Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TT

Tên 
viết tắt

1

ALL

Bệnh bạch cầu cấp dòng 
lympho

Acute lymphoblastic 
leukemia

2

AML

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Acute myeloid leukemia

3

BCC

Bạch cầu cấp

Leukemia

4

CE

Cacboxyl esteraza

Carboxyl esterase

5

CS

Cộng sự

et al

6

CD

Dấu ấn miễn dịch

Cluster of Differenciation

7

FAB

Hội các nhà huyết học Pháp ­ 
Mỹ ­ Anh

French ­ American ­ British

8

HHTB

Nhuộm Hóa học tế bào

Cytochemistry

9

HLA ­ DR

Kháng nguyên bạch cầu người

Human Leukocyte antigen

10

LA

Bệnh bạch cầu cấp

Acute leukemia

Tên Tiếng Việt

Tên Tiếng Anh


11

L1

Bệnh bạch cầu cấp dòng 
lympho đã biệt hóa

Homogenous small blast type

12

L2

Bệnh bạch cầu cấp dòng 
lympho chưa biệt hóa

Heterogenous blast type

13

L3

Bệnh bạch cầu cấp dòng 
lympho loại Burkitt

Homogenous lager blast type

14

M0

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 
biệt hóa tối thiếu

Minimally differentiated 
acute myeloid

15

M1

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 
không có tế bào trưởng thành

Acute myeloblastic leukemia, 
without maturation

16

M2

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy 
có tế bào trưởng thành

Acute myeloblastic leukemia, 

with granulocytic maturation

17

M3

Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền 
tủy

Acute promyelocytic 
leukemia

18

M4

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy ­  Acute myelomonocytic 
mono
leukemia

19

M5

Bệnh bạch cầu cấp dòng 
mono

Acute mono

20

M6

Bệnh bạch cầu cấp dòng         
hồng cầu

Acute erythroid leukemia

21

M7

Bệnh bạch cầu cấp dòng            Acute megakaryoblastic 
tiểu cầu
leukemia

22

NE

Esteraza không đặc hiệu

Non­specific esterase


Esteraza không đặc hiệu ức 
chế bằng NaF

Non­specific esteraza ­ NaF 
inhibitor

Photphataza axit

Acid photphatase

PAL

Photphataza kiềm

Alkaline photphatase

26

PAS

Periodic Axit Schiff

Periodic ­Acid ­ Schiff

27

PER

Peroxydaza

Peroxidase

28

SD

Sudan đen

Sudan black

29

SLTBT

Số lượng tế bào tủy

The number of myeloid cells

30

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

World Heath Organization

23

NE ­ NaF

24

PA

25

DANH MỤC HÌNH


 DANH MỤC BẢNG


MỞ ĐẦU
Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ  thống tạo máu với  
đặc trưng bởi sự  tăng sinh và tích tụ  tế  bào non trong máu và tủy xương. Bạch  
cầu cấp được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng 
lympho. Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường  
trong tủy xương. Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá  
trình tạo máu dòng lympho. Những tế  bào này lấn át sự  sinh máu bình thường  
trong tủy xương, chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các  
cơ  quan nội tạng [23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm 
trùng và dẫn tới tử  vong nếu không được phát hiện và điều trị  kịp thời. Vì vậy,  
việc xác định chính xác  thể  bệnh cũng như  dòng tế  bào bị  ung thư  có vai trò 
quyết định trong điều trị. Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch 
cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do  
các nhà Huyết học Pháp­Anh­Mỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái 
học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung  thêm kết quả miễn 
dịch và di truyền [15, 17]. 
Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic­Acid Schiff (PAS), sudan  
black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế 
bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp  
nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn 
dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, 
dễ  triển khai. Hiện nay, các bộ  kít nhuộm có bán trên thị  trường là các kít đơn,  

giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ  thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, 
quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác  
nhau, bước tẩy màu của kỹ  thuật nhuộm Sudan và Periodic ­ Acid Schiff khó  
đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính  
nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự 

6


pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ  nhạy, độ  đặc hiệu còn thấp. Theo 
Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học­hóa  
học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng  
lympho là 88,88% và độ đặc hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn 
thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm  
hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và  
di truyền [19]. Hiên nay, tác gi
̣
ả  Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học­ Truyền  
máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào 
đồng   bộ   HICYTEC   gồm   10   kỹ   thuật:   Giemsa,   Periodic­Axit   Schiff   (PAS),  
Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không  
đặc hiệu  ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls. Bộ kít đã 
cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên . Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của 
bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm 
hóa học tế bào để  phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề  tài 
có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế ­ xã hội cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế 
bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học  
và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể  bệnh  
theo tiêu chuẩn FAB (1986).

Nội dung nghiên cứu:
Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy 
lần đầu tại Viện Huyết học­Truyền máu trung ương.
Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế  bào đồng bộ 
HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di  
truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể  bệnh theo tiêu chuẩn 
FAB.

7


Đánh giá giá trị  của kít nhuộm hóa học tế  bào đồng bộ  HICYTEC, khi 
nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls  
trên bệnh nhân bạch cầu cấp. 

8


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Quá trình sinh máu
1.1.1. Cơ quan sinh máu
Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến 
ức) và tổ  chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ  quan tạo máu gồm có gan, lách,  
hạch. Sau khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở 
tủy đỏ của các xương. Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra  
tại đầu các xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh  
máu ngoài tủy biệt hóa các dòng lympho T và B [6].
1.1.2. Quá trình sinh máu
Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh 

ra từ tế bào gốc vạn năng. Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự 
kích thích đặc hiệu mà tế  bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế  bào  
có chức năng cần thiết [11]. Ba kích thích tố  chính tạo máu gồm: Erythropoietin  
tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colony­stimulating factors cùng với 
interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu. Quá trình sinh máu được điều hòa bởi 
yếu tố di truyền đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13].
1.2. Bệnh bạch cầu cấp
1.2.1. Khái niệm chung
Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với  
đặc điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở 
ngoài máu ngoại vi, tủy xương có trên 30% tế  bào non (blast) trong tổng số  tế 
bào có nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào 
các cơ quan [12].
1.2.2. Dịch tễ học
Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2014, 
ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Tỷ lệ 

9


nam (3.100) và nữ (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này  
là 1.450 người [52];
Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp   bạch cầu cấp 
dòng tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp  
dòng lympho mới trên toàn quốc [44];
Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ  về  dịch tễ 
học của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện  
Huyết học­Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp 
gặp tỷ lệ cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại  
Bệnh viện Bạch Mai [7].

1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh
Cho  tới nay nguyên  nhân  gây bệnh chưa   được  sáng tỏ.  Tuy nhiên  qua  
nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:
Tia  xạ: Những  người  tiếp xúc  nhiều với  tia  ion hóa  hay  tia  xạ 
thường có nguy cơ bị bạch cầu cấp;
Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử  dụng hóa 
chất để chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;
Virus:   Human   T­cell   lymphotropic   virus   gây   bạch   cầu   cấp   dòng 
lympho, Epstein­Barr virus (EBV) gây ung thư vòm...
Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội 
chứng Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu  
cấp [12].
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh
Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene): Các gen bình thường do 
yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen 
ung thư. Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt 
tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào;

10


Gen  ức chế  ung thư: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh 
được trong tế  bào bình thường có những gen kiểm soát sự  tăng sinh, nếu  
mất các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u;
Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số  gen hoạt hóa 
và kích thích tăng sinh tế bào. Khi các gen này được giải phóng và kết hợp  
với gen  ức chế bị kìm hãm sẽ làm tăng trưởng mạnh sự phát triển khối u  
và làm các tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37].
Một số  biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho được 
thể hiện trên Bảng 1.1 [10].

Bang 1.. 
̉
Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho.
Tiên lượng
Tốt

Loại bất thường
Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21)

Trung bình

Trên lưỡng bội từ  47­50 NST; 46XX/XY (bộ  NST bình 
thường); Chuyển đoạn t(1;19)

Xấu

Thiểu bội, mất NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn 
t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14).

1.2.5. Phân loại
Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy:  Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp  
dòng tủy  theo FAB 1976. Bạch cầu cấp dòng tủy được chia làm các thể từ 
M1 đến M7:
Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa;
Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;
Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu và chia làm 2 nhóm:
M3h: chứa các hạt đặc hiệu lớn;
M3v: chứa các hạt đặc hiệu nhỏ.
Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm:
M4: lơ xê mi cấp tủy ­ mono;

11


M4eo: lơ xê mi cấp tủy ­ mono có tăng bạch cầu ái toan.
Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:
M5a: ≥80% tế bào mono là monoblast;
M5b:<80% tế bào mono là monoblast.
Thể M6: Thể bạch cầu cấp dòng tủy với hội chứng loạn sản hồng cầu;
Thể M7: lơ xê mi cấp nguyên mẫu tiểu cầu.
Xếp loại bạch cầu cấp dòng lympho: Theo xếp loại FAB, bạch cầu cấp  
dòng lympho được chia làm 3 thể từ L1 đến L3 thể hiện trên bảng 1.2.
Bang 1.. 
̉
Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB.
Hinh thai tê bao
̀
́ ́ ̀

L1

L2

L3

Kich th
́
ươc tê bao
́ ́ ̀

Nho, đêu
̉ ̀

Lơn, không đêu
́
̀

Lơn, đêu
́
̀

Chât nhiêm săc
́
̃
́

Đông nhât, min
̀
́
̣

Không đông nhât
̀
́

Min va đông nhât
̣
̀ ̀
́

Hinh dang nhân
̀
̣

Đêu đăn, đôi khi 
̀ ̣
co ranh, khia
́ ̃
́

Không đêu, 
̀
thương co ranh, 
̀
́ ̃
khiá

Đêu đăn, hinh bâu
̀ ̣
̀
̀ 
duc hoăc tron
̣
̣
̀

Không thây hoăc 
́
̣

Môt hay nhiêu hat 
̣
̀ ̣ Môt hay nhiêu hat
̣
̀ ̣ 

nhỏ

nhân to

nhân hinh tui
̀
́

Nhân/ Bao t
̀ ương

Thâṕ

Kha cao, thay đôi
́
̉

Cao

Bao t
̀ ương ưa base

Nhe, v
̣ ưa hoăc đâm

̀
̣
̣
Vưa hoăc đâm
̀
̣
̣

Hat nhân
̣

Không bao trong 
̀
bao t
̀ ương

Thương không co
̀
́

Rât đâm
́ ̣

Thương không co
̀
́ Hôc to va nhiêu
́
̀
̀

1.2.6. Đặc điểm lâm sàng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh là hậu quả của quá trình sản sinh quá nhiều 
tế  bào non, ác tính lấn át các tế  bào máu sinh máu bình thường. Bệnh có nhiều 
thể, mỗi thể có những đặc điểm riêng, các biểu hiện lâm sàng chung nhất gồm:

12


Hội chứng thiếu máu: xảy ra nhanh, nặng dần với các biểu hiện da xanh, 
mệt mỏi, hoa mắt chóng mặt, nhịp tim nhanh. Thường không cân xứng với  
tình trạng xuất huyết;
Hội chứng xuất huyết: xuất huyết tự  nhiên, hay  ở  da ­ niêm mạc (chấm  
nột đám mảng xuất huyết, chảy máu mũi, chảy máu chân răng...) có thể ở 
các tạng (xuất huyết đường tiêu hoá, tiết niệu, tử cung, não ­ màng não...);
Hội chứng nhiễm trùng: Sốt, viêm loét miệng họng, viêm phổi, nhiễm trùng 
da;
Hội chứng thâm nhiễm: Gan to, lách to, hạch to, phì đại lợi , thâm nhiễm  
da, đau xương, cơ khớp...
Toàn trạng chung: mệt mỏi gầy sút, suy sụp nhanh.
1.2.7. Đặc điểm xét nghiệm
Huyết đồ:
Thiếu máu bình sắc, hồng cầu bình thường, hồng cầu lưới giảm;
Bạch cầu: số  lượng bạch cầu thường tăng,  nhưng có  thể  bình thường hoặc  
giảm. Công thức bạch cầu thường gặp một tỷ lệ tế bào blast. Tuy nhiên một số 
trường hợp số lượng bạch cầu giảm nặng có thể  không gặp tế  bào blast ở  máu  
ngoại vi;
Tiểu cầu: số lượng giảm.
Tuỷ đồ:
Số lượng tế bào tuỷ: thường tăng, tủy giàu tế bào. Trong một số trường hợp tủy  
nghèo hoặc có mật độ bình thường;

Tăng sinh tế bào blast trên 30% tế bào có nhân trong tuỷ xương;
Các dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu bị lấn át. 
Sinh thiết tuỷ xương: Chỉ định khi chọc hút tuỷ nghèo tế bào. Các khoang 
sinh máu có nhiều tế bào ác tính, có thể có tình trạng xơ.

13


Nhuộm hoá học tế  bào: Sử  dụng hóa chất nhuộm một số enzym và các 
chất có trong tế  bào, qua đó xác định được dòng tế  bào, kết hợp với kết  
quả  hình thái học trên tiêu bản nhuộm giemsa có thể  phân loại thể  bệnh  
bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB.
Xét nghiệm miễn dịch:
Bằng kỹ  thuật miễn dịch phát hiện các kháng nguyên dấu  ấn trên màng 
các tế bào blast (CD­Cluster of Differentiation) và đối chiếu với sự xuất hiện các 
CD này trong quá trình biệt hóa và trưởng thành tế bào máu bình thường để biết  
bản chất dòng và giai đoạn biệt hóa của tế bào trong bệnh bạch cầu cấp.
Nhóm dấu  ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu dòng t ủy: 
Các tế  bào  non  thuộc dòng tủy sẽ  phản  ứng dương tính với các kháng 
nguyên CD33 hoặc CD14.
Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho B:
Tế bào nguồn đầu dòng B: CD10, CD19;
Tế bào tiền lympho B: CD10, CD19, CD20;
Lympho B trưởng thành: CD19, CD20, CD21, CD22, CD23;
Tương bào: CD38.
Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho T:
Tế bào nguồn đầu dòng T: TdT, HLA;
Tế bào tiền lympho T: TdT, CD7, CD2, CD3;
Tế bào lympho T4: CD2, CD3, CD4;
Tế bào lympho T8: CD2, CD3, CD8.

Xét nghiệm về di truyền NST:
Xét   nghiệm   di   truyền   thường   được   dùng   để   chẩn   đoán   và   tiên   lượng  
bệnh. Có một số bất thường nhiễm sắc thể phổ biến trong một số thể bạch cầu  
cấp (chuyển đoạn, đảo đoạn,…), cụ thể như sau:
t(8;12) trong  bạch cầu cấp M2;

14


t(15;17) trong bạch cầu cấp M3;
Inversion (inv) 16 trong bạch cầu cấp M4Eo;
t(9;22) trong bạch cầu cấp dòng lympho.
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào
Nhuộm hóa học tế  bào từ  lâu đã trở  thành đối tượng được các nhà khoa  
học tập trung nghiên cứu phát triển các kỹ thuật nhằm phát hiện các enzym cũng 
như các chất chuyển hóa có trong nội bào tế bào. Năm 1885, Ehrlich là người đầu 
tiên nhuộm enzym cytochrom oxidaza trong các mô tươi bằng phản  ứng "Nadi" 
giữa    ­naphtol và dimethyl­p­phenylethylendiamine và có thể quan sát được trên 
kính hiển vi. Neukirch (1910) giới thiệu kỹ thuật nhuộm phát hiện các glycogen  
trong các bạch cầu trung tính bằng phẩm màu carmin theo phương pháp Best [ 31, 
40]. Năm 1947, Bailllif và Kimbrough  ứng dụng dùng Sudan B nhuộm hạt mỡ 
bạch cầu để  phân biệt dòng tuỷ  và các dòng khác [31, 40]. Đầu những năm 50 
của thế  kỷ XX, sự phát triển mạnh mẽ  của các loại phẩm màu azo đã giúp các  
nhà nghiên cứu đưa các tiến bộ  trong ngành hóa màu vào  ứng dụng nhuộm hóa 
học tế bào [30, 32, 51]. Năm 1953, Gomori là người đầu tiên phát triển kỹ  thuật 
nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người sử dụng naphtol AS­D cloaxetat làm cơ 
chất [55]. Việc phối hợp với các công nghệ  khác như  kỹ  thuật kháng thể  đơn  
dòng và các phương pháp phân tích dòng chảy đã cho phép tự  động hóa đạt kết 
quả tin cậy cao [45]. Phương pháp hình thái học­nhuộm hóa học tế bào cùng với 
miễn dịch và di truyền được ứng dụng rộng rãi trong chuyên ngành Huyết học để 

phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB và tiêu chuẩn WHO [28,  
32, 34, 49]. Hiện nay, trên thế giới thường sử dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm  
hóa học tế bào như sau:
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm Periodic­Axit Schiff (PAS)
Phương pháp dựa trên nguyên lý của phản ứng hóa học gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Axit periodic oxi hóa glycogen trong tế  bào thành diandehit 
theo hình 1.1:

15


1­2 Glycol

                                    Diandehit

Hình 1.. Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit
Ghi chú: R1, R2 là các gốc: amin (­RNH2) hoặc alkyl amino thế (­RNHR')
Giai   đoạn   2:   Diandehit   tạo   thành   tham   gia   vào   phản   ứng   nhuộm   hoàn 
nguyên bằng thuốc thử Schiff thể hiện trên hình 1.2: 
 Thuốc thử Schiff

Phẩm màu quinoit

Hình 1.. Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit
Như vậy, về mặt bản chất đây là một phản ứng nhuộm hoàn nguyên nhằm 
bộc lộ glycogen có trong nguyên sinh chất của tế bào. Kết quả dương tính khi có 
màu đỏ trên nguyên sinh chất của tế bào nghĩa là có glycogen và ngược lại.
Phản ứng PAS thường dương tính đối với bạch cầu ung thư dòng lympho, 
tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Các tế bào monoxit  
và  lymphoxít bình thường có độ dương tính rất thấp. Các dòng tế bào khác như 

dòng tủy, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu, tương bào dương tính dạng lan tỏa, còn tế bào 
bạch cầu  ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như  âm tính. Những tính chất  
khác nhau đó là cơ  sở  của kỹ  thuật nhuộm hóa học bạch cầu để  phân biệt các 
dòng tế bào và xếp loai  th
̣
ể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].
1.3.2. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER)
Cơ chế của phản ứng nhuộm peroxidaza đi qua hai giai đoạn thể hiện trên  
hình 1.3 và 1.4 [29, 46]: 
H2 O2

                        H2O + O:

Hình 1.3. H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử

Benzidin

16

Di­imin diphenyl


Hình 1.4. Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di­imin diphenyl.
Dưới xúc tác của peroxidaza là một enzym oxi hóa khử, nước ôxi già bị 
khử thành nước và oxi nguyên tử, oxi nguyên tử có tính oxi hóa mạnh đã oxi hóa  
benzidin thành 2­diimin diphenyl có màu vàng nâu. Nếu trên nguyên sinh chất của  
tế bào có màu vàng nâu chứng tỏ có mặt của peroxidaza.
Peroxidaza dương tính đối với các tế  bào dòng tủy, dương tính nhẹ  với 
dòng mono; âm tính với dòng lymphoxít, dòng hồng cầu và tiểu cầu.
1.3.3. Kỹ thuật nhuộm sudan B

Cơ chế của các phản ứng nhuộm rất khác nhau gồm khuếch tán vật lí đơn  
thuần hoặc liên kết hóa học trực tiếp. Trong các loại thuốc nhuộm, sudan là một  
nhóm phẩm nhuộm đượ c  ưa chuộng nhuộm lipit từ  vàng (Sudan III) đến đen 
(Sudan B). 
Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm sudan B cho kết quả bạch cầu hạt  
dương   tính   mạnh,   monoxit   dương   tính   yếu,   lymphoxit   và   hồng   cầu   âm   tính. 
Trong tủy xương bình thường, các tế  bào dòng tủy dương tính từ  tiền tủy bào 
đến tế  bào trưởng thành, dòng mono chỉ  dương tính  ở  các tế  bào trưởng thành; 
mẫu tiểu cầu và tiểu cầu âm tính. Trong nhiều trường hợp của bệnh bạch cầu 
cấp có thể phân biệt tương đối rõ dòng tủy và các dòng tế bào khác bằng kết quả 
nhuộm Sudan B. Kết quả dương tính Sudan B của mẫu bệnh phẩm thường cũng  
cho kết quả  dương tính với kỹ  thuật nhuộm Peroxidaza. Chính vì vậy kết quả 
nhuộm Sudan B là một trong những tiêu chuẩn được  ứng dụng phân loại thể 
bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [28].
1.3.4. Kỹ thuật nhuộm esteraza 
a) Nhuộm esteraza đặc hiệu [54]
Cơ chế phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu gồm hai giai đoạn:

17


Giai đoạn 1: Esteraza bạch cầu người thủy phân cơ  chất là các este tạo  
thành dẫn xuất của naphtol như hình 1.5:

Naphtol AS­D Cloaxetat

Naphtol AS­D

Hình 1.5. Thủy phân cơ chất este thành naphtol
Giai đoạn 2: dẫn xuất naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu 

azo theo hình 1.6
Hình 1.6. Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo
Cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu gồm nhiều loại: naphtol AS­D cloaxetat,  
Naphtol AS­OL 2­clopropionat... Trong giai đoạn 1, phân tử cơ chất dưới xúc tác 
của enzym tạo thành napthol theo cơ chế của hình 1. 5 và 1.6. Giai đoạn 2 là giai 
đoạn ghép đôi giữa naphtol và muối điazo. Về mặt bản chất đây là phản ứng thế 
electrophin của nhóm azo cho nguyên tử  proton  ở nguyên tử  cacbon C 4 trên vòng 
naphtol. Tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có màu đỏ  hoặc màu đen.  
Nếu xuất hiện màu trên nguyên sinh chất của tế bào có nghĩa là có esteraza. Tốc 
độ của quá trình nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ  cơ  chất,  
muối điazo, thành phần dung môi, nhiệt độ  và pH môi trường... các hóa chất sử 
dụng luôn đòi hỏi độ tinh khiết cao, giá thành đắt [3, 14, 40, 47, 55].

18


b) Kỹ  thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu  ức chế  và không  ức chế  bằng  
NaF
Nhuộm phát hiện esteraza không đặc hiệu bạch cầu người lần đầu tiên 
được công bố vào năm 1959 bởi Braunstein. Esteraza không đặc hiệu dương tính  
trong tất cả các dòng tế bào máu vì thế nên được gọi là không đặc hiệu. Cơ chế 
phản ứng thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống như nhuộm  
esteraza đặc hiệu (hình 1.4, 1.5  và 1.6). Cơ  chất thường sử  dụng là naphtol AS 
axetat,  ­naphtyl axetat,  ­naphtyl butyrat và naphtol AS­D axetat. Chất ghép đôi 
thường sử dụng là muối điazo và tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có 
phổ  màu khác nhau từ  đen đến đỏ. Các cơ  chất  cua 
̉ ­naphtyl axetat,   ­naphtyl 
butyrat thường cho phản  ứng dương tính mạnh đối với dòng mono, dòng tiểu  
cầu; các dòng khác lên màu dưới dạng hạt và yếu. Riêng tế bào lymphoxít B cho 
kết quả  âm tính. Đối với cơ  chất naphtol AS­D axetat và naphtol AS Axetat thì 

dương tính mạnh ở tất cả các dòng trừ dòng tế bào lymphoxit B. Tuy có mức độ 
dương tính khác nhau nhưng chỉ có dòng mono bị   ức chế  bởi NaF với nồng độ 
1,5 mg/1 ml. Chính nhờ  tính chất này mà kỹ  thuật nhuộm với chất  ức chế NaF  
thường dùng để phân biệt dòng mono với các dòng tế bào khác trong bệnh bạch  
cầu cấp và là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB [27, 28]. 
1.3.5. Kỹ thuật nhuộm photphataza 
Photphataza bạch cầu thuộc nhóm Hidrolaza (EC 3.1.3.2) là một enzym xúc 
tác cho phản  ứng thủy phân nhóm photphat từ  nhiều loại phân tử, bao gồm các  
nucleotide, protein, và ancaloit [3, 30].
Photphataza có mặt chủ  yếu trong lysosom và được giải phóng qua hệ 
thống lưới nội nguyên sinh chất. Photphataza là một hệ enzym không đồng nhất 
gồm nhiều iso enzym có thể  hoạt động  ở  pH tối  ưu khác nhau và được gọi tên 
gắn liền với điều kiện pH hoạt động tối  ưu như: photphataza kiềm (pH=8­9),  
photphataza axit (pH=5­6,5) [35, 38]. Trong các phương pháp nhuộm hóa học tế 

19


bào có hai kỹ thuật nhuộm photphataza là: Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm và  
photphataza axit Với sự  phát triển mạnh của kỹ  thuật hóa màu đặc biệt là phát 
hiện phẩm màu azo đã được ứng dụng vào để nhuộm photphataza kiềm và axit. 
Nguyên lý của kỹ thuật đi qua hai giai đoạn [40, 43].
Giai đoạn 1: Thủy phân cơ chất naphtyl photphat thành các naphtol tương 
ứng dưới sự xúc tác của photphataza kiềm (ALP) hoặc axít (AP) theo hình 1.7:

Natri  ­naphtyl photphate

­Naphtyl

Hình 1.7. Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol.

Giai đoạn 2: Naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo 
hình 1.6 như ở phần nhuộm esteraza.
Photphataza kiềm bạch cầu dương tính đối với dòng tủy từ  hậu tủy bào  
đến bạch cầu hạt. Tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh.  
Ngoài ra các tế  bào tạo cốt bào cũng cho phản  ứng dương tính trong kỹ  thuật 
nhuộm này. Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu  
giảm trong bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu  
tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản  ứng giả  bạch cầu  
[3, 25, 30, 40, 43].  
Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 
loại tế  bào B, tế  bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu. Dòng 
hồng cầu, mono, lympho (trừ  bệnh bạch cầu tế bào tóc ­tế  bào B hay còn gọi là 
Hairy cell) và dòng tủy từ  nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả  âm tính 
[40, 56].
1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học
Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh học  
và đặc biệt trong chuyên ngành Huyết học­Truyền máu. Trong bệnh bạch cầu 
cấp, kết quả  của phương pháp hình thái học­nhuộm hóa học tế  bào, phương  
pháp marker và di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế  bào bệnh bạch cầu 

20


cấp cũng như thể bệnh. Việc xác định chính xác thể bệnh quyết định việc dùng  
thuốc   điều   trị   đặc   biệt   là   các   thuốc   nhắm   đích.   Trong   bệnh   bạch  cầu   kinh,  
nhuộm photphataza kiềm thường bị giảm điểm nhuộm và có giá trị phân biệt với  
các bệnh nhiễm trùng, tăng bạch cầu đơn nhân... Năm 1976, Hội các nhà huyết 
học  Pháp­Anh­Mỹ  đã sử  dụng kết quả  của  các  phương pháp: hình thái học­
nhuộm hoá học tế  bào  làm cơ  sở  để  phân loại thể  bệnh trong bệnh bạch cầu  
cấp. Trong đó nhuộm hóa học tế bào dựa trên các kỹ  thuật: periodic ­axit schiff, 

peroxidaza,   esteraza   đặc   hiệu   và   không   đặc   hiệu   (ức   chế   và   không  ức   chế), 
Sudan B, photphataza kiềm, axit.  Năm 1986, đã bổ sung thêm các tiêu chuẩn dấu 
ấn miễn dịch và di truyền để nâng cao độ  chính xác trong phân loại dòng tế  bào 
và thể bệnh. Bảng 1.3 là một ví dụ  của Asa Barnes  [26] về tổ  hợp các kết quả 
của ba phương pháp: Hình thái học­hóa học tế bào, marker CD, di truyền để phân  
loại dòng tế bào lympho và thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986).

21


Bang 1.3. 
̉
Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker và di truyền [26]

22


Thể

L1

Hình thái học­số lượng 

Hóa học tế 

tế bào tủy 

bào

1)   <50%   SLTBT   là  1)

nguyên hồng cầu;
2)   ≥30%   tế   bào   có   nhân 
trong   tủy  là   tế   bào  blast 
loại I:
 Hầu   hết   là   tế   bào 

nhỏ;
 Nhân mịn, đồng nhất, 
23

hình thoi dẹt;

 

Marker CD

PAS  1) 1CD (+): TdT; CD (­): Smlg;

dương   tính  2) Early Pre B: (+): CD10, HLA­
hạt   to   trên 
DR;   (­/+):   CD19;   (­):   CD3,5, 
một   số 
Cylg.
lymphoblast 

trong   80% 
trường hợp;
2)

  Peroxid

aza, Sudan B, 

Di truyền

1) Early   Pre   B:   t(4;   11) 

(q21:q23).

3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLA­

DR; (­/+): CD10; (­): CD3,5.

2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).

4) Pre   T:   (+):   CD5;   (­): 

CD3,10,19, Cylg, HLA­DR.
5) 5) Lympho T: (+): CD3,5; (­): 
3) Pre   T   và   T:   t(1;   14) 


Thể

Hình thái học­số lượng 

Hóa học tế 

tế bào tủy 

bào

Marker CD

1)   <50%   SLTBT   là  1) PAS   dương  1) CD (+): TdT; CD (­): Smlg;

L2

nguyên hồng cầu;

tính   hạt   to 

2)   ≥30%   tế   bào   có   nhân 

trên   một   số 

trong   tủy  là   tế   bào  blast 
loại I:
 Tế  bào to, nhỏ  không 

đều;
 Nhân   không   đồng 
24

nhất;

trường hợp;
2) Peroxidaza, 

Sudan B, CE 

1) Early   Pre   B:   t(4;   11) 

(q21:q23).
2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).

lymphoblast 
trong   80% 

Di truyền

3) Pre   T   và   T:   t(1;   14) 
2) Early Pre B: (+): CD10, HLA­

(p32:q11);   t(7;v)(q32­q36; 

DR;   (­/+):   CD19;   (­):   CD3,5, 

v),   t(8;14)   (q24;q11), 

Cylg.

t(10;14)(q24;q11),   t(11;14)
(p13;q11­q13),   inv(14)

âm tính;

(q11;q32).

3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLA­

Thể

Hình thái học­số lượng 

Hóa học tế 

tế bào tủy 

bào

1) <50%   SLTBT   là  1) PAS   dương 

L3

nguyên hồng cầu;
2) ≥30%   tế   bào   có   nhân 

trong   tủy   là   tế   bào 
blast loại I:
 Tế   bào   to   và   đồng 

nhất;
 Nhân   đồng   nhất,   có 
25

các   chấm   hình   tròn 

tính   hạt   to 

trên   một   số 
lymphoblast 
trong   80% 
trường hợp;
2) Peroxidaza, 

Sudan B, CE 
âm tính;

Marker CD

1) CD (­): Smlg, TdT;
2) Early   Pre   B:   (+):   CD10, 

Di truyền

1) Early   Pre   B:   t(4;   11) 

(q21:q23).

HLA­DR;   (­/+):   CD19;   (­):  2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
CD3,5, Cylg.

3) Pre   T   và   T:   t(1;   14) 

3) Pre   B:   (+):   CD19,   Cylg, 

(p32:q11);   t(7;v)(q32­q36; 

HLA­DR; (­/+): CD10; 

v),   t(8;14)   (q24;q11), 

4) (­): CD3,5.

t(10;14)(q24;q11),   t(11;14)

5) Pre   T:   (+):   CD5;   (­): 

(p13;q11­q13),   inv(14)
(q11;q32).