Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký

Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………..
Chương 1 ­ TỔNG QUAN ……………………………………………….
1.1. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)

………
1.1.1. Cấu trúc phân tử …………………………………………………..
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole 
………….
1.1.3. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, 
Metronidazole ...........

1.1.4. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, 
Metronidazole ..........
1.1.5. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu ………..

………………...
1.2. Phương pháp xác 
định……………………………………………….
1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc 
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………………..
1.2.2. Một số công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng 
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 

…………………………………….
1.2.3. Một số công trình nghiên cứu xác định đồng thời các sulfamit và 
metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 
……….
Chương 2 ­ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
……..

1


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

2.1.  Đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu…………………
2.1.1.

Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 

…………………………………

2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu 
…………………………………………….. 
2.2.

 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………

2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 
…….

2.2.2.
2.3.

Phân tích định lượng bằng HPLC …………………………

 Giới thiệu chung về phương pháp chiết pha rắn ….

………….
2.4.

 Hóa chất và dụng cụ……………………………………………..

2.4.1.

Hoá chất 

…………………………………………………
2.4.2.

Dụng cụ 

………………………………………………………
Chương 3 ­ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
……………………………….
3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký 
……………………………………….
3.1.1. Chọn bước sóng của detector 
……………………………………..
3.1.2. Thăm dò khả năng tách của các Sulfamit trên cột RP­C18 
……….

3.2. Chọn pha tĩnh ……………………………………………………......
3.3. Tối ưu hóa pha động 
…………………………………………………
3.3.1. Nồng độ đệm axetat của pha động 
………………………………...
3.3.2. Độ pH cho dung dịch đệm axetat 

2


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

………………………………….
3.3.3. Tỉ lệ thành phần pha động 
………………………………………...
3.3.4. Tốc độ pha 
động ..............................................................................
3.4. Đánh giá phương pháp phân tích …………………………………..
3.4.1. Khảo sát lập đường chuẩn trong khoảng nồng độ 0,05 – 
1,000ppm
3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD); Giới hạn định lượng 
(LOQ) ................
3.4.3. Độ đúng, độ lặp lại của phép đo 
………………………………….
3.5. Mẫu thực, quy trình xử lý và kết quả phân tích 
…………………...
3.5.1. Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi 

…………………..
3.5.2. Phân tích mẫu thực 
………………………………………………………

KẾT LUẬN ……………………………………………………………….
TÀI LIỆU THAM KHẢO

3


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrin

Axetonitrin
Bộ Nông nghiệp phát
triển nông thôn

BNNPTNT
CV

Coeficient Variation

Hệ số biến thiên

HPLC

High Performance Liquid 
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng 
cao

RP

Reversed phase

Hấp phụ pha đảo

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantity

Giới hạn định lượng

TT
UV ­ Vis

Thông tư
Untraviolet ­ Visibet

4

Tử ngoại – Khả kiến


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1:
Bảng 3.2:
Bảng 3.3:
Bảng 3.4:
Bảng 3.5:
Bảng 3.6:
Bảng 3.7:
Bảng 3.8:
Bảng 3.9:
Bảng 3.10:
Bảng 3.11:

Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng 
detector…………………
Thời gian lưu và thứ tự ra pic của các chất phân 
tích………………..
Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat của pha 
động……………..
Hệ số dung tích ở các giá trị pH khác 
nhau………………………….
Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN trong pha 
động……………..
Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha 
động....
Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ các chất phân 
tích………
Bảng giá trị các Ftính của các chất phân 

tích............................................
LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy ..........................................
Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 
0,08ppm)
Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 
0,4ppm)

Bảng 3.12: Khảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp phân tích (nồng độ 

5

25
27
29
31
33­34
36
38­39
42
43
45
46
47­48


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

0,8ppm)
Bảng 3.13:
Bảng 3.14:
Bảng 3.15:
Bảng 3.16:
Bảng 3.17:
Bảng 3.18:
Bảng 3.19:
Bảng 3.20:
Bảng 3.21:
Bảng 3.22:

Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm ở các nồng độ thêm chuẩn khác 
nhau
Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các chất phân 
tích………………..
Kết quả phân tích các chất  đối với mẫu tôm 
rảo…………………….
Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm 
rảo…………………..
Kết quả phân tích các chất  đối với mẫu tôm chân 
trắng…………….
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm chân 
trắng……………….
Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm 
sú……………………...
Hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tôm 
sú……………………
Kết quả phân tích các chất đối với mẫu tôm 
lớt…………………….

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu tôm 
lớt……………………….

                                   

6

50
51
52
53
54
54
55
55
56
57


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1:
Hình 2.1:
Hình 3.1:

Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle 
protein…………………...
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy 
đủ………………………………..
Phổ hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến của các 
Sas……………

7

5
19
23­24


Luận văn Thạc sĩ
Thái
Hình 3.2:

                                                                                  Bùi Minh 

Diện tích của pic phụ thuộc vào bước sóng 
detector………………

25

Hình 3.3: Thời gian lưu của các sulfamit…………………………………… 26­27
Hình 3.4:
Hình 3.5:
Hình 3.6:
Hình 3.7:

Hình 3.8:
Hình 3.9:
Hình 3.10:
Hình 3.11:
Hình 3.12:
Hình 3.13:
Hình 3.14:
Hình 3.15:
Hình 3.16:

Sự phụ thuộc của k’ vào nồng độ đệm axetat trong pha 
động……
Píc sắc ký ở các giá trị nồng độ đệm khác 
nhau...................................
Sự phụ thuộc của K’ vào pH của pha 
động..........................................
Sắc đồ sắc ký ở pH khác 
nhau...............................................................
Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN trong pha 
động...............................
Sắc đồ píc sắc ký tại các tỉ lệ thành phần pha động khác 
nhau...........
Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha 
động.......................
Sắc đồ tốc độ khác nhau của pha 
động.................................................
Đường chuẩn của chất phân tích trong khoảng nồng độ 0,05­
1,00ppm….
Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 
270nm…

Sắc đồ của các chất phân tích nồng độ khác nhau tại bước sóng 
320nm…
Sắc đồ của 5 chất phân tích với nồng độ 
0,01ppm…………………
Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm 
….

8

29
29­30
31
32
34
34­35
36
37
39­40
40
41
43
45


Luận văn Thạc sĩ
Thái
Hình 3.17:
Hình 3.18:
Hình 3.19:
Hình 3.20:

Hình 3.21:
Hình 3.22:
Hình 3.23:
Hình 3.24:
Hình 3.25:
Hình 3.26:
Hình 3.27:
Hình 3.28:

                                                                                  Bùi Minh 

Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm 
……
Sắc đồ các chất phân tích sau 8 lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm 
……
Sơ đồ xử lý mẫu 
Tôm.............................................................................
Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu 
tôm........................
Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm rảo khi phân tích thêm 
chuẩn….
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU  trong mẫu tôm 
rảo………
Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm chân trắng khi phân tích thêm 
chuẩn..
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU trong mẫu tôm chân 
trắng...
Đường chuẩn của SGU, SMP trong mẫu tôm sú khi phân tích thêm 
chuẩn  
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU, SMP trong tôm 

sú……….
Đường chuẩn SGU trong mẫu tôm lớt khi phân tích thêm 
chuẩn…..
Sắc đồ pic sắc ký khi thêm chuẩn SGU  trong tôm 
lớt…………….

9

47
48
49
50
53
53
54
54
55
56
57
57


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

MỞ ĐẦU
Dư  lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề  quan ngại của hầu 
hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh thông 

thường (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) bản thân nó có thể 
gây ra tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số  loại khác như  các  
kháng sinh nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có 
thể sinh ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Họ thuốc kháng 
khuẩn Sulfamit (SAs) là nhóm kháng khuẩn có hoạt phổ  rộng, được sử  dụng 
nhiều trong trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, v.v..
Việc sử  dụng chất này một cách tùy  tiện có thể  dẫn đến tồn dư  một 
lượng lớn quá giới hạn cho phép trong cơ thể  động vật. Khi người tiêu dùng sử 
dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay các chất kháng sinh trong thời  gian 

10


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
dài gây ra một loạt các phản ứng như rối loạn đường tiết niệu, rối loạn tạo máu , 
rối   loạn   chuyển   hóa  porphyrin.   Cho   nên   việc   xác   định   chính   xác   lượng   các 
sulfamit, các chất kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và lượng tồn dư  trong sản 
phẩm từ động vật là rất quan trọng.
Dựa trên thực tế đó, trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các 
điều   kiện   tách   và   xác   định   đồng   thời   chất   kháng   sinh   metronidazole   và   các 
sulfamit như sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin  
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV –  
Vis, phương pháp này có độ  chọn lọc, độ  nhạy tốt và được trang bị  ở  nhiều cơ 
sở kiểm nghiệm của nước ta, có tính khả thi và ứng dụng vào thực tế cao.

                             

Chương 1 ­ TỔNG QUAN
1.2. Giới thiệu chung về sulfamit (SAs), metronidazole(MTD)

1.1.1. Cấu trúc phân tử [3,6]
 Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát:
R2 N

SO2 NH R1

Khi thay thế các nhóm R1, R2 bằng các gốc khác nhau, chúng ta có các SAs 
khác nhau.Vì thế có cả một họ SAs. 

11


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
Khi R2 = H thì sulfamit mới có hoạt tính kháng khuẩn. Khi R2 # H, thì chất 
đó là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng, dị vòng. Tuy nhiên nếu R1 là dị vòng thì 
hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông thường các dị vòng 2­3 dị tố.
Cấu trúc Metronidazole(MTD):

Là một thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt đối với vi 
khuẩn kỵ khí 
   và đ
 
ộng vật nguyên  sinh. MTD là một trong những thành phần có 
mặt trong thức ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (với tên 
thương mại là Enro DC).
1.1.3. Tính chất vật lý và hoá học của các Sulfamit, Metronidazole [3]

1.1.2.1. Tính chất vật lý

SAs  ở  dạng tinh thể  màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi, thường ít tan  
trong nước, tan trong dung dịch axít, tan trong dung dịch kiềm (trừ sulfagu­anidin). 
MTD  là tinh thể  hoặc bột kết tinh, hơi vàng, không mùi, bền ngoài không 
khí, sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng. Nóng chảy ở khoảng 159 oC – 163oC. 
Metronidazol khó tan trong nước, aceton.
1.1.2.2. Tính chất hoá học
­ SAs có tính chất lưỡng tính: 
Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung dịch axít. 
Ví dụ: cho kết tủa muối picrat trong dung dịch HCl loãng.

12


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
Có tính axít do có nguyên tử  H  ở  N­amit linh động, nên dễ  tan trong  
dung dịch kiềm tạo muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin):
R
H2N

SO2

R

N

H2N

H

H2N

SO2

SO2

N

N
H

R

Na

­ SAs tạo muối phức kết tủa với ion Ag +, và tạo phức màu kết tủa với ion 

Cu2+, Co2+, …
­ Ở  nhóm amin bậc một của SAs có đôi điện tử  tự  do, giúp SAs thực hiện  

phản ứng tạo phức chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho phức màu tím 
có bước sóng hấp thụ cực đại ở 270­273 nm.
­ Nhóm   amin   thơm   tự   do   cho   phản   ứng   diazo   hoá,   rồi   ngưng   tụ   với  

a  ( b)   naphtol cho sản phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ ở bước sóng 460nm.
              Ar­NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar­N+ ≡N]Cl­ + NaCl + 2H2O
                                                             Mu ối diazoni
Ở đây, Ar – là thành phần ­C6H5­SO2NH­R1 của phân tử SAs.
Nhờ thế mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp này diễn ra dễ dàng.

1.1.6. Tính chất dược lý và phổ tác dụng của Sulfamit, Metronidazole [3,6,9]

Với liều điều trị, SAs không diệt vi khuẩn, chỉ làm vi khuẩn yếu đi, không  
phát triển và sinh sản được, dễ bị bạch cầu tiêu diệt.
SAs có phổ tác dụng và hoạt phổ rộng: tác dụng lên nhiều vi khuẩn than, vi  
khuẩn tả, Shigella, E.coli, trực khuẩn Hansen...   Ít hoặc không tác dụng trên một 
số vi khuẩn: liên cầu khuẩn yếm khí, trực khuẩn lao, Ricketchia... Không có tác  

13


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
dụng đối với virut (trừ  virut gây đau mắt nhạy cảm với sulfacylum). Nhưng lại  
có tác dụng lên một số ký sinh trùng, đặc biệt ký sinh trùng sốt rét.
Tính hấp thu và đào thải: trừ  nhóm SAs điều trị  đường ruột, các SAs nói  
chung đều được hấp thu nhanh ở ruột non, đào thải chủ yếu qua đường thận với  
tốc độ khác nhau nên thời gian có tác dụng khác nhau.
Metronidazole cũng có hoạt phổ rộng bao gồm động vật nguyên sinh và các 
vi khuẩn yếm khí bao gồm: nhóm Bacteroides(gồm cả B. fragilis), Fusobacterium 
Veillonella,  nhóm   Clostridium   (bao   gồm   cả   C.  difficile   và   C.  perfringens), 
Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus. Nó là hiệu quả  đối với B. fragilis 
phân lập kháng với clindamycin..
Metronidazole cũng có những hoạt động  ức chế  miễn dịch và kháng viêm, 
và nó đã được sử  dụng trong các bệnh nhân bị  bệnh rosacea. Các hoạt động 
kháng khuẩn của metronidazole làm thay đổi trao đổi chất của vi khuẩn acid mật  
trong đường ruột, giảm ngứa ở những bệnh nhân bị ứ mật thứ cấp đến xơ gan mật 
tiền phát.
1.1.7. Cơ chế tác dụng kháng khuẩn của Sulfamit, Metronidazole [3]

1.1.4.1. Cơ chế kháng khuẩn của SAs
­ Ức chế enzym chuyển hóa acid folic
Các sulfamit có hiệu lực điều trị tốt đều có gốc R mang dị vòng, dị vòng 2 dị 
tố  tốt hơn dị  vòng 1 dị  tố. Ví dụ: sulfamethoxazol:  ức chế  enzym dihydrofolat 
synthetase nên ngăn chặn giai đoạn chuyển acid folic thành axit hydrofolic.
­ Ngăn cản tổng hợp axít folic của vi khuẩn
Vi khuẩn tổng hợp và chuyển hoá axít folic thành nucleo protein (cần thiết 
cho mọi tế bào sống) theo sơ đồ sau:

14


Luận văn Thạc sĩ
Thái

                                                                                  Bùi Minh 

OH
N

CH2

N

NH

CO

NH

CH CH2 CH2 COOH
COOH

H2N

N

A.PAB

N

acid glutamic
+

(vitamin H )

pterin
pteoryl

Acid folic (acid pteoryl glutamic)
Acid Dihydrofolic

Dihydrofolat syntetase
(enzym)
Dihydrofolat sreductase
(enzym)

Acid Tetrahydrofolic

 

Nucleoprptein

Acid folinic

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein
Theo sơ đồ trên sự đối kháng giữa A.PAB và SAs là sự cạnh tranh vào vị trí 
của A.PAB trong thành phần phân tử axít folic trong quá trình vi khuẩn tổng hợp 
axít này. Khi nồng độ đủ  cao thì SAs sẽ chen vào vị  trí của A.PAB làm cho việc 
tổng hợp axít folic bị gián đoạn, ngưng trệ. Sự tranh chấp giữa A.PAB và SAs rõ  
ràng tuân theo quy luật khối lượng, nên cần duy trì nồng độ  có tác dụng  ở  máu  
trong suốt thời gian dùng SAs.
SAs thay được A.PAB vì chúng giống nhau về  hình dạng, kích thước và 
nhóm chức hoá học:
o

6 .7 A  

6 .9 Ao 
O

O
H2N

2 .3 Ao 

C
OH

H2N

2 .4 Ao 

S
O
NH ­ R

                                                                                          Ở ngoài mặt phẳng
 A.PAB

            Sulfamit

15


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
Như vậy những vi khuẩn không cần đến axít folic hoặc lấy được axít foclic  
có sẵn trong môi trường thì không bị  SAs tác dụng. Tế  bào của người và động 
vật lấy axít folic từ bên ngoài vào như một vitamin (axít folic là vitamin B9), nên 
không bị ảnh hưởng bởi SAs. Khi dùng SAs để chữa bệnh thì nó chỉ có tác dụng 
chọn lọc trên vi khuẩn.
H H
N

(­)
S N R
O

H H

N

H

H
N

(­)
S N R

(­)
O S O
O

O

anion sulfamit

H H
N

(­)
O S O

O

anion PAB

1.1.4.2. Cơ chế kháng khuẩn của Metronidazole
Metronidazole  tác   dụng   lên  vi   khuẩn  kỵ   khí  như  Helicobacter  pylori  và 

Gardnerella  vaginalis,  nhưng  cơ  chế  của hành động này  là  chưa được hiểu rõ. 
Tuy nhiên, hoạt động của nó chống lại vi khuẩn kỵ  khí bắt buộc xảy ra thông 
qua một quy trình bốn bước:
­   Tấn công vào vi sinh vật: Metronidazole là một hợp chất có khối lượng 
phân tử  thấp nên dễ dàng khuếch tán qua màng tế bào của vi sinh vật kỵ  khí và 
hiếu khí. 
­   Làm   suy   giảm   hoạt   hóa   bởi   sự   vận   chuyển   protein   trong   tế   bào: 
Metronidazole  làm  giảm  bởi  pyruvat  :  ferredoxin(protein   chứa   sắt  chuyển   các 
điện tử) oxidoreductaza (enzyme xúc tác phản ứng oxy hóa­ khử) trong ty thể của 
vi khuẩn kỵ khí, làm thay đổi cấu trúc hóa học của nó. 
Pyruvate: ferredoxin oxidoreductase thường tạo ra ATP qua decarboxylation 
oxy hóa  của  pyruvate.  Với  metronidazole  trong tế  bào,  nhóm  nitro  của  nó  hoạt 
động như một chỗ cất giữ điện tử, thu giữ điện tử thường được chuyển giao cho 

16


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
các ion hydro trong chu kỳ  này. Tác dụng làm suy giảm của metronidazole thúc 
đẩy hình thành các hợp chất trung gian và các gốc tự do độc hại đối với tế bào.
­ Giảm tương tác tiểu phân trung gian với tế bào ­ các tiểu phân trung gian 
độc tương tác với DNA chủ, dẫn đến vỡ sợi DNA và phá hủy chuỗi AND. 
­  Sự  phá vỡ  của  các  sản phẩm  trung gian  gây độc tế  bào  ­  các tiểu phân 
trung gian độc hại phân hủy thành sản phẩm cuối cùng không hoạt động.
1.1.8. Một số chế phẩm của Sulfamit tiêu biểu [3;6; 9]

Như ta đã biết, các SAs có cả một họ gồm hàng nghìn chất, với những tính  
chất và công dụng khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chỉ đi sâu vào bốn SAs sẽ được 
nghiên cứu trong luận văn này. 

1.1.8.1. Sulfaguanidin (SGU)
Công thức:
O

O
S
NH

H2N

HN

NH2

Tính chất: Dạng bột tinh thể màu trắng, tan rất ít trong nước, axeton, etanol  
96o; không tan trong metylen clorit (CHCl 3); không tan trong dung dịch có tính 
kiềm; tan tốt trong dung dịch các axít vô cơ  loãng... Nhiệt độ  nóng chảy 189 –  
193oC. 
SGU cũng như nhiều SAs khác có cấu trúc rất giống A.PAB ­ một chất không  
thể  thiếu cho sự  phát triển của vi khuẩn. Nên dễ  dàng thay thế  A.PAB để  kìm  
hãm quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Vì vậy SGU là một tác nhân kháng 
khuẩn mạnh, được dùng như  một loại thuốc chống các bệnh dịch tả, đái tháo 
đường, chứng phù, tăng huyết áp... 
1.1.5.2.Sulfamethoxypyridazin (SMP)
Công thức:

17


Luận văn Thạc sĩ

Thái

                                                                                  Bùi Minh 
N
O

OCH3

N

O
S
NH

H2N

Tính chất:  SMP  ở  dạng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà, dưới tác  
dụng của ánh sáng sẽ bị sẫm màu, nâu dần; có vị đắng; rất ít tan trong nước, tan  
trong kiềm và axít vô cơ  loãng. Nhiệt độ  nóng chảy của dẫn chất axetyl hoá là  
228 – 229oC.
SMP tác dụng lên vi khuẩn tương tự như sulfadiazin nhưng hấp thụ  ở ruột  
nhanh hơn, nhiều hơn và đào thải rất chậm nên đạt được nồng độ cao trong máu, 
đồng thời duy trì được nồng độ có tác dụng lâu, nên có tác dụng kéo dài. Vì vậy 
dùng liều thấp hơn, ít nguy cơ  kết tinh  ở  đường tiết niệu song cần đề  phòng 
nguy cơ  tích luỹ  gây ngộ  độc vì sự  đào thải chậm. SMP dùng để  điều trị  các  
bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, sinh mủ, viêm (hoặc giãn) phế  quản, viêm 
đường niệu đạo (bể thận, ruột thận), viêm họng, màng não tuỷ, v.v...
1.1.5.3.Sulfadoxin (SDO)
Công thức:
O

O

N

N

S
OCH3

NH
OCH 3

H2N

Tính chất:  SDO dạng bột kết tinh màu trắng, rất ít tan trong nước, ít tan  
trong etanol 96o, không tan trong ete, tan trong các dung dịch axít vô cơ  loãng và  
hydroxyt kiềm. Nhiệt độ nóng chảy 198oC. 
SDO chỉ  định các nhiễm khuẩn do tụ  cầu, lậu cầu, màng não cầu, E.coli,  
phế cầu. Dung dịch muối natri tiêm tĩnh mạch cho các trường hợp nhiễm khuẩn  
nặng, trị sốt rét. Muối Ag của SDO có tác dụng tốt lên trực khuẩn mủ xanh, chữa  
bỏng. SDO cũng có tác dụng kéo dài.

18


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
1.1.5.4. Sulfamethoxazol (SMX)
Công thức:

O
O

O

N

S

CH3

NH
H2N

Tính chất: SMX dạng bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà. Thực tế không tan  
trong nước, khó tan trong ete, hơi tan trong ethanol 96o, dễ  tan trong axeton, tan 
trong các dung dịch hydroxyt kim loại kiềm loãng. Nhiệt độ  nóng chảy là 169 ­ 
172oC. 
SMX có tính kháng khuẩn mạnh, đã được làm thuốc điều trị  sốt rét phối 
hợp với pyrimethamin, do ức chế men dihydropholat nên ngăn cản sự chuyển hóa  
axít dihydrofolic. SMX còn được dùng rộng rãi cho các bệnh nhiễm khuẩn đường  
hô hấp, tai ­ mũi ­ họng, đường tiết niệu, thận, máu, bộ  phận sinh dục, đường 
tiêu hoá, v.v...
1.2.   Phương pháp xác định
1.2.1. Một số công trình nghiên cứu xác định Sas bằng phương pháp sắc ký 
lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng 
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau,  
nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, 
hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi  

trường... đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử  dụng rộng rãi để  xác định các kháng khuẩn 
SAs trong các loại mẫu khác nhau, khá  ưu thế so với các phương pháp khác khi  
xác định dư lượng các kháng khuẩn trong mẫu thực phẩm vì có độ chính xác, độ 
nhạy và độ lặp lại cao...

19


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau  
khi rửa giải. Ngày nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này 
đã mở  rộng khả  năng phát hiện được rất nhiều loại chất bằng phương pháp 
HPLC. Đối với phân tích dư  lượng thì người ta hay sử  dụng detector khối phổ 
(MSD) nhất là tách và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.  Còn thông 
dụng người ta dùng detector UV­Vis hay detector huỳnh quang. Dùng detector 
UV­Vis   thì   xác   định   được   nhiều   loại   chất  hơn,   nhưng   detector   huỳnh   quang  
thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do các hợp chất có trong  
nền mẫu. 
Theo tiêu chuẩn ngành TCN 196: 2004 [8],  qui định phương pháp xác định 
hàm  lượng  nhóm chất  SAs  (gồm:  sulfadiazin,  sulfathiazol,  sulfamerazin,  sulfa­
methazin,sulfamethoxypiridazine,sulfacloropyridazin,sulfadoxin, sulfamethoxazone 
sulfadimethoxin   và   sulfa­chinoxalin)   trong   sản   phẩm   thủy   sản   bằng   HPLC­ 
detector huỳnh quang. Điều kiện chạy sắc ký như sau: Cột sắc ký: cột Nucleosil  
250×3mm 100­5 C18 AB. Chương trình pha động (gồm: dung dịch H3PO4 0,02M 
và hỗn hợp metanol­ axcetonitril tỷ  lệ 1:1), bắt đầu với 60 % H 3PO4 và đến 45 
phút 45 % H3PO4, tốc độ  dòng 0,6 ml/phút. Thể  tích mẫu tiêm 10 ml. Bước sóng 
kích thích 405nm, bước sóng phát xạ  495nm. Phương pháp xử  lý mẫu này cho  
hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 60­70 %, với giới hạn phát hiện nhỏ  hơn 5  

mg/kg.
Năm   2010  Cheong   và   cộng   sự[12]   đã   xác   định   dư   lượng   4   SAs  
(Sulfadiazine

 

(SDZ),Sulfamethazine(SMZ),Sulfamethoxazole(SMX)

 

và 

Sulfaquinoxaline(SQX))   trong   gan   gà   sử   dụng   phương   pháp   HPLC   pha   đảo,  
detector UV tại bước sóng 266nm. Điều kiện chạy sắc ký như  sau: cột C18 (5 
μm, 4.6 mm x 25.0 cm). Kênh A: amoni axetat nồng độ 0,01M(pH =4,6). Kênh B:  
ACN. Sử  dụng gariend pha động như  sau: ban đầu 95% A­ 5%B, sau 18phút: 
67%A ­37%B, sau 23 phút95% A­ 5%B. Tốc độ pha động 1ml/phút. Nồng độ của 

20


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
SAs được phát hiện trong mẫu từ  11 tiểu bang trên bán đảo Malaysia là 0,006­
0,062 μg/g trong nhu mô và 0,08­0.193 μg/g trong gan .
Rodrigo H.M.M. Granja, Alfredo M. Montes Niño, Fernanda   Rabone   and 
Alessandro Gonzalez Salerno[25] đã sử  dụng phương pháp HPLC –detector UV  
để  xác định sunfamit trong mật ong. Sulfonamid được trích xuất từ  mật ong với 
dichloromethane sau khi giải thể với clorua natri 30%, và làm sạch với chiết pha 
rắn trên các cột Florisil. Dung dịch chiết được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu  

năng cao với phát hiện tia cực tím. Các giới hạn phát hiện được xác định tại 3  
μg/kg, 4 mg/kg và 5 mg/kg cho sulfamethazine, sulfathiazole và sulfadimethoxine, 
tương   ứng   với   hiệu   suất   thu   hồi   61,0%   cho   sulfathiazole;   94,5%   cho  
sulfamethazine và 86,0% cho sulfadimethoxine ở mức 100μg/kg. 
Ngoài detector UV, huỳnh quang, là những detector thường dùng, nhiều công 
trình   nghiên   cứu   còn   sử   dụng   detector   khác   như   detector   diode   array   (DAD), 
detector điện hóa cho độ nhạy và độ chọn lọc cao.
 Tác giả  Ivan Pecorelli và các đồng sự  [18], sử  dụng phương pháp HPLC ­ 
DAD để  phân tích đồng thời dư  lượng 10 SAs trong mẫu bắp thịt (sulfadiazin,  
sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamono­methoxin, sulfa­
chlorpyridazin, sulfamethoxazone, sulfaquinoxalin, và sulfadimethoxin). Điều kiện 
chạy sắc ký: Cột C8 (250mm × 3mm, 5mm). Pha động là axetonitril (A) và dung 
dịch đệm   axetat pH = 4,5(B), chạy gradient: bắt đầu với 15% B, đến 22 phút  
41% B, tốc độ  pha động 0,4 ml/phút. Detector DAD đặt 270nm. Chuẩn bị  mẫu:  
Cân 10g mẫu bắp thịt đã được nghiền đồng thể  vào ống ly tâm 50ml. Thêm vào  
đó 10g Na2SO4 khan và 20ml etyl axetat lắc đều trong 15 phút. Đem ly tâm với tốc 
độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Pha hữu cơ được chuyển sang bình nón 250ml.  
Quá trình chiết như vậy được lặp lại lần hai. Kết hợp hai phần chiết lại đem cô  
cạn bằng hút chân không. Sau đó đem pha trong 40ml etyl axetat. Chiết pha rắn: 
Cột Speedisk được hoạt hoá bằng 2×3ml n­hexan và 2×4ml etyl axetat. Sau khi 
bơm mẫu vào cột được rửa bằng 5ml nước và 5ml metanol, rửa giải bằng 20ml  

21


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
hỗn hợp metanol/amoniac (tỷ  lệ  97,5/2,5 về  thể  tích). Dung dịch thu được làm 
khô trong điều kiện chân không, rồi hoà tan trong 1ml dung dịch đệm axetat pH = 
4,5 với 0,1% metanol. Lọc qua catridge 0,45 và 0,2ml trước khi bơm vào máy 

HPLC. Phương pháp này có hiệu suất thu hồi các SAs khá cao 55­92%, với giới  
hạn phát hiện 0,05 mg/kg.
W.Hela và các cộng sự [29] cũng sử dụng phương pháp HPLC ­ DAD để xác 
định đồng thời mười hai SAs (sulfadiazin, sulfathiazol, sulfapyridin, sulfamerazin,  
sulfamethizol,sulfadimidin,sulfisoxazol,sulfamethoxazone,sulfatroxazol,sulfachlorp
yrazin, sulfaphenazol và dapsone) trong mẫu bắp thịt, gan và thận của lợn, gà... 
Điều kiện chạy sắc ký: pha tĩnh được dùng là cột Phenonmenex Luna C8 (250 × 
2mm, kích thước hạt nhồi 5mm). Pha động là đệm amoniaxetat pH=4,6 (A) và 
axetonitril (B), chạy gradient bắt đầu với 5% B đến 60 phút 40% B, tốc độ  pha  
động 0,35 ml/phút. Detetor DAD đặt 260nm (đối với các SAs), và đặt 294nm (đối  
với chất nội chuẩn). Phương pháp này có giới hạn phát hiện các SAs là 1ppb.
Sắc ký lỏng (HPLC) là một phương pháp được lựa chọn cho việc xác định
các chất vô cơ và hữu cơ trong hỗn hợp khác nhau. Tuy nhiên, nhiều chất  có thể 
không được  phát hiện trong  HPLC  vì    không  chứa  các  màu,  huỳnh quang  hoặc 
nhóm khử  oxy hóa. Điều này vấn đề có thể khắc phục bằng các phản  ứng dẫn 
xuất hóa.  Một phản  ứng dẫn xuất hóa là cần thiết để  tăng độ  nhạy cảm hay 
chọn lọc và có thể  đạt được bởi một phát hiện cụ  thể, chẳng hạn như  huỳnh  
quang hoặc hấp thụ trong ánh sáng nhìn thấy, tại một bước sóng cao.  Ngày nay, 
có rất nhiều công trình nghiên cứu  ứng dụng lý thuyết này để  phát hiện và tách  
các sulfamit trong các mẫu sinh học phức tạp.
PVinas, C.Lopez Erroz, N.Campillo, M.Hernandez [22] xác định dư  lượng 
sulfamit( sulfadiazine, sulfathiazole, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine, 
sulfamethizole,sulfamethoxypyridazine,sulfachloropyridazine,sulfamonomethoxine, 
, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine) trong  thực phẩm bằng phương pháp HPLC 
với dẫn xuất hóa huỳnh quang sau cột. Chất dẫn xuất hóa được sử dụng ở đây là  

22


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 

Thái
OPA (o­phthldialdehyde)  kết hợp với β­mercaptoethanol (ME). Phát hiện huỳnh 
quang: Eex  =302nm; Eem  = 412nm. Xây dựng đường chuẩn: Pha động ban đầu: 
acetonitrile­nước   (3:97)   trong   5   phút   sau   đó   gradient   tuyến   tính   từ(3:97)   đến  
(40:60) trong 15 phút. Cuối cùng, lặp lại điều kiện ban đầu trong 1phút, giữ trong  
15phút, tốc độ 0,5ml/phút. Chất dẫn xuất hóa (0,01M OPA + 0,02M ME, hòa tan 
trong   ethanol   2%   0,7M   H3PO4)   được   thêm   bởi   bơm   nhu   động   tại   tốc   độ 
0,25ml/phút. Chúng được trộn lẫn và phản ứng trong cuộn PTFE (2,5   0,8 I.D) ở 
40oC. Đường chuẩn của sulphamethoxazole từ 0,01 ­2 µg/ml, các sulfamit còn lại 
0,02 ­2 µg/ml.
Craig   D.C.   Salisbury,  Jason   C.Sweet,   Roger   Munro[13]sử   dụng   phương 
pháp HPLC với dẫn xuất huỳnh quang trước cột để  xác định dư  lượng sulfamit  
(sulfachloropyridazine,sulfadiazine,sulfadimethoxine,sulfadoxine, sulfaquinoxaline, 
sulfaethoxypyridazine, sulfamethazine, sulfathiazole)   trong  mô lợn, gan bò, cừu 
,ngựa , thịt gà, gan cá, thức ăn chăn nuôi. Mẫu trích được bảo quản trong đệm pH 
3,0­ACN (60:40), mẫu được dẫn xuất hóa trước cột với fluorescamine.  Các chất 
dẫn xuất sulfonamide được tách bằng sắc ký lỏng sử  dụng cột C18 với pha  
động: acid phosphoric 0,02M­ACN(60,5: 39,5) và phát hiện bằng huỳnh quang  
(Eex   = 405 nm; Eem  =  495nm). Giới hạn phát hiện (LOD) cho tất cả  các sulfamit  
được 0,01 μg/g, ngoại lệ sulfaquinoxaline LOD là 0,015 μg/g.
Qiong­Hui Zou, Xiang­Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, 
Jie   Han[23]   cũng   xác   định   dư   lượng   đồng   thời  là   12  sulfamit  (sulphadiazine, 
sulphamethazine,sulphathiazole,sulphadimethoxine,sulphamerazine,sulphapyridine, 
sulphamethoxazole,suphamethizole,sulphaquinoxaline,sulphameter,sulphamonomet
hoxine,  và  sulphachloropyridazine)  trong  các mô  động vật  (gan lợn,  thịt gà, bắp 
thịt bò) bởi HPLC với detecto UV. Chất dẫn xuất hóa trước cột của các hợp chất 
sulfamit với 9­fluorenylmethyl chloroformate (FMOC­Cl) đã được đề xuất và các 
điều kiện phản ứng đã được tối ưu hóa. Các giới hạn phát hiện cho các hợp chất 
sulfamit   đã   được  cải  thiện   rất  nhiều  sau  khi  bước  dẫn  xuất  hoá.  Dư   lượng 

23


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
sulfamit trong mô động vật được chiết  bằng acetonitrile và tinh chế bằng cách 
chiết pha rắn với C18. Phương pháp này có độ  nhạy cao và lặp lại tốt và hiệu 
suất thu hồi trung bình trên 70%. Các giới hạn phát hiện cho hầu hết các sulfamit 
có thể đạt 3­5 μg/kg.
1.2.2. Một số  công trình nghiên cứu xác định Metronidazole bằng phương  
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là phương pháp mới được  ứng dụng để  xác định Metronidazole  
trong những năm gần đây. 
Năm 2005, Ticiano Gomes Nascimento và cộng sự  [26] sử  dụng HPLC –  
UV   xác   định   đồng   thời   ranitidine   và   metronidazole   trong  huyết   tương.   250ml  
huyết tương sau khi được kết tủa với percloric 60%, ly tâm, sau đó tiêm trực tiếp  
vào HPLC. Điều kiện tách: cột C18 Shimpak, pha động KH2PO4 10mM(pH=3,5) – 
ACN(90:10,v/v), phát hiện UV tại bước sóng 315nm. Phương pháp này cho độ 
chính   xác   cao   (RSD   <15%).   Hiệu   suất   thu   hồi:   ranitidine   (96,22  ±  3,52); 
metronidazole   (95,00  ±  4,50%).   Định   lượng   ranitidine   trong   huyết   tương   là 
20ng/ml, metronidazole là 40ng/ml.
Năm 2007  Naser Tavakoli[20]và cộng sự  cũng đã sử  dụng HPLC để  xác 
định đồng thời  metronidazole và amoxicillin.   Điều kiện sắc  ký: cột C18, pha  
động pH =4, phát hiện bởi detector UV tại bước sóng 254nm. Khoảng tuyến tính  
của amoxicillin 0,15­ 600(mg/ml); metronidazole 0,13 ­300mg/ml. Giới hạn phát 
hiện   của   amoxicillin   (LOD:0,05mg/ml,LOQ:0,15mg/ml);metronidazole(LOD: 
0,1mg/ml, LOQ:0,13mg/ml).
Cũng vào năm đó  Han­Wen Sun[17] đã xác định đồng thời dư  lượng 7  
nitroimidazole:metronidazolenext,ronidazole, dimetridazole, tinidazole, Ornidazole, 
secnidazole và các chất chuyển hóa chung của ronidazole và hydroxydimetridazole 

trong thịt bằng phương pháp HPLC –UV. Điều kiện tách: cột silica C18, pha  
động H2O­ ACN, detector UV phát hiện tại bước sóng 300nm. Hiệu suất thu hồi  

24


Luận văn Thạc sĩ                                                                                   Bùi Minh 
Thái
cho các mẫu thịt gà, thịt lợn, thịt xông khói 71,4­99,5%. Khoảng tuyến tính từ 0,7 
­60mg/kg.  Độ lệch chuẩn tương đối của 10 phép đo cho các mẫu thịt gà, thịt lợn  
và thịt xông khói tăng, ở nồng độ 1mg/kg : 6,2­13,9%  và 20 mg/kg : 4,0­8,7%.
Năm 2008 Hadir M. Maher và cộng sự [16] đã xác định dư lượng đồng thời 
metronidazole và spiamycin trong cá sử  dụng phương pháp HPLC –UV. Điều 
kiện   sắc   ký:   cột   tách   C18   Sep­Pak,   pha   động:   rửa   giải   gradient   0,05M   đệm 
phosphate   (pH   =2,4)­ACN,   tốc   độ   dòng   1ml/phút.   Khoảng   tuyến   tính   của 
metronidazole:   0,005­1,000mg/g,   LOD:0,002mg/g,   LOQ:0,005mg/g.   Khoảng  
tuyến tính của piamycin: 0,025 ­1,000mg/g, LOD: 0,005mg/g, LOQ: 0,025mg/g.
1.2.3.   Một   số   công   trình   nghiên   cứu   xác   định   đồng   thời   các   sulfamit   và  
metronidazole bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Từ  những tương đồng trong việc xác định SAs và MTD, rất nhiều công 
trình đã xác định được đồng thời MTD và các SAs trong các đối tượng khác nhau
Năm 2002, Richard Lindberg và cộng sự[24] đã xác định đồng thời các chất 
kháng sinh thuộc các họ  sau:  fluoroquinolones, sulfamit, trimethoprim,­β  lactam 
(penicillin   và   cephalosporines),   nitroimidazoles   và   tetracycline  trong   nước   thải 
bệnh viện. Phương pháp phân tích là HPLC – MS. Các chất phân tích có nồng độ 
thay đổi theo thời gian vì vậy 7 mẫu phân tích được lấy lúc 13h. Nồng độ  chất 
phân  tích  thay  đổi   trong   phạm   vi  sau   đây(mg/l):ciprofloxacin:3,6­101,0  (mg/l);  
metronidazole

 

0,1­90,2(mg/l);sulfamethoxazole:0,4­12,8(mg/l);ofloxacin:0,2­

7,6(mg/l); trimethoprim 0,6­7,6(mg/l);  doxycycline 0,6­6,7(mg/l).
Năm 2007,  Wang P,  Li J,  Zheng H  [31]  đã xác định đồng thời 7 sulfamit  
(sulfacetamide,sulfapyridine,sulfamerazine,sulfamethazine,sulfamater,sulfamonome
thoxine,   sulfamethoxazole)   và   metronidazole,   chloramphenicol   trong   mỹ   phẩm 
bằng sắc ký HPLC­PDA. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký Atlantis dC18 (150 mm x  
4,6 mm, 5µm). Pha động : axit formic0,1% ­ acetonitrile(20: 80, v/v) tốc độ  dòng 
chảy 1,0 ml/phút. Phát hiện bởi detector PDA tại 268 nm. Giới hạn định lượng 3 ­ 

25