Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.16 MB, 27 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------------
NGUYỄN THỊ THANH
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY
HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM
NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ
(Epinephelus spp)
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Hà Nội, năm 2018
Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Công Hoạt
2. PGS.TS. Lê Văn Năm
Phản biện 1: ..........................................................................
Phản biện 2: ...........................................................................
Phản biện 3: ............................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện
Họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi........ giờ .........ngày ..... tháng.... năm 2018.
Có thể tìm hiểu luận án tại:
1. Thư Viện Quốc gia
2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. Thư Viện Viện Di truyền Nông nghiệp
MỞ ĐẦU
Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanh chóng và
trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam. Nghề nuôi cá biển
được đánh giá là một nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một
trong số những đối tượng chủ lực. Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế rất cao do
giàu hàm lượng dinh dưỡng, thịt cá thơm ngon cho nên cá mú được thị trường trong và
ngoài nước ưa chuộng. Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá mú phát triển thì người nuôi cũng
gặp không ít khó khăn bởi dịch bệnh gây ra trên cá. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những
tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá mú thường là vi rút, nấm và vi khuẩn trong đó nguy
hiểm nhất là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrocis - VNN) hay bệnh não và
võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy - VER) do Betanodavirus gây ra. Vi
rút có thể tấn công và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ ấu
trùng, cá giống đến cá thương phẩm. Khi bị bệnh cá có biểu hiện rối loạn thần kinh như
bơi mất thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới hoặc treo trên mặt nước hay
nằm dưới đáy bể, đáy lồng. Cá bệnh có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80100% (Đỗ Thị Hoà và cs, 2004) [2].
Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi
cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch
khá tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó việc nghiên cứu tạo nguyên liệu để sản xuất
vắc-xin phòng bệnh cho cá đang ngày càng trở nên cấp thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực
tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi
rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất
vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)”.
Mục tiêu của đề tài luận án:
- Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc
tính sinh học của vi rút gây bệnh.
- Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng sinh kích thích miễn
dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử
thần kinh cho cá mú.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
- Tính khoa học: Luận án đã xác định được vi rút gây bệnh và một số đặc tính
sinh học của chúng. Đồng thời luận án đã sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp protein T4
của vi rút gây bệnh, đánh giá tính sinh đáp ứng miễn dịch để làm cơ sở cho việc sản xuất
vắc-xin phòng bệnh cho cá mú. Dữ liệu khoa học của luận án sẽ cung cấp thêm tư liệu
giảng dạy và nghiên cứu về bệnh và định hướng sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú
nuôi hiện nay.
- Tính thực tiễn: Đề tài đã tạo được kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 và đánh
giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp làm
nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh,
tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá mú.
Đóng góp mới của đề tài luận án:
- Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh
hoại tử thần kinh trên cá mú, đã xác định được 26 chủng vi rút và một số đặc tính sinh
học của vi rút gây bệnh.
- Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã tạo được kháng nguyên protein
T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá mú kéo
1
dài cho đến ngày thứ 90 sau khi tiêm. Đây là cơ sở khoa học để sử dụng kháng nguyên
protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho
cá mú..
Cấu trúc của luận án:
Luận án chính gồm 105 trang với 16 bảng số liệu và 32 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở
đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (34 trang); phương pháp nghiên cứu (19 trang); kết quả
và thảo luận (47 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang). Luận án tham khảo 71 tài liệu
trong đó 15 tài liệu tiếng Việt, 56 tài liệu tiếng Anh.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú
Cá mú thuộc họ Serranidae, giống
Epinephelus. Theo Viện Hải dương học Nha
Trang, vùng biển nước ta có khoảng 30 loài cá
mú (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]. Cá mú sống tại
những vùng nước ấm, nhiệt độ thích hợp cho
cá mú phát triển là từ 22-32ºC, thích hợp nhất
là 25-30ºC. Cá chịu được độ mặn từ 11- 41‰.
Hình 1.1 Hình thái ngoài cá mú
chấm nâu (Epinephelus coioides)
Ở cá mú có hàng rào cơ học như dịch nhờn, da và mang bảo vệ giúp cơ thể cá
chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009)
[12]. Cá mú có hệ thống miễn dịch đặc hiệu vì vậy khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ
thể, chúng có khả năng sản sinh ra kháng thể đặc hiệu để chống lại các kháng nguyên,
bảo vệ cá tránh tác hại của tác nhân gây bệnh.
1.2. Ý nghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú
Cá mú có giá trị kinh tế cao, cá mú đen và cá mú chấm nâu có khối lượng từ 800
đến 1000g là 200.000 - 300.000 đồng/kg. Cá mú chấm đỏ giá dao động 400.000-500.000
đồng/kg [73][74]. Nghề nuôi cá mú ở nước ta tập trung phát triển ở vùng biển Quảng
Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Nha Trang, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu và Kiên
Giang (Lê Anh Tuấn, 2004 [11], Võ Văn Quang và cs, 2013 [5]). Trong những năm qua
cả nước có 500 ha vùng biển ven bờ được xây dựng thành các ao đìa nuôi cá mú. Sản
lượng cá mú hàng năm cung cấp trên 3000 tấn sản phẩm. Tuy nhiên cá mú thường hay bị
một số bệnh như đốm đỏ, bệnh hoại cơ, bệnh đường ruột... do vi khuẩn gây nên, đặc biệt
là bệnh hoại tử thần kinh do vi rút gây ra. Hiện nay, chưa có vắc-xin phòng ngừa loại vi
rút này và biện pháp phòng ngừa chủ yếu vẫn là đảm bảo vệ sinh và cách ly các nguồn
lây nhiễm vi rút.
1.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam
1.3.1. Đặc điểm về bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển
1.3.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới
1.3.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá
Hiện nay để chẩn đoán bệnh VNN thường sử dụng các phương pháp: mô bệnh
học, phân lập vi rút trên tế bào, sinh học phân tử, sử dụng kính hiển vi điện tử và chẩn
đoán miễn dịch học (OIE, 2005) [15].
1.4. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá là Betanodavirus, nhân RNA, hình
cầu, đường kính 25-30 nm. Hệ gen có cấu trúc phân đoạn, RNA mạch đơn, tuyến tính
hai phía có hai tiểu phần. Tiểu phần lớn chứa RNA1 (3.1 kb) mã hóa cho một protein có
2
kích thước 100 kDa với chức năng như là RNA polymerase. Tiểu phần nhỏ chứa RNA2
trên đó chứa hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp) (Nishizawa và cs, 1997)
1.5. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú
Hiện nay chưa có loại vắc-xin nào đạt được hiệu quả phòng bệnh hoại tử thần
kinh. Vì vậy những biện pháp đảm bảo vệ sinh, tránh các nguồn lây nhiễm vẫn được coi
như là biện pháp chủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá mú.
1.6. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá
1.6.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh
Kháng nguyên tái tổ hợp là kháng nguyên (protein miễn dịch) được sản xuất bằng
kỹ thuật di truyền. Trên thế giới, việc sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắcxin kiểm soát một số bệnh nguy hiểm cho cá nuôi đã được nghiên cứu từ những năm
1980. Việc ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất ra số lượng lớn kháng nguyên bằng
con đường tái tổ hợp đã giúp tiết kiệm chi phí sản xuất, an toàn với cá nuôi. Công nghệ
DNA tái tổ hợp được sử dụng để sản xuất kháng nguyên phòng bệnh do vi rút cho cá đã
và đang phát triển rất mạnh mẽ
1.6.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới
Hiện trên thế giới có một số loại vắc-xin vô hoạt sử dụng để phòng bệnh do vi rút
gây ra như hoại tử tuyến tụy (IPNV), hoại tử cơ quan tạo máu (IHNV), nhiễm trùng xuất
huyết (VHSV), vi rút đường máu cá chép vào mùa xuân (SVCV). Tuy nhiên, khi nuôi
cấy vi rút trên tế bào thường chi phí cao, khả năng tinh khiết khó. Gần đây, sử dụng công
nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất vắc-xin protein từ vi rút phòng bệnh cho cá rất khả thi
và đưa lại hiệu quả kinh tế cao (Christie và cs, 1997; Lorenzen và cs, 2005) [26][43].
1.6.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam
Năm 1996 - 1998, Bùi Quang Tề và cs đã chế tạo vắc-xin từ vi khuẩn Aeromonas
hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ từ 90 đến 100% (Bùi
Quang Tề và cs, 2006) [7]. Năm 2003, Vũ Dũng Tiến đã chế tạo vắc-xin từ sự kết hợp
giữa kháng nguyên ngoại bào và nội bào của vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng
bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có hiệu quả tốt với tỷ lệ bảo hộ đạt 100% (Vũ Dũng Tiến
và cs, 2003) [9]. Năm 2003 - 2005 đề tài KC-06-20NN đã chế tạo được vắc-xin phòng
bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng cho cá tra và cá basa. Vắc-xin đảm bảo được chỉ tiêu
an toàn trên cá thí nghiệm, tỷ lệ bảo hộ đạt từ 90 - 100% (Bùi Quang Tề và cs, 2006) [7].
Năm 2006 - 2007, Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II đã triển khai đề tài
nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên
cá tra (Pangasianodon hypothalmus) nuôi công nghiệp ở đồng bằng Sông Cửu Long. Kết
quả bước đầu cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch ở cá tra đối với vi khuẩn E. ictaluri
qua hàm lượng kháng thể có trong máu cá đạt cao.
Từ năm 2011, Phạm Thị Tâm và cs đã tiến hành nghiên cứu sản xuất vắc-xin
phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nuôi công nghiệp. Sản phẩm từ đề tài là vắc-xin
vô hoạt bằng formalin nồng độ 0,03% ở 4oC trong thời gian 5 ngày; lựa chọn được chất
bổ trợ là dầu Montanique ISA70 có khả năng tăng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch
phù hợp với cá mú trong điều kiện thí nghiệm. Vắc-xin đã có tác dụng phòng bệnh cho
cá mú, hiệu lực bảo vệ trên 83% cá giống, an toàn 100%, có độ vô trùng tuyệt đối (Phạm
Thị Tâm và cs, 2015) [6].
3
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV)
- Kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Tế bào GS1 (lách cá mú) của hãng Sigma (Đức)
- Vector pGEM-T và vector pET32a+ của hãng Novagen (Mỹ).
- Chủng E. coliJM109 và E. coliBL21(DE3) của hãng HV Biotek.
- Enzyme EcoRI (Invitrogen)
- Kít RT-PCR one step (Quiagen của Mỹ), kít tinh sạch DNA Qick Gel Extraction
(Invitrogen), thang DNA và protein (Invitrogen).
- Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen)
- Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus)
và mú chuột (Cromileptes altivelis) ở các kích cỡ khác nhau;
- Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) giai đoạn cá bột, cá con (chiều dài từ
1,5 – 2 cm)
- Các loại môi trường, dụng cụ nuôi cấy tế bào: Leibovit, MEM, HANK's, FCS,
kháng sinh, kháng nấm,…
- Các loại hóa chất tinh khiết cho xét nghiệm mô bệnh học; các hóa chất sử dụng
trong kỹ thuật sinh học phân tử của các hãng: Sigma, Bio-Basic, Invitrogen, Biological
bao gồm: IPTG, ampicilin, X-gal, agarose, EDTA, SDS, cao nấm men, peptone, NaCl,
Ethidium Bromide, Ethanol, Isopropanol, Sodium acetate, acid acetic, glycine, methanol,
TBST, BSA, TBS, Tris HCl, EDTA, TAE, NaOH, T4 ligase…
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
- Xác định một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
- Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh
hoại tử thần kinh cho cá mú
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nhóm các phương pháp xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên
cá mú
- Phương pháp thu và xử lý mẫu
51 mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh ở vùng biển Quảng Ninh (QN1QN8), Hải Phòng (HP1- HP11), Nam Định (NĐ1-NĐ11), Khánh Hòa (KH1-KH9), Bình
Thuận (BT1-BT12) được thu và bảo quản lạnh. Mẫu bệnh phẩm được thu não và mắt.
- Phương pháp mô bệnh học: theo OIE, FAO (2005).
4
- Xác định vi rút bằng nuôi cấy trên tế bào theo phương pháp Q.W.Qin và cs.
(2006)
- Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu tế bào gây nhiễm VNN bằng Kit
RNeasy Qiagen của hãng Qiagen.
- Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR).
- Điện di trên gel agarose: theo phương pháp của Sambrook và cs, 2001.
- Phương pháp tách dòng gen: theo Sambrook và cs, 2001.
- Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4.
+ Phân cắt plasmid pGEM-T bằng enzyme giới hạn EcoRI, ủ ở 37oC trong vòng
2,5- 3h. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả.
+ Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: .
- Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến: với tế bào chủ là
E.coli JM109, biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.
- Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli:
- Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp:
- Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose: theo PureLink® Quick Gel
Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA Cloning Kit của hãng Invitrogen.
- Giải trình tự gen T4 bằng máy tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Dùng
phần mềm Blast xác định mức tương đồng của trình tự gen T4 với GenBank.
2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử
thần kinh
- Xác định độc lực của vi rút trên tế bào: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9 với
môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). Giữ khay đã cấy ở 28oC để vi rút hấp phụ lên tế
bào. Độc lực của vi rút đánh giá qua chỉ số TCID50.
- Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú: dịch vi rút pha loãng từ 10-1
đến 10-9, mỗi độ pha loãng tiêm 30 cá mú con (1,5-2 cm), liều 0,1 ml/con. Quan sát biểu
hiện lâm sàng, tỷ lệ chết và gen mã hóa kháng nguyên T4 sau 5 ngày. Khả năng gây
bệnh của vi rút đánh giá bằng chỉ số LD50.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào
GS1: chọn chủng QN4 có TCID50 cao (10-6,8) để gây nhiễm trên tế bào. Mỗi chủng NNV
được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt độ: 17, 22, 27 và 32oC, liều gây nhiễm là liều TCID50 =
10-6,8. Theo dõi và đánh giá CPE sau 5 ngày thí nghiệm.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá
mú: Chủng QN4 có liều LD50 cao (10-7,5) được gây nhiễm vào cá mú. Lô đối chứng cá
được tiêm môi trường Leibovit”z 15. Cá nuôi ở 280C (cả ngày) và 280 (ban ngày)/240C
(ban đêm). Sau 15 ngày đánh giá tỷ lệ chết và xác định gen T4.
5
2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và
đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
- Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen T4 (pET32a+-T4). Dùng
phương pháp sốc nhiệt để đưa vector pET32a+-T4 vào tế bào E. coliBL21.
- Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp
- Kiểm tra PCR và enzyme giới hạn để xác định sự có mặt của gen T4 trong plasmid.
- Nuôi cấy E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4
- Phương pháp điện di SDS-PAGE.
- Phương pháp Western blot: nhằm nhận biết protein tái tổ hợp T4 thể hiện được tính
đặc hiệu với vi rút gây hoại tử thần kinh.
- Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
+ Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ:
Đối chứng dương: huyết thanh thỏ khỏe, không có kháng thể đặc hiệu được ủ với
chủng QN2 (liều 104 TCID50) rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú nhỏ
(≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 hiệu giá 103
LD50)
Đối chứng âm: huyết thanh thỏ khỏe, được gây miễn dịch với E.coliBL21pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp được pha loãng theo hệ số 10 rồi hấp phụ vào tế
bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm.
Lô thí nghiệm: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và
protein T4 tái tổ hợp, pha loãng theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 liều 104 TCID50 rồi hấp
phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều
0,05 ml dịch vi rút QN2 hiệu giá 103 LD50).
+ Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú.
Đối chứng dương: cá mú bột sạch bệnh được nghiền, xử lý kháng sinh, lọc và pha loãng
theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 với liều 104 TCID50 và gây nhiễm vào tế bào GS1.
Đối chứng âm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với kháng nguyên E.coli
BL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15
ngày. Theo dõi cá trong 90 ngày, định kỳ 15 ngày thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh,
lọc, pha loãng theo hệ số 10 rồi gây nhiễm vào tế bào GS1
Lô thí nghiệm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với E. coliBL21-pET32a+-T4 và
protein T4 tái tổ hợp với 2 liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày. Theo dõi cá
trong 90 ngày, định kỳ thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng rồi ủ với chủng
QN2 (104 TCID50) và gây nhiễm vào tế bào GS1, đánh giá CPE trong 7 ngày
6
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô
bệnh học
Kết quả sàng lọc
mẫu nhiễm vi-rút gây
hoại tử thần kinh trên
51 mẫu cá mú được
trình bày ở hình 3.1 và
bảng 3.1 cho thấy có 26
mẫu xuất hiện không
bào trong các mô mắt
và mô não. Các không
bào trong mẫu kiểm tra
có dạng hình tròn hoặc
hình elip, kích thước
không bào từ 5-10µm.
Hình 3.1. Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá (a. Cá
mú bệnh, b. Không bào trong não, c. Không bào trong mắt)
Bảng 3.1. Kiểm tra vi-rút bằng phương pháp mô bệnh học
Bệnh tích tế bào trong mô não cá
(26 mẫu)
Ký hiệu mẫu
Bệnh tích tế bào trong mô mắt cá
(17 mẫu)
Tỷ lệ (%)
Ký hiệu mẫu
Tỷ lệ (%)
QN2, QN4, QN7
37,50
QN2, QN4, QN7
37,50
HP2, HP4, HP5, HP8, HP10
45,45
27,27
NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5,
NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11
KH4, KH5, KH6, KH9
72,72
HP4, HP5, HP8
NĐ1, NĐ4, NĐ5,
NĐ10, NĐ11
KH4, KH5
BT2, BT4, BT9,
BT12
Trung bình
BT1, BT2, BT4, BT7, BT9,
BT12
Trung bình
44,44
50,00
50,98
45,45
22,22
33,33
33,33
Vi rút gây bệnh có ở tổ chức thần kinh của 26 mẫu thu thập được. Các mẫu còn lại tuy
không thấy không bào xuất hiện nhưng không nằm ngoài khả năng đang ở thời kỳ tiền
nhiễm. Do đó chúng tôi tiếp tục việc xác định vi rút bằng phương pháp sinh học phân tử
để xác định gen mã hóa kháng nguyên của NNV.
3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp
RT-PCR
7
Bảng 3.2. Xác định vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR
Số mẫu dương tính với gen T4 của NNV
(27 mẫu)
QN2, QN4
Tỷ lệ (%)
25,00
HP2, HP4, HP6, HP7, HP8, HP10, HP11
63,63
NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11
72,72
KH4, KH5, KH9
33,33
BT2, BT3, BT4, BT7, BT9, BT10, BT12
58,33
Trung bình
52,94
Kết quả cho thấy có 27/51 mẫu dương tính với gen T4 chiếm tỷ lệ 52,94%. Sản phẩm
PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV cụ thể là HP1, HP2, NĐ3, NĐ2,
QN2, QN4, KH4, KH 5, BT2 và BT3 được thể hiện ở hình 3.2.
Mẫu HP2, NĐ3, QN2,
QN4, KH4, KH5, BT2,
BT3 xuất hiện băng có
kích thước khoảng 420 bp
tương ứng với kích thước
đoạn gen T4. Mẫu HP1,
NĐ2 không xuất hiện
băng vạch.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV
(Giếng 1-10: các mẫu lần lượt HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2,
BT3, Giếng 11: marker)
3.1.3. Xác định vi rút trên tế bào
Đề tài đã sử dụng dòng tế bào GS1 để đánh giá khả năng gây nhiễm của NNV,
với 27 mẫu dương tính với gen T4, chúng tôi đã xác định được 26 chủng vi rút (hình 3.3,
bảng 3.3). Mẫu HP11 không có biểu hiện bệnh tích ở mô não và mô mắt.
Hình 3.3. Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV
A: Tế bào sau gây nhiễm NNV 2 ngày, tế bào kết hạt và co tròn,
B: Tế bào sau gây nhiễm NNV 7 ngày,
C: Không bào trong tế bào GS1 gây nhiễm NNV sau 2 ngày.
8
Từ ngày thứ 2 tế bào có hiện tượng kết hạt, co tròn, hình thành nhiều hạt không bào kích
thước đa dạng; sau 5 ngày tế bào chết cục bộ ở khắp bề mặt đĩa nuôi cấy và tới ngày thứ
7, toàn bộ tế bào bị phá hủy hoàn toàn bởi hiện tượng tan bào (hình 3.3).
Bảng 3.3. Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh gây nhiễm trên tế bào GS1
STT
Ký
hiệu
mẫu
Thời gian xảy ra hiệu ứng CPE (giờ)
24
48
72
96
120
144
168
1
QN2
_
_
+
+
+
++
+++
2
QN4
_
+
+
+
++
+++
++++
3
HP2
_
_
+
+
+
++
+++
4
HP4
_
+
+
+
++
+++
++++
5
HP6
_
_
+
+
+
++
+++
6
HP7
_
+
+
+
++
+++
++++
7
HP8
_
+
+
+
++
+++
++++
8
HP10
_
_
+
+
+
++
+++
9
HP11
_
_
_
_
_
_
_
10
NĐ1
_
+
+
+
++
+++
++++
11
NĐ3
_
_
+
+
+
++
+++
12
NĐ4
_
+
+
+
++
+++
++++
13
NĐ5
_
+
+
+
++
+++
++++
14
NĐ7
_
_
+
+
+
++
+++
15
NĐ8
_
+
+
+
++
+++
++++
16
NĐ10
_
_
+
+
+
++
+++
17
NĐ11
_
_
+
+
+
++
+++
18
KH4
_
_
+
+
+
++
+++
19
KH 5
_
+
+
+
++
+++
++++
20
KH9
_
_
+
+
+
++
++
21
BT2
_
_
+
+
+
++
++++
22
BT3
_
+
+
+
++
+++
++++
23
BT4
+
+
+
++
+++
++++
24
BT7
_
+
+
+
++
+++
++++
25
BT9
+
+
+
++
++
+++
26
BT10
+
+
+
++
++
++
27
BT12
+
+
+
++
++++
Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++ : CPE > 50%; +: CPE >
20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE
Các chủng vi rút xác định được có gen T4 và gây bệnh tích trên tế bào. Vì vậy đây là vi
rút gây hoại tử thần kinh, để chứng minh cho nhận định trên chúng tôi giải trình tự gen
T4 nhằm xác định đến loài.
3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV đã xác định
Gen T4 của các chủng NNV đại diện: QN2, HP7, NĐ1, KH5, BT12 được tinh
sạch để tách dòng và xác định trình tự. Các kết quả dưới đây thể hiện bước xác định trình
tự gen T4 của chủng KH5.
9
Hình 3.5. Thiết kế vector
tái tổ hợp pGEMT- T4
A: Điện di sản phẩm tinh
sạch gen T4 (giếng1: sản
phẩm T4 tinh sạch; giếng
M: 1kb Plus Ladder); B:
sơ đồ thiết kế vector tách
dòng gen T4
Sản phẩm sau tinh sạch có kích thước khoảng 420bp tương đương kích thước gen T4
(Hình 3.5A). Tách dòng bằng vector pGEM-T Easy, vector tái tổ hợp được thiết kế theo
Hình 3.5B. Vector tái tổ hợp pGEM-T-T4 được biến nạp vào E. coli JM109. Lựa chọn
các khuẩn lạc trắng và nuôi trong môi trường LB lỏng (bổ sung ampicilin 100µg/ml) để
tách plasmid tái tổ hợp và cắt, tinh sạch gen T4. Sản phẩm DNA plasmid tách từ các
khuẩn lạc trắng được kiểm tra trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.6 (A), kiểm tra sản
phẩm PCR khuếch đại gen T4 thể hiện trong Hình 3.6 (B), kiểm tra sản phẩm cắt bằng
enzyme giới hạn thể hiện trong Hình 3.6 (C).
Hình 3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp
(A): DNA plasmid tách từ 3 khuẩn lạc trắng (giếng 1,2,3);
(B): Kiểm tra sản phẩm PCR của gen T4 từ 3 plasmid tái tổ hợp (giếng 1,2,3)
(C): Kiểm tra đoạn DNA gen T4 chèn vào DNA của 3 plasmid tái tổ hợp cắt bằng
emzyme EcoRI (giếng 1,2,3)
Giếng M: Thang chuẩn1kb Plus Ladder;
Kết quả hình 3.6 (C): các giếng 1-3 xuất hiện vạch có kích thước khoảng 420bp tương
đương với kích thước gen T4, có khả năng chúng tôi tách dòng thành công gen T4.
Sau khi xác định trình tự gen T4, chúng tôi sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ
tương đồng của trình tự gen T4. Kết quả cho thấy đoạn gen T4 mã số HM017077.1 có độ
tương đồng là 100% so với trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ của NNV.
10
Hình 3.7. So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4
của Betanodavirus mã số HM017077.1
Từ kết quả giải trình tự gen như trên cho phép chúng tôi kết luận rằng chủng vi rút xác
định được là Nervous Necrosis Virus thuộc họ Betanodavirus.
3.2. Xác định một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
3.2.1. Xác định đặc tính gây bệnh của vi rút trên tế bào
Bảng 3.5. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1
Liều gây chết 50% tế bào (TCID50)
STT
Ký hiệu mẫu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình
10-6,9
10-6,9
10-7
10-7
10-6,9
10-6,8
10-6,8
10-6,8
10-6,9
10-6,8
HP6
10-4,3
10-5
10-4,8
10-4,4
10-4,9
10-4,8
10-4,3
10-4,8
10-4,7
10-4,5
10-4,9
10-4,9
10-4,3
10-4,9
10-4,8
6
7
HP7
HP8
10-6,8
10-6
10-6,9
10-5,8
10-6,8
10-5,7
10-7
10-6,1
10-6,8
10-5,9
8
HP10
10-3,9
10-4
10-3,9
10-3,8
10-3,9
9
10
NĐ1
NĐ3
10-6,8
10-3
10-6,8
10-3,1
10-7
10-3
10-6,9
10-3
10-6,8
10-3
1
2
QN2
3
4
5
HP2
HP4
QN4
11
Liều gây chết 50% tế bào (TCID50)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4
10-4,9
10-4,9
10-4,8
10-4,9
10-5,9
10-5,8
10-6
10-5,9
STT
Ký hiệu mẫu
11
12
NĐ4
13
10-4,3
10-4,3
10-4,2
10-4,3
10-4,3
14
NĐ7
NĐ8
10-4,8
10-4,9
10-4,9
10-4,9
10-4,9
15
NĐ10
10-3
10-3
10-3
10-2,9
10-3
16
17
NĐ11
10-3
10-2,7
10-3,1
10-2,8
10-3
10-2,7
10-3
10-2,6
10-3
10-2,7
10-6,8
10-3
10-6,8
10-3
10-6,8
10-3,1
10-6,9
10-3
10-6,8
10-3
10-4,8
10-4,9
10-4,9
10-5
10-4,9
10-4,8
10-5,9
10-4,8
10-5,9
10-4,7
10-5,9
10-4,8
10-5,8
10-4,8
10-5,9
10-6,8
10-3,9
10-6,9
10-4
10-6,8
10-3,9
10-6,7
10-3,9
10-6,8
10-3,9
10-2,5
10-2,7
10-2,9
10-2,8
10-2,7
NĐ5
KH4
KH5
18
19
KH9
20
BT2
BT3
21
22
BT4
23
24
BT7
BT9
BT10
25
Trung bình
10-4,9
10-5,9
10-4,8
10-4,9
10-4,9
10-4,9
10-4,9
BT12
Qua thí nghiệm cho thấy có 6/26 chủng vi rút có độc lực cao với TCID50 từ
-6,8
10 đến 10-6,9; 10/26 chủng có liều TCID50 đạt 10-4,8- 10-5,9, ở độ pha loãng vi rút là
10-8; 10 chủng còn lại độc lực yếu có liều TCID 50 đạt 10-2,7- 10-4,3.
3.2.2. Xác định đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
Đề tài đã chọn 6 chủng độc lực cao (QN2, QN4, HP7, NĐ1, KH5 và BT7) và 2 chủng
độc lực thấp (KH4, BT10) để gây nhiễm trên cá mú. Theo dõi cá trong 5 ngày để xác
định tỷ lệ chết và gen T4, kết quả trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50)
STT
Ký hiệu mẫu
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Trung bình
26
1
QN2
10-6,2
10-6,2
10-6,1
10-6,2
2
QN4
10-7,5
10-7,6
10-7,5
10-7,5
3
HP7
10-7,5
10-7,5
10-7,4
10-7,5
4
NĐ1
10-5,4
10-5,6
10-5,5
10-5,5
5
KH5
10-6,3
10-6,2
10-6,4
10-6,2
6
BT7
10-6,5
10-6,5
10-6,4
10-6,5
7
KH4
10-3,7
10-3,6
10-3,6
10-3,6
8
BT10
10-2,5
10-2,7
10-2,5
10-2,6
9
Đối chứng
ND
ND
ND
ND
(Ghi chú: ND không đánh giá)
12
Kết quả cho thấy: 2 chủng QN4 và HP7 có độc lực cao trên cá với LD50 đạt 10-7,5, 2
chủng có LD50 trên cá thấp từ 10-2,6-10-3,6 là KH4, BT10.
3.2.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút
trên tế bào
Tế bào GS1 được gây nhiễm NNV chủng QN4 với hiệu giá là 10-6,8 TCID50/ml
rồi nuôi trong 5 ngày, theo dõi mật độ tế bào sống.
Hình 3.8. Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV
Kết quả trình bày ở hình 3.8 cho thấy, 220C là ngưỡng nhiệt độ phù hợp nhất cho
sự nhân lên của vi rút và quá trình gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1.
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút trên cá
mú
Khả năng gây bệnh của NNV ở nhiệt độ 28oC (cả ngày và đêm) được thể hiện ở bảng 3.8
cho thấy: lô cá mú được gây nhiễm chủng QN4 có tỷ lệ chết tích lũy là 82,1% sau 3
ngày, 100% sau 6 ngày theo dõi. Đối chứng tỷ lệ chết là 10% sau 15 ngày theo dõi. Qua
bảng cho thấy tác nhân gây chết cá là NNV chủng QN4 với sự xuất hiện của gen T4.
Bảng 3.8. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC cả ngày và đêm
Tỷ lệ chết của cá mú (%)
Xác định gen T4
Thời
gian
(ngày)
Lần
1
Lần 2
Lần 3
TB
Đối chứng
0
0
0
0
0
0
-
-
3
86,6
83,3
76,6
82,1
3,3
+
-
6
100
100
100
100
6,6
+
-
Lô thí
Đối chứng
nghiệm
9
6,6
-
12
10,0
-
15
10,0
-
Ghi chú: +: có gen T4
-: không có gen T4
13
Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở điều kiện nhiệt độ nước nuôi cá là
28 C vào ban ngày và 24oC vào ban đêm được thể hiện ở Bảng 3.9.
o
Bảng 3.9. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và 24oC
ban đêm
Thời
gian
(ngày)
Tỷ lệ chết của cá mú (%)
Xác định gen T4
Lần 1
Lần 2
Lần 3
TB
Đối chứng
Lô đối
chứng
Đối chứng
0
0
0
0
0
0
-
-
3
80,0
86,6
90,0
85,5
0
+
-
6
100
100
100
100
3,3
+
-
9
6,6
-
12
10,0
-
15
10,0
-
Ghi chú: +: có gen T4
-: không có gen T4
Ở nhiệt độ 28oC (ban ngày) và 24oC (ban đêm), tỷ lệ chết của cá sau 3 ngày là
85,5% và sau 6 ngày cá chết hoàn toàn. Lô đối chứng sau 15 ngày tỷ lệ chết là 10%. Tác
nhân gây bệnh có gen T4, chính là NNV chủng QN4 đã gây nhiễm.
3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin
phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4.
Đề tài sử dụng pET 32a+
làm vector biểu hiện gen T4,
chủng E. coli JM109 kiểm
tra vector tái tổ hợp, chủng
E. coli BL21(DE3) để biểu
hiện gen T4.
Quy trình tạo vector tái tổ
hợp mang gen T4 (pET32a+T4) được thể hiện ở hình
3.9. Phản ứng cắt plasmid
vector
pGEM-T-T4
và
+
plasmid pET32a được thực
hiện ở 370C trong 4 giờ, sản
phẩm cắt được điện di trên
gel agarose 1%.
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp
pET32a+- T4
Kết quả phản ứng cắt vector pGEMT-T4 và vector pET32a+ thể hiện ở Hình 3.10.
14
Hình 3.10. Cắt vector pGEM-T-T4 (A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI
Giếng 1,2,3,4 (A): sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4; Giếng 1,2,3 (B): sản phẩm cắt
plasmid pET32a+; Giếng M: Marker 1kb plus
Kết quả Hình 3.10 (A): các giếng số 1, 2, 3 và 4 đều xuất hiện hai băng, một băng
có kích thước khoảng 420bp (kích thước gen T4) và một băng có kích thước khoảng
3015bp (kích thước vector pGEM-T Easy). Hình 3.10 (B) cho thấy các giếng số 1, 2, 3
chỉ xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước tương đương vector pET 32a +
khoảng 5900bp. Như vậy chứng tỏ đã cắt thành công plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4 và
plasmid pET32a+ tạo ra các vị trí tương thích để gắn gen T4 vào vector pET32a+. Băng
vạch có vùng gen T4 kích thước 420bp và băng vạch có vector pET32a+ kích thước
5900bp được cắt để tinh sạch. Các sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a+
được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện ở Hình 3.11.
Hình 3.11. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector pET32a+
Giếng 1: gen T4 sau khi tinh sạch, Giếng 2: plasmid pET32a+ sau tinh sạch
M: 1kb Plus Ladder
15
Phản ứng nối gen được thực hiện ở 40C, ủ từ 14 đến 16h. Để kiểm tra sự tạo thành vector
tái tổ hợp pET32a+-T4, sản phẩm nối gen được biến nạp vào tế bào E. coli JM 109. Sàng
lọc chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh
Ampicillin (100µg/ml), nuôi ở 37oC trong 16h, kết quả được thể hiện ở hình 3.12. Sau
16 giờ tiến hành chọn sáu khuẩn lạc sang nuôi cấy trong 3ml môi trường LB lỏng có bổ
sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 370C trong
16h. Sau đó tách plasmid, điện di trên gel agarose 1%, kết quả ở hình 3.13.
Hình 3.12. Đĩa khuẩn lạc sau khi
chuyển gen pET32a+-T4 vào E.
coli JM109
Tiến hành PCR với cặp mồi
P1 và R3 để kiểm tra sáu
mẫu plasmid mang vector tái
tổ hợp pET32a+- T4 và mẫu
vector pET32a+ (đối chứng).
Kết quả thể hiện ở hình 3.14
cho thấy sáu dòng vi khuẩn
được lựa chọn đều có mang
gen T4, trong khi đó mẫu đối
chứng không mang gen này.
Như vậy có thể khẳng định
vector tái tổ hợp pET32a+T4 đã được thiết kế thành
công.
Hình 3.13. Kiểm tra sự tạo thành vector
pET32a+-T4 trong vi khuẩn E. coli JM109
(Giếng 1-6: Plasmid các dòng từ 1 đến 6;
Giếng M: 1kb plus ladder)
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có
mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp
Giếng 1-6: sản phẩm PCR plasmid pET32a+-T4 các
dòng đánh số từ 1 đến 6, Giếng M: 1kb Plus ladder;
Giếng ĐC: sản phẩm PCR plasmid pET32a+
16
3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh
3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng
nguyên của NNV.
Sau khi tạo được vector tái tổ
hợp pET32a+-T4 đề tài đã lựa
chọn bốn trong sáu dòng vi
khuẩn để biến nạp vào chủng vi
khuẩn biểu hiện E. coli BL21
(DE3). Vi khuẩn biến nạp được
nuôi cấy trên môi trường LB
thạch (bổ sung kháng sinh
Ampicillin 100µg/ml), nuôi ở
37oC từ 12 đến 16h, kết quả thể
hiện ở hình 3.15
Hình 3.15. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp
pET32a+-T4 vào E.coli BL21.
Để kiểm tra khả năng biến nạp của plasmid pET32a+-T4 vào tế bào E. coli
BL21(DE3), chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng cách tách plasmid và kiểm tra PCR. Sản
phẩm tách plasmid được điện di trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở hình 3.16
Hình 3.16. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp
tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang
vector pET32a+-T4
Hình 3.17. Kiểm tra khả năng biến nạp vector
tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng E. coli
BL21(DE3).
Giếng 1-4: Plasmid các dòng từ 1 đến 4; Giếng 1-4: Sản phẩm PCR plasmid các dòng từ 1
Giếng M:GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
đến 4, Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra các mẫu plasmid mang vector pET32a+-T4. Kết quả
điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.17 cho thấy các giếng từ 1 đến 4 đều xuất
hiện vạch có kích thước tương đương với kích thước gen T4 là 420 bp. Do đó có thể kết
luận chủng E. coli BL21(DE3) mang gen T4 của NNV đã được tạo thành công.
17
3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp
Nuôi tăng sinh bậc một bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng đã lựa chọn. Nuôi lắc đến khi
OD600nm của dịch nuôi đạt từ 0,5 - 0,6 thì bổ sung chất cảm ứng IPTG. Lấy canh khuẩn
vi khuẩn tái tổ hợp tại các thời điểm chưa bổ sung IPTG, sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h,
6h để phân tích sự biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bằng điện di SDS-PAGE, kết quả
được thể hiện ở hình 3.18 và hình 3.19.
Hình 3.18.
Điện di SDS-PAGE gel
polyacrylamide 15% dòng số 1 và 2
Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE gel
polyacrylamide 15% dòng số 3, 4
Giếng1,5: protein dòng 1,2 chưa cảm ứng
IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng 1 cảm ứng
bởi IPTG 2h, 4h, 6h; Giếng 6,7,8: protein
dòng 2 cảm ứng bởi IPTG 2h, 4h, 6h. Giếng
M: Broad-way Multi prestained protein
Marker
Giếng1,5: protein dòng 3,4 chưa cảm ứng
IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng 3 cảm
ứng IPTG 2h, 4h và 6h; giếng 6,7,8:
protein dòng 4 cảm ứng IPTG trong 2h,
4h và 6h. Giếng M: Broad-way Multi
prestained protein Marker
Kết quả hình 3.18: Giếng 1 và 5 không xuất hiện vạch protein lạ. Giếng 2,3,4 xuất hiện
một băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 17 kDa. Giếng số 6,7,8 xuất hiện một
băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết
protein T4. Như vậy dòng số 2 đã biểu hiện thành công gen T4.
Kết quả hình 3.19 cho thấy: Giếng số 1,5 không xuất hiện các vạch protein lạ. Các giếng
2,3,4,6,7,8 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước là 25 kDa tương ứng với
kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4.
Từ các kết quả trên cho thấy đã biểu hiện thành công gen T4 trong vi khuẩn E.
coli BL21(DE3) ở các dòng vi khuẩn BL21- pET32a+-T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp có
kích thước là 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4
của NNV.
18
Sự biểu hiện protein của
gen T4 được khẳng định lại
bằng phương pháp lai
Western blot với kháng thể
đặc hiệu kháng NNV. Kết
quả cho thấy vị trí phản ứng
giữa protein tái tổ hợp T4
với kháng thể đặc hiệu
chuẩn tương ứng tại vạch
điện di có kích thước
khoảng 25 kDa (hình 2.20).
Vì vậy có thể kết luận
kháng nguyên protein T4
của NNV đã được biểu hiện
thành công trong tế bào E.
coli BL21(DE3).
Hình 2.20. Kết quả Western blot của protein T4 tái tổ
hợp (M: thang chuẩn; giếng 1: protein tái tổ hợp T4;
giếng 2: protein T4 chuẩn của Mỹ)
3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4
của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
Xác định thời gian thu mẫu
Tế bào E. coli mang
plasmid tái tổ hợp được
nuôi cấy, thu mẫu tại
các thời điểm sau cảm
ứng 3, 4 và 12h. Kết
quả (hình 3.21) cho
thấy, thu mẫu sau 3h và
12h cho lượng protein ít
hơn, mẫu thu sau 4h
cho lượng protein nhiều
nhất.
Hình 3.21. Lượng protein tái tổ hợp T4 được tổng hợp
theo thời gian (M: thang protein chuẩn; Giếng 1, 2, 3:
lượng protein tái tổ hợp tại các thời điểm 3, 4, 12h)
19
Xác định nhiệt độ nuôi cấy
Chủng
E.
coli
BL21-pET32a+- T4
ở 28oC, 30oC và
37oC, thu mẫu sau
4h cảm ứng. Kết
quả thể hiện ở hình
3.22 cho thấy ở
28oC
và
30oC
không xuất hiện
băng protein ở kích
thước 25 kDa, nhiệt
độ nuôi 37oC thì đã
biểu hiện được
protein tái tổ hợp
T4.
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp T4 (giếng 1, 2, 3: lượng protein khi nuôi ở
28oC, 30oC và 37oC, M: thang protein chuẩn).
Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG
IPTG được bổ sung vào
môi trường với các nồng
độ từ 1- 6 mM. Kết quả
trong hình 3.23 cho thấy,
sau khi cảm ứng IPTG,
dòng tái tổ hợp đã tổng
hợp một lượng lớn
protein có kích thước
khoảng 25 kDa (kích
thước lý thuyết
của
protein T4 tái tổ hợp).
Trong các nồng độ IPTG
được khảo sát cho thấy
gen T4 được biểu hiện Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến mức độ
biểu hiện protein T4 tái tổ hợp
tốt nhất khi chủng được
cảm ứng IPTG ở nồng độ M: thang chuẩn, giếng 1 - 6: nồng độ IPTG tương ứng từ 1
1 mM.
mM đến 6 mM.
20
3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
Kết quả Hình 3.24 cho thấy,
tất cả các phân đoạn dịch tinh
sạch đều xuất hiện duy nhất
một băng protein ở kích thước
25 kDa chứng tỏ protein T4
đã được tinh sạch thành công.
Đề tài đã sử dụng kháng
nguyên protein T4 này để thử
nghiệm đánh giá khả năng tạo
kháng thể trung hoà nhằm tạo
nguyên liệu sản xuất vắc-xin
phòng bệnh cho cá mú.
Hình 3.24. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDSPAGE (M: Thang protein chuẩn, giếng 1-5: kháng nguyên
T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4, 5)
3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
trên thỏ
Khả năng kích thích tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên E.coliBL21- pET32a+-T4
và protein tái tổ hợp T4 trên thỏ được trình bày trong Bảng 3.10 và bảng 3.11.
Bảng 3.10. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở
mô hình in vitro
Thời gian thu
Độ pha loãng huyết thanh thỏ được
Đối
huyết thanh
Đối chứng âm (CPE %)
gây miễn dịch để trung hòa liều gây
chứng
thỏ sau khi
nhiễm 104 TCID50
dương
gây miễn dịch
(CPE
E.coli BL21- Protein tái tổ
E.coli BL21Protein tái tổ hợp
(ngày)
%)
pET32a+-T4*
pET32a+-T4*
hợp T4*
T4*
5
98
0
0
ND
ND
15
98
0
0
1: 5
ND
25
98
0
0
1: 200
1: 50
35
98
0
0
1: 800
1: 200
45
98
0
0
1: 800
1: 200
60
98
0
0
1: 400
1:100
*
(Ghi chú: Độ pha loãng cao nhất cho phản ứng trung hòa (không có hiệu ứng
bệnh tích tế bào); ND: huyết thanh không trung hòa vi rút cường độc)
Bảng 3.10 cho thấy: Các mẫu đối chứng âm đã không gây hiệu ứng bệnh tích tế
bào. Các mẫu đối chứng dương, huyết thanh thỏ bình thường không có khả năng trung
hòa chủng QN2 cường độc, tất cả các giếng nuôi cấy tế bào đều có xảy ra hiệu ứng bệnh
tích tế bào (CPE).
Ở lô thí nghiệm vào ngày thứ 15, chỉ có lô huyết thanh được gây miễn dịch
E.coliBL21- pET32a+-T4 bắt đầu sinh kháng thể ở độ pha loãng 1: 5. Ở cả hai lô thí
nghiệm đều sinh kháng thể từ ngày thứ 25 sau khi gây miễn dịch. Lô huyết thanh thỏ
21
được tiêm E.coliBL21-pET32a+-T4 trung hòa vi rút ở độ pha loãng 1:200 cao hơn so với
lô huyết thanh tiêm protein tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:50. Từ ngày thứ 35-45,
hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao nhất ở cả hai lô thí nghiệm, trong đó lô được tiêm E.coli
BL21- pET32a+-T4 cho kết quả hiệu giá trung hòa ở độ pha loãng huyết thanh là 1:800, lô
được tiêm protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:200. Vào ngày cuối cùng của
thí nghiệm (ngày thứ 60) thì ở cả hai lô thí nghiệm hiệu giá trung hoà đều giảm, lô được
tiêm E.coli BL21- pET32a+-T4 cho kết quả hiệu giá trung hoà là 1:400, còn lô được tiêm
protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:100.
Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở
mô hình in vivo được trình bày ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở
mô hình in vivo
Đối chứng
Thời gian thu
dương
huyết thanh
thỏ sau khi
Nhiễm
Chết
gây miễn
bệnh
(%)
dịch (ngày)
(%)
Đối chứng âm (tỷ lệ
nhiễm bệnh %)
E.coli
BL21pET32a+T4
Protein
T4 tái tổ
hợp
Huyết thanh của thỏ được gây miễn dịch
E.coli
BL21- pET32a+-T4
Hiệu giá
trung hòa
Gen
T4
Protein T4 tái tổ
hợp
Hiệu giá
Gen T4
trung hòa
5
100
100
0
0
ND
+
ND
+
15
100
100
0
0
ND
+
ND
+
25
100
100
0
0
1: 100
-
1: 50
-
35
100
100
0
0
1: 100
-
1: 50
-
45
100
100
0
0
1: 100
-
1: 50
+
60
100
100
0
0
1: 50
+
1: 10
+
(Ghi chú: ND: huyết thanh không trung hòa vi rút cường độc;
(+): có gen T4, (-): không có gen T4)
Kết quả bảng 3.11 cho thấy ở hai lô thí nghiệm huyết thanh của thỏ được gây
miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp thì trong thời gian 15
ngày đầu huyết thanh chưa tạo được kháng thể. Vào ngày thứ 25 kéo dài đến ngày thứ 45
ở lô huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 có khả năng tiết
kháng thể trung hòa NNV cường độc ở độ pha loãng là 1:100, kiểm tra gen mã hoá
kháng nguyên T4 là âm tính. Ở lô huyết thanh được gây miễn dịch protein T4 tái tổ hợp
từ ngày 25 đến ngày 35 cho thấy độ pha loãng huyết thanh đạt 1:50 và không phát hiện
được gen mã hoá kháng nguyên. Tuy nhiên, tại ngày thứ 45, mặc dù hiệu giá trung hòa
của huyết thanh đạt 1:50, toàn bộ cá mú không bị chết nhưng vẫn phát hiện được gen T4.
Vào ngày thứ 60, mặc dù ở cả hai lô thí nghiệm huyết thanh thỏ vẫn tạo kháng thể trung
hoà độc lực làm cho vi rút không còn khả năng gây bệnh, hiệu giá trung hoà ở hai lô thí
nghiệm đạt từ 1:10 đến 1:50 nhưng vẫn phát hiện được gen T4 trên cá thí nghiệm.
Từ các kết quả trên cho thấy protein T4 tái tổ hợp có khả năng tạo kháng thể trung
hoà vi rút gây bệnh mặc dù kháng thể tạo ra thấp hơn so với chủng vi khuẩn biểu hiện
gen mã hoá kháng nguyên E.coliBL21-pET32a+-T4.
22
3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái
tổ
hợp trên cá mú
Các kết quả được trình bày ở bảng 3.12 cho thấy các mẫu đối chứng âm, cá được
gây miễn dịch với kháng nguyên E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp có sinh
kháng thể đặc hiệu với NNV và không gây hiệu ứng bệnh tích tế bào.
Bảng 3.12. Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV trên mô hình in
vitro
Độ pha loãng dịch chiết của cá được gây miễn dịch để
trung hòa NNV QN2 (104 TCID50)
Lô thí nghiệm
30
45
15 ngày
60 ngày 75 ngày 90 ngày
ngày
ngày
Đối chứng dương
+
+
+
+
+
+
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với E.coliBL21-pET32a+-T4
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với protein T4 tái tổ hợp
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với E.coliBL21-pET32a+-T4 + 1:64
1:256
1:128
1:128
1:64
1:8
NNV cường độc
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với protein T4 tái tổ hợp+ 1:16
1:128
1:128
1:64
1:64
1:8
NNV cường độc
Ghi chú: +: có hiệu ứng bệnh tích tế bào
-: không có hiệu ứng bệnh tích tế bào
Các mẫu đối chứng dương, chủng NNV QN2 cường độc liều TCID50 =104 gây nhiễm
vào tế bào GS1 thì tất cả các tế bào đều có xảy ra hiệu ứng bệnh tích tế bào.
Các lô thí nghiệm khi gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái
tổ hợp thì đều sinh kháng thể từ ngày thứ 15 với hiệu giá tương ứng 1:64 và 1:16. Với
thí nghiệm dịch chiết cá mú gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 thì lượng kháng
thể cao nhất vào ngày thứ 30 đến 60, đạt hiệu giá 1:128 - 1:256. Đến ngày thứ 75 thì
lượng kháng thể giảm, hiệu giá đạt 1:64. Ở thí nghiệm dịch chiết cá mú được gây
miễn dịch với protein tái tổ hợp T4 có tạo kháng thể cao nhất ở ngày thứ 30 đến ngày
thứ 45, đạt 1:128. Từ ngày thứ 60 đến 75 thì lượng kháng thể giảm dần chỉ đạt hiệu giá
1:64. Thời gian bảo hộ đối với cá mú kéo dài đến 90 ngày ở cả hai lô thí nghiệm. Đây là
cơ sở khoa học để ứng dụng sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá
mú.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam mới chỉ có ít loại vắc-xin được sử dụng để
phòng bệnh cho một số loài cá nuôi có giá trị kinh tế cao với quy mô nuôi công nghiệp
như cá hồi, cá vược, cá mú, cá tráp, cá chim nhưng chủ yếu là vắc-xin bất hoạt.
Năm 2009, tại Nhật Bản Yamashita và cs đã thử nghiệm dùng vắc-xin bất hoạt
với formalin để phòng bệnh VNN cho cá mú 7 vạch (khối lượng trung bình 25,4 g/con).
Sau 20 ngày thử nghiệm tiêm vắc-xin thì kháng thể được tạo ra trong khi đó cá ở các lô
đối chứng không sản sinh kháng thể [69]. Vắc-xin bất hoạt chủng RGNNV, Pakingking
và cs (2010) đã thử nghiệm tiêm để phòng bệnh VNN cho cá mú cọp nuôi thương phẩm.
Kết quả cá được tiêm vắc-xin kháng thể trung hòa tạo ra từ ngày thứ 15 (hiệu giá 1: 800)
và kéo dài đến 190 ngày (hiệu giá 1:400)[51].
23
