..............................................................................
10
ĐẶT VẤN ĐỀ
..................................................................................................
1
1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis
..................................................................
3
1.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................................
3
1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán
5
...........................................................................................................................
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis .................................................................
7
1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis
.......................................................
16
1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG
...................................................................................
20
1.3.1. Đường lây truyền ................................................................................
20
1.3.2. Triệu chứng .........................................................................................
21
1.3.3. Biện pháp phòng bệnh ........................................................................
22
1.3.4. Biện pháp chống dịch ..........................................................................
23
1.3.5. Nguyên tắc điều trị ..............................................................................
23
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM
............................
24
1.4.1. Nuôi cấy phân lập ..............................................................................
24
1.4.2. Nhuộm Gram ........................................................................................
24
1.4.3. Phản ứng catalase ................................................................................
24
1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ: .........................................................
24
1.4.5. Phát hiện vi khuẩn S. suis b ằng ph ản ứng Realtime PCR ...............
25
1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR
............................................................................................
26
1.5.1. Giới thiệu v ề ph ương pháp khuếch đại gen (polymerase chain
reaction – PCR) .............................................................................................
26
1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR .................................................
27
1.5.3. Giới thiệu v ề ph ản ứng PCR đa mồi .................................................
31
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
...........
37
2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
.....................................................................................
37
2.1.1. Chủng vi khu ẩn s ử dụng trong nghiên cứu ......................................
37
2.1.2. Dịch não tủy nền ................................................................................
38
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân đượ c chẩn đoán lâm sàng viêm màng
não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi
được xây dựng trong đề tài): ......................................................................
38
2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: ........................................................................
38
2.1.5. Trang thi ết bị, dụng c ụ .......................................................................
41
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
........................................................................
41
2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng ..............................................
42
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu
tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn .........................................
48
2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt .....................................................
49
2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia ph ản ứng ....................
51
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố
độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đượ c xây dựng trong
nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. .................................................
52
2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo)
với những vi khuẩn phổ bi ến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não
giống S. suis ...................................................................................................
52
2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis
53
.........................................................................................................................
2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP
.............................
54
2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính ....................
54
2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] ...
55
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
..............................................
57
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN
................
57
3.1.1. Tạo bệnh ph ẩm mô phỏng .................................................................
57
3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: .............................
58
3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S.
suis và một số yếu tố độc lực phổ biến ......................................................
60
......................................................................................................................................
61
.......................................................................................................................................
61
3.1.4. Tối ưu hóa các thành phần tham gia ph ản ứng PCR đa mồi phát
hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến .........................
62
.........................................................................................................................................
65
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
.........................................................................................................................................
65
3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR đượ c xây dựng (khả
năng lặp lại kết quả) .....................................................................................
67
Độ lặp lại của kỹ thuật
.............................................................................
68
(10 lần thử nghiệm)
.................................................................................
68
1
............................................................................................................................
68
0/10
....................................................................................................................
68
3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu)
với những vi khuẩn phổ bi ến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis .......
69
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC HIỆN
ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU QUẢ (ĐÁNH
GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI)
..........................................
70
3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI KHI
ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG
.................................................................
75
3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định đượ c vi khuẩn từ bệnh phẩm:
75
.........................................................................................................................
3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phươ ng
pháp .................................................................................................................
76
KẾT LUẬN
...................................................................................................
80
TÀI LIỆU THAM KHẢO
............................................................................
83
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi
điện tử 3
(psf.org/strsu/strsu.home.html) 3
Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và
thạch máu ngựa 4
Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis
( />zoonoticepidemicinasia_4091/) 22
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR 27
( />Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ
hợp 8) 58
Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ
hợp 16) 59
Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện
trực tiếp S. suis trong bệnh phẩm 62
Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là
20pmol/µl 64
Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau 65
Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh
phẩm 66
với các thể tích mẫu khác nhau 66
Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi
khuẩn bởi PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô
phỏng) 67
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp gen mồimồi & quy trình
PCR đa mồi 69
Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 850C và
900C trong 60 phút 71
Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian
ủ khác nhau 72
Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ
800C/60’ 73
Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở
800C/60’(đánh giá bởi PCR đơn mồi) 74
Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã được xây dựng trên
mẫu bệnh phẩm 75
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis
............................
4
Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong
nghiên cứu [11,25,39,41]
...............................................................................
40
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm
................
48
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm
........................
50
Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số
..........................
55
Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR liên quan đến khả năng mắc bệnh và
không mắc bệnh
...........................................................................................
56
Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm
mẫu
.................................................................................................................
57
Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp được lựa chọn trong thí nghiệm
59
.........................................................................................................................
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện
S.suis
...............................................................................................................
60
Bảng 3.4. Khả năng phát hiện vi khuẩn và các yếu tố độc lực khi thay
đổi điều kiện quy trình PCR đa mồi
.........................................................
61
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi được khảo sát
62
.........................................................................................................................
Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu
bệnh phẩm
....................................................................................................
68
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm
dùng/không dùng kit
.....................................................................................
70
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so
với phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144
.............
76
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Bảng 3.9. So sánh kết quả ba hai phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi
và nuôi cấy phân lậpNCPL
.........................................................................
77
Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính xác và sự hữu ích của phương
pháp PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập (n=153)
.....................................
77
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bbp
Base pair
C ()
Chứng âm
C (+)
Chứng dương
Cps
Capsular polysaccharide
DNA
Deoxyribonucleic acid
DNT
Dịch não tủy
Eef
Extracellular factorr
Mrp
Muramidasereleased protein
NCPL
Nuôi cấy phân lập
PCR
Polymerase chain reaction
Pư
Phản ứng
Sly
Suiis lysin
S.suis
Streptococcus suis
VMN
Viêm màng não
VK
Vi khuẩn
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á
trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng
của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm
cho người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch.
Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở người do S. suis đã và đang được coi
là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao.
Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm
khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm
trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện
lớn như Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ
Rẫy, Bệnh viện Trung ương Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên
nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở người lớn
tại Việt Nam.
Ở các nước có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S. suis bởi các kỹ
thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng
các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chí các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến.
Ở Việt Nam, vì sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng
như sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thí ngiệm, những
phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp
dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phương pháp hiện đại, nhanh và chính xác,
phương pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tính khả thi hơn
cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng
(Real time PCR). Với phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát
Đặng Thị Kiều Oanh 1
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
hiện được sự có mặt của vi khuẩn S. suis, xác định được typ huyết thanh (typ 2)
và có thể một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn. Phương pháp này giúp tiết
kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao.
Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và
hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis
từ dịch não tủy của người” với 2 mục tiêu chính sau đây:
Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm
người;
Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ
DNA của S. suis.
Đặng Thị Kiều Oanh 2
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis.suis
1.1.1. Giới thiệu chung
Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, kích thước
khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào. Trong bệnh phẩm, chúng
thường xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hình 1.1). S.suis có yếu tố quyết định
kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về
mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm
này. Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc
nhóm R, S và T tương ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhưng đến
năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu được S.suis có
tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhưng typ 32
và 34 vừa được chứng minh là Streptococcus orisratti. Mặc dù vậy, các chủng
gây bệnh cho người đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và
theo thời gian [50]. Nhưng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là
kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hưởng đến con người rộng rãi trên toàn thế
giới, có rất ít trường hợp gây bệnh ở người do typ 1 và typ 14.
Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử
(psf.org/strsu/strsu.home.html)
Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trường có 5 10% CO2, mọc
trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng như môi trường thạch máu,
Đặng Thị Kiều Oanh 3
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ thích
hợp 370C, nhưng có thể phát triển được ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 –
450C, pH thích hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 37 0C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc
nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.
S. suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trường thạch máu cừu và tan
huyết dạng beta trên môi trường thạch máu ngựa (Hình 1.2).
Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa
Mặc dù chức năng của 2030% bộ gen chưa được biết nhưng nhiều
gen đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã được nghiên cứu. Đó là
những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu
tố hạn chế sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các
enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. Có 17 chủng S.
suis đã được giải trình tự gen. Tùy từng chủng, bộ ben có kích thước từ
2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17
chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein
(Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis
Chromosomes [13] Scaffolds or contigs [3] SRA or Traces [0]
TT
Vi sinh vật
1 S. suis 05ZYH33
Tình
trạng
Chr
Plasmids
1
Đặng Thị Kiều Oanh 4
KT GC
(Mb) %
No data [1]
Gene Protein
2.1 41.1 2,254 2,186
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
TT
Vi sinh vật
Tình
trạng
2 Streptococcus suis P1/7
Streptococcus suis
3
BM407
Streptococcus suis
4
98HAH33
5 Streptococcus suis A7
6 Streptococcus suis D12
7 Streptococcus suis D9
8 Streptococcus suis GZ1
9 Streptococcus suis JS14
10 Streptococcus suis SC84
11 Streptococcus suis SS12
12 Streptococcus suis ST1
13 Streptococcus suis ST3
Streptococcus suis
14
05HAS68
Streptococcus suis
15
89/1591
16 Streptococcus suis R61
17 Streptococcus suis S735
KT GC
(Mb) %
Chr
Plasmids
Gene Protein
1
2.01 41.3 2,011 1,824
1
1
2.17 41 2,136 1,947
1
2.1 41.1 2,253 2,185
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2.04
2.18
2.18
2.04
2.14
2.1
2.1
2.03
2.03
1.64 41.7 1,607 1,559
2.14 41.1 2,162 2,119
2.39 41.2 2,427 2,334
41.2
41.3
41
41.4
41.2
41.1
41.2
41.4
41.3
2,064
2,190
2,196
2,047
2,174
2,068
2,161
2,097
2,053
1,974
2,078
2,074
1,977
2,066
1,898
2,079
1,987
1,952
Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome
1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán
*Vỏ polysacarit của vi khuẩn
S. suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide cps). Việc
định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này.
Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 được cho là có liên quan nhiều
hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng
nhiễm đa typ cũng có thể xảy ra. Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đường:
Galactose, glucose, Nacetyl glucosamine, Nacetyl galactosamine và sialic acid. Ở
typ 2, Nacetyl glucosamine được thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc
của lớp vỏ các typ khác chưa được nghiên cứu sâu.
*Suilysin
Đặng Thị Kiều Oanh 5
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Suilysin là một yếu tố gây tan huyết được mã hóa bởi gen sly của S. suis.
Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tương
đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae).
Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002)
cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn
thương tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thí nghiệm được
tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch). Ngoài ra,
suilysin còn có thể "khởi động" cho quá trình sản xuất và tác động của các
cytokine. Thí nghiệm sử dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh
hưởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến.
Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm
gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không
phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn.
*Hệ thống Arginine deminase
Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định được 2 protein bề mặt vi
khuẩn có kích thước 47 kDa và 53 kDa. Hai protein này có mức độ tương đồng
cao với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. pyogenes. Protein 47 kDa
tương đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tương đồng với
streptococcal acid glycoprotein (SAGP).
ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trình biến đổi arginine thành
ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp. Hệ thống ADS có
mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis
*Protein được giải phóng do muramidase (muramidasereleased protein; mrp) và
yếu tố ngoại bào (extracellular factor ef)
Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ
động vật bị bệnh nhưng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật
Đặng Thị Kiều Oanh 6
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
truyền bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên người, một số nghiên cứu cho thấy tỷ
lệ 69, 6% số chủng phân lập được mang gen mrp.
Mrp và ef cũng được coi là các yếu tố chỉ thị cho S. suis typ 2. Các chủng vi
khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu
là ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã được xác định.
Biến thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp;
mrp*) có mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef. Đã có nghiên cứu
gây nhiễm trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này
có độc lực chẳng khác gì vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng
trong đáp ứng miễn dịch vẫn cần được làm sáng tỏ bằng các thí nghiệm gây
nhiễm thực nghiệm.
*Các yếu tố độc lực khác
Chúng ta đã biết rằng rất nhiều yếu tố có liên quan và chịu ảnh hưởng ở
những giai đoạn khác nhau của quá trình bệnh lý. Cũng như vậy, đối với vi
khuẩn S. suis, gần 40 gen khác nhau đã được tìm thấy (theo Smith và cs, 2001).
Các gen này mã hóa cho các protein có chức năng như: yếu tố điều hòa, vận
chuyển, đảm nhận chức năng đối với quá trình sinh lý của bản thân vi khuẩn và
cả các nhóm chưa xác định được chức năng. Một nghiên cứu gây nhiễm bằng
chủng S. suis có độc lực yếu và bổ sung thêm các gen từ các chủng gây bệnh đã
tìm thấy chuỗi nucleotide có kích thước 3kb mang thông tin quan trọng liên quan
đến độc lực của vi khuẩn.
Năm 2004, Allen và cs. đã xác định yếu tố làm tan có khả năng hỗ trợ cho sự
xâm nhập của vi khuẩn qua tác động đến acid hyaluronic (tương tự như tác động
của nhiều loại vi khuẩn khác).
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis
Quá trình xâm nhập
Đặng Thị Kiều Oanh 7
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Cơ chế xâm nhập của S. suis vào vật chủ ít được biết đến. Các tác nhân gây
bệnh có thể tồn tại trong amidan lợn trong thời gian dài. Mô lympho của amidan
được bao phủ bởi các biểu mô niêm mạc. Đặc biệt ở lợn, diện tích bề mặt vòm
miệng tăng đáng kể do biểu mô lõm sâu trong các mô bạch huyết hình thành rất
nhiều phân nhánh [49]. Có thể là sau khi bám dính và xâm nhập vào các tế bào
biểu mô amidan, vi khuẩn vẫn chưa bị phát hiện bởi hệ thống miễn dịch. Tuy
nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào giải thích việc làm thế nào S. suis có thể vượt
qua hàng rào bảo vệ đầu tiên của vật chủ để gây bệnh. Giả thuyết được chấp
nhận nhất hiện nay là các tác nhân gây bệnh làm thủng biểu mô niêm mạc trong
đường hô hấp trên của lợn [21]. Tương tự như vậy, đối với con người, S. suis có
thể tương tác với các tế bào biểu mô ở bề mặt biểu bì hoặc trong ruột [22, 31].
Có rất ít nghiên cứu về cơ chế tương tác giữa S. suis và các tế bào biểu mô,
ngoại trừ tế bào biểu mô của đám rối màng mạch. Nó đã được báo cáo rằng các
chủng độc lực của S. suis có thể bám vào các tế bào biểu mô đường hô hấp của
người (hình 1) [6, 32, 44]. Các chất bám dính trên bề mặt của S. suis có thể bị
cản trở bởi vỏ polysaccharide (CPS) của chúng. Sự bám dính và sự xâm nhập của
S.suis vào tế bào biểu mô HEP2 ở người diễn ra mạnh mẽ hơn ở những chủng
không có vỏ đã được báo cáo bởi Benga et al [6]. Vì vậy, điều đó có thể được
đưa ra giả thuyết rằng S. suis giảm sự biểu hiện của CPS trong các bước đầu
của quá trình lây nhiễm. Giả thuyết này cần được nghiên cứu sâu hơn.
S. suis tương tác với các thành phần của chất nền ngoại bào (ECM) như
fibronectin và plasminogen [16]. Các protein Fbps liên kết với fibronectin của
người và fibrinogen khi thực hiện trong phòng thí nghiệm [14]. Tuy nhiên, khi làm
đột biến gen fbps không làm giảm khả năng liên kết với fibronectin của người
[16], điều này cho thấy tồn tại khả năng dự phòng của vi khuẩn này trong quá
trình liên kết với các ECM. Thử nghiệm lây nhiễm các chủng đột biến fbps cho
thấy Fbps không cần thiết cho sự xâm nhập của vi khuẩn vào amidan của lợn
(bước đầu tiên của nhiễm trùng) nhưng nó có thể đóng vai trò trong quá trình xâm
Đặng Thị Kiều Oanh 8
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
nhập vào cơ quan khác [14]. Enolaza ở bề mặt của vi khuẩn có vai trò trong sự
liên kết giữa vi khuẩn và plasminogen [42]. Enolaza của S. suis không chỉ liên kết
với plasminogen mà còn liên kết với cả fibronectin. Enolaza của S. suis biểu hiện
cao trong cơ thể lợn bị bệnh sẽ gây đáp ứng sản xuất kháng thể, mặc dù tiềm
năng để enolaza được biết đến như là một kháng nguyên bảo vệ vẫn còn gây
tranh cãi [15, 58]. Gần đây, một dipeptidylpeptidase (DppIV) của S. suis cũng
được chứng minh là tương tác với fibronectin của người, tính độc hại của một
chủng bị đột biến thiếu dppIV bị suy yếu đáng kể [18]. Sự liên kết của S. suis
với collagen cũng đã được báo cáo [16]. Chủng S. suis bị đột biến mất sortase
SrtA cũng làm giảm khả năng bám dính với protein ECM [55], điều này cho thấy
các peptidoglycan cũng rất quan trọng đối với sự tương tác của các tác nhân gây
bệnh này với các protein ECM.
Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng sự bám dính của vi khuẩn vào tế bào biểu
mô như là một mô hình để đánh giá các yếu tố độc lực. Một loại enzyme với
hoạt tính 6phosphogluconatedehydrogenase, amylopullulanase, tất cả đều góp
phần vào sự bám dính của S. suis vào tế bào biểu mô [17]. Đột biến mất các yếu
tố điều hòa 2 thành phần CiaRH hoặc điều hòa phiên mã RevSC21 và CovR cũng
làm cho sự bám dính của S.suis vào tế bào biểu mô bị suy giảm đáng kể [46, 57].
Tuy nhiên, cơ chế của hiện tượng này vẫn chưa được biết đến.
Ngoài các chất bám dính như trên thì suilysin rất độc hại cho tế bào [21].
Suilysin là một hemolysin 54kDa, là một chất độc có hoạt tính thiol tác dụng vào
cholesterol trong màng của các tế bào có nhân điển hình [20]. Tuy nhiên, các
chủng không sản xuất suilysin cũng có thể để đi đên các mạch máu và khuếch
tán trong cơ thể vật chủ.
IgA đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại các tác nhân
gây bệnh ở niêm mạc. Vi khuẩn có khả năng sản xuất IgA protease để hạn chế
số lượng của IgA chức năng. Chúng cũng có thể tận dụng lợi thế của các mảnh
Đặng Thị Kiều Oanh 9
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Fab sinh ra để tăng cường sự kị nước bề mặt (và do đó bám dính vào tế bào vật
chủ) và ngăn sự xâm nhập của các kháng thể còn nguyên vẹn (hình 1) [42]. Gần
đây, một báo cáo đã cho thấy S. suis sản xuất IgA1protease có khả năng hiệu quả
trong việc phá hủy IgA1 của người [59].
Sự tồn tại của vi khuẩn trong máu và sự lây nhiễm
Như đã đề cập ở trên, sự xâm nhập của vi khuẩn hoặc làm tổn thương tế
bào có thể được coi là bước đầu tiên của sự phát triển bệnh. Giả thuyết cho rằng
S. suis có thể xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn chủ yếu qua các amiđan vòm
miệng, sau khi bám dính và xâm nhập vào các tế bào biểu mô và tương tác với
các tế bào tủy [42]. Khi S. suis xâm nhập vào các mô bên trong và máu, đó là
nguyên nhân chính để kích hoạt sự hoạt động của các tế bào thực bào của hệ
thống miễn dịch bẩm sinh. Tuy nhiên, khi kháng thể đặc hiệu không có mặt, S.
suis có thể chống lại thực bào và tồn tại trong máu ở nồng độ cao và gây viêm.
Vi khuẩn tồn tại chủ yếu phụ thuộc vào việc sản xuất các CPS. CPS bảo vệ S.
suis khỏi bạch cầu trung tính và thực bào đơn nhân/đại thực bào [19]. Nghiên cứu
về cấu trúc CPS của S. suis týp huyết thanh 2 gần đây cho thấy sự có mặt của
galactose (Gal), Gal liên kết 6, Gal liên kết 3, 4, Nacetylglucosamine (GlcNAc4)
liên kết 4, và rhamnose liên kết 3, 4. CPS của S. suis tương tự như liên cầu khuẩn
nhóm B (GBS), cũng có chứa Nacetylneuraminic acid (sialic acid) liên kết với
phía cuối của chuỗi CPS. Tuy nhiên, trong khi axit sialic của GBS là liên kết 23
Gal, S. suis là 26 Gal [42]. Acid sialic đã được chứng minh là quan trọng trong
việc ngăn ngừa sự bám dính của protein C3 trên bề mặt của GBS và cho phép cho
GBS kháng lại sự tiêu giệt trong tế bào phụ thuộc opsonin [42]. Một vai trò như
vậy vẫn chưa được chứng minh đối với axit sialic của S. suis. Một thí nghiệm
tạo ra chủng đột biến mất gen neuC đã được thực hiện (neuC mã hóa epimerase
UDP GlcNAc cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp acid sialic), kết quả là ngăn
cản toàn bộ quá trình lắp ráp, biểu hiện của CPS. Điều đó đã chứng minh rằng
Đặng Thị Kiều Oanh 10
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
axit sialic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của S.suis [42].Các
chủng type huyết thanh khác mà lớp vỏ capsit cũng chứa axít sialic như các type
huyết thanh 1 và 16, đôi khi cũng gây bệnh ở người [42]. Axít sialic cũng đã được
chứng minh liên quan đến việc bám dính của S. suis với bạch cầu đơn nhân, vì
thế giả thuyết được đặt ra là các tác nhân gây bệnh sẽ di chuyển trong máu mà
không liên kết với các tế bào thực bào này [ 21] . Cuối cùng, một giả thuyết về sự
bắt chước cấu trúc phân tử đã được đề xuất [ 19], dựa trên thực tế là axit sialic
liên kết 26 được tìm thấy trong vỏ capsit của type huyết thanh 2 và 14 [ 42]
tương tự như đường epitope trên bề mặt của tất cả các tế bào động vật có vú
[22]. Điều này có thể dẫn đến việc nhận biết kháng nguyên của vật chủ bị ảnh
hưởng. Trong thực tế, S. suis kiểu huyết thanh 2 đã được báo cáo là khi nhiễm
vào vật chủ gây đáp ứng miễn dịch kém ở cả lợn và ngựa. [42].
Mặc dù vai trò của CPS rất quan trọng góp phần vào sự hình thành nên tính
độc của S.suis. Nhưng thực tế là một chủng có vỏ capsit không có nghĩa là chủng
có độc tính. Điều này đã chỉ ra rằng sự tồn tại trong máu của S.suis không chỉ dựa
vào lớp vỏ capsit mà còn dựa vào nhiều yếu tố khác. Thực tế, những chủng có
vỏ nhưng không có độc lực có thể chỉ tồn tại trong máu trong vòng 48h, các
chủng có độc lực có thể tồn tại trong vài ngày. Khả năng chống lại sự thực bà
của vi khuẩn còn liên quan đến quá trình biến đổi thành tế bào peptidoglycan
bằng Ndeacetylation. Một chủng đột biến có vỏ capsit nhưng không có PgdA
deacetylase, chịu trách nhiệm làm biến đổi peptidoglycan bị giảm khả năng kháng
lại bạch cầu trung tính khi thí nghiệm trên các mô hình lây nhiễm ở chuột và lợn.
Tương tự như vậy, Dalanylation của axít lipoteichoic (LTA) đóng một vai trò
quan trọng trong sự tồn tại của tác nhân gây bệnh này (hình 2) [42]. Một chủng
đột biến không có Dalanine của LTA nhạy cảm hơn với peptide kháng khuẩn và
bị giết chết bởi bạch cầu trung tính của lợn, chuột. Ngoài ra các cấu trúc thành tế
bào lớn, nhiều protein bề mặt làm tăng khả năng tạo các kháng thể và tăng khả
năng bị thực bào [42, 58]. Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động của các protein này,
Đặng Thị Kiều Oanh 11
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
vai trò của chúng vẫn còn chưa biết. Mặc dù chủng không có suilysin có thể là
chủng độc lực và tồn tại trong máu, nhưng các chủng có suilysin có tính độc cao
hơn với bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính [42]. Hơn nữa, sự tồn tại của
suilysin làm giảm thực bào và giết chết S. suis [42].
S. suis yêu cầu các chất dinh dưỡng bao gồm cả các nguyên tố kim loại, có
hàm lượng tương đối thấp trong vật chủ. AdcR, một yếu tố phiên mã liên cầu
khuẩn tương đồng với Zur điều hòa sự hấp thu kẽm và Fur điều hòa sự hấp thu
sắt điều. Cả hai yếu tố này quan trọng cho sự sống còn S. suis trong cơ thể [42].
Ngoài ra, một dòng đột biến không có yếu tố vận chuyển sắt (FeoB) đã bị suy
giảm khả năng sống sót trong một mô hình thí nghiệm trên chuột lây nhiễm.
[42]. Sử dụng trong công nghệ biểu hiện trong cơ thể sống đã khám phá các gen
cpsA, mã hóa một yếu tố giả định điều hòa sinh tổng hợp của CPS và IRI7,
đồng đẳng với rpgG của liên cầu, một gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
vỏ capsit [ 52]. Giả thuyết được đề xuất là CPS của S. suis trở nên dày hơn sau
khi tăng trưởng trong cơ thể, sắt tự do khan hiếm, làm tăng cường sự điều hòa
biểu hiện của cps2A và rpgG có thể xảy ra [52]. Mặc dù đây là một giả thuyết
hấp dẫn, một sự liên quan rõ ràng giữa sự thiếu sắt và sản xuất CPS vẫn còn
phải được xác minh. Trong thực tế, có báo cáo cho rằng S. suis có thể thích nghi
với môi trường bị hạn chế sắt bằng cách thay đổi trong chuyển hóa của nó, thay
thế sắt bằng mangan, magiê [42]. Ngoài ra, lipoprotein TroA cần thiết cho sự tăng
trưởng S. suis trong các môi trường có mangan thấp, lipoprotein này rất quan
trọng cho sự sống còn của vi khuẩn trong cơ thể. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã
tiến hành thí nghiệm làm bất hoạt làm mất lipoprotein tham gia trong sự hấp thu
kẽm, kết quả độc tính bị giảm 50 lần so với chủng ban đầu.
Superoxide dismutase (Sod) là một yếu tố độc lực của vi khuẩn gây bệnh
bằng cách làm giảm quá trình oxy hóa của tế bào thực bào. Khung đọc mở
SSU1356 của một chủng SS2 lâm sàng ZJ081101 mã hóa một loại protein trên
Đặng Thị Kiều Oanh 12
Cao học K18
