Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ một tế bào bằng phương pháp nested-PCR và enzym giới hạn

Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xác định đột biến
gen smnt gây bệnh teo cơ tủy từ một tế bào
bằng phương pháp nested-pcr và enzym giới hạn
Nguyễn Thị Thanh Nga*; Nguyễn Đình Tảo*
Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Vũ Chí Dũng**
Tóm tắt
Mục tiêu: hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen SMNt từ 1 tế bào (TB), là cơ sở trong
chẩn đoán tiền làm tổ bệnh teo cơ tủy. Đối tượng và phương pháp: 4 gia đình sinh con bị bệnh
teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7, 8 gen SMNt. Lấy máu tĩnh mạch của bố, mẹ, con mỗi
gia đình, sau đó tách và lấy 1 TB bạch cầu, ly giải TB, tiến hành phản ứng nested-PCR nhân
exon 7, 8 gen SMNt, ủ sản phẩm PCR với enzym DraI và DdeI. Điện di sản phẩm cắt trên gen
agarose 3% và phân tích kết quả. Kết quả: cả 4 bệnh nhân (BN) đều mất đồng hợp exon 7, 8
gen SMNt, kết quả này phù hợp với chẩn đoán gen từ mẫu máu toàn phần. Kết luận: đã xây
dựng được quy trình xác định đột biến gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ 1 TB.
* Từ khóa: Teo cơ tủy; Gen SMN, SMA; Nested-PCR; 1 tế bào.

Completing Assays for Detecting SMNt Gene Mutation in Single Cell
using Nested-PCR and Restriction Enzyme Method
Summary
Objective: Seting up a molecular diagnostic protocol for detecting spinal muscular atrophy
(SMNt) mutation in single cell is basic to preimplantation gentic diagnosis. Subjects and
methods: This study was carried out on 4 patients and their parent. Lymphocytes of patients
and their parent were isolated from fresh blood by ficoll. Taking a lymphocyte by stereoscopic
microscope, lysised the cell, amplifying exon 7 and exon 8 of SMNt gene by using a nested
polymerase chain reaction, followed by DraI and DdeI restriction digest enzyme of the PCR
enabling the important SMNt gene to be distinguished from the centromic SMNc gene which
has no clinical phenotype to detect mutation. Electrophoresis PCR products after digesting by
restriction enzyme and analysis. Result: 4 patients showed deletion in exon 7 and exon 8 SMNt
gene. This result is similar with the gene diagnosed from fresh blood. Conclusion: We have

successfully applied the technique of nested-PCR for the gene diagnosis of spinal muscular
atrophy from single cell.
* Key words: Spinal muscular atrophy; SMN gene; Nested-PCR; Single cell.
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Nhi Trung ương
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Thanh Nga ()
Ngày nhận bài: 13/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2014
Ngày bài báo được đăng: 27/01/2015

96


Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Đặt vấn đề
Bệnh teo cơ tủy (Spinal Muscular
Atrophy - SMA) là bệnh thần kinh cơ đặc
trưng do các TB sừng trước tuỷ sống
thoái hoá tuần tiến, dẫn đến yếu cơ đối
xứng gốc chi, trương lực cơ và phản xạ
gân xương bị giảm hoặc mất. Tỷ lệ bệnh
SMA chung trên toàn thế giới là 1/10.000
trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen bệnh
dao động từ 1/40 - 1/60 [4, 5, 7]. Nguyên
nhân gây bệnh SMA là do đột biến gen
SMNt (survival monitor neurone) trên
nhiễm sắc thể số 5. Gen SMN bao gồm 9
exon mã hoá cho phân tử protein SMN
dài 294 axít amin. Gen SMN có hai bản
sao giống nhau là gen SMNt (SMN1) và
gen SMNc (SMN2). Trong đó, chỉ khi gen

SMNt bị đột biến mới gây bệnh SMA. Hai
gen này chỉ khác nhau ở 5 cặp base: một
cặp ở intron 6, một cặp ở exon 7, hai cặp
ở intron 7 và một cặp ở exon 8, nên khi
nhân gen SMNt sẽ nhân luôn cả gen
SMNc. Vì vậy, sự khác nhau ở exon 7 và
exon 8 được sử dụng để phân biệt gen
SMNt với SMNc trong chẩn đoán SMA
[10]. Khoảng 95% BN SMA bị đột biến
mất đồng hợp exon 7, 8 gen SMNt, còn
5% BN SMA bị đột biến điểm gen SMNt.
Vì vậy, để chẩn đoán gen bệnh SMA,
thường phân tích sự có mặt hay không có
mặt exon 7, 8 gen SMNt [1, 5, 6, 8, 10].
Mỗi trẻ em mắc bệnh SMA ra đời là
gánh nặng cho gia đình về tâm lý và tài
chính, đồng thời cũng là gánh nặng cho
toàn xã hội. Do đó, việc chẩn đoán di
truyền trước chuyển phôi (preimplantation
genetic diagnosis - PGD) bệnh SMA với
gia đình tiền sử có người mắc bệnh SMA
nhằm chọn ra những phôi lành để cấy
chuyển vào tử cung mẹ, từ đó sinh ra
những em bé khỏe mạnh là cần thiết và
có ý nghĩa quan trọng [2, 3].

98

Chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm:
Hoàn thiện quy trình xác định đột biến

gen SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ 1 TB
bạch cầu, tách từ máu ngoại vi của các
gia đình BN.
Đối tượng và phương pháp nghiên
cứu
1. Đối tượng nghiên cứu.
Chọn 4 gia đình có con độ tuổi từ 0 - 18
đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi
Trung ương, đã được chẩn đoán bị bệnh
teo cơ tủy do mất đồng hợp tử exon 7
gen SMNt.
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Tách và hút bạch cầu từ mẫu máu
ngoại vi:
- Tách TB bạch cầu từ máu toàn phần
theo protocol Ficoll - paque. Sau đó, tiến
hành hút TB bạch cầu từ mẫu bạch cầu
đã tách theo các bước sau:
+ Bước 1: hút 5 giọt dung dịch PBS1X
(20 μl) đặt lần lượt lên một lam kính đã
rửa sạch, đánh số thứ tự 1 - 5.
+ Bước 2: dùng pipet 10 μl hút 5 μl
dung dịch bạch cầu đã tách trộn đều vào
giọt PBS1X 1, vừa trộn vừa quan sát trên
kính hiển vi.
+ Bước 3: hút 5 μl dung dịch ở giọt
PBS1X 1 dưới kính sao cho hút được các
TB, trộn đều vào giọt PBS1X 2.
+ Bước 4: tiếp tục tới giọt 5. Ở giọt 5 ta
được mật độ lympho thưa (2 - 3 TB bạch

cầu/vi trường vật kính 32X).
+ Bước 5: hút 2 μl dịch có chứa 1 TB
nhỏ vào ống 0,2 ml để chuẩn bị thực hiện
bước ly giải TB luôn hoặc bảo quản ở -200C.
- Ly giải TB:


Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Tiến hành ly giải TB vừa hút bằng 5 μl
KOH 0,2 M, ủ 65o trong 10 phút, trung
hòa KOH bằng 5 μl tricine 0,2 M.
2. Tiến hành phản ứng PCR nhân
exon 7, exon 8 gen SMNt trực tiếp từ
mẫu 1 TB đã bị ly giải.
- Phản ứng PCR:
Khuếch đại exon 7, exon 8 của gen
SMNt bằng kỹ thuật nested-PCR dùng hai
cặp mồi đặc hiệu exon 7, exon 8 gen
SMNt (mồi được thiết kế theo Lefebvre và
CS, 1995 và van der Steege và CS, 1995):
+ Trình tự mồi exon 7 gen SMN vòng 1:
F1 5’-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3’
R15’-CTTTCCTTCTTTTTGATTTTGTTT-3’

+ Trình tự mồi exon 8 gen SMN vòng 1:
F 15’-GTAATAACCAAATGCAATGTGAA-3’
R1 5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’

+ Thành phần phản ứng PCR vòng 1
chung cho cả exon 7 và 8:

Master mix: 12,5 µl; primers (10 pmol/µl):
0,5 µl; nước loại ion: 7 µl; mẫu: 5 µl. Tổng
thể tích phản ứng 25 µl.
+ Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 960C
trong 5 phút, [940C trong 1 phút, 560C
trong 1 phút, 720C trong 1 phút] x 25 chu
kỳ, 720C trong 10 phút.
- Lấy sản phẩm PCR của vòng 1 làm
mẫu cho phản ứng PCR vòng 2:
+ Trình tự mồi exon 7 gen SMN vòng 2:
F1 5’-AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA-3’
R2 5’-CTTCTTTTTGATTTTGTTT-3’

+ Trình tự mồi exon 8 gen SMN vòng 2:
F2 5’-AACCAAATGCAATGTGAAATA-3’
R1 5’-CTACAACACCCTTCTCACAG-3’

+ Thành phần phản ứng PCR vòng 2
chung cho cả exon 7, 8 gen SMNt.
Master mix: 12,5 µl; primers (10 pmol/µl):
0,5 µl; nước loại ion: 7 µl; mẫu: 5 µl. Tổng
thể tích phản ứng 25 µl.

99

+ Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 960C
trong 5 phút, [940C trong 1 phút, 540C trong
30 giây, 720C trong 1 phút] x 35 chu kỳ,
720C trong 10 phút.
+ Kích thước sản phẩm PCR:

Sau khi nhân qua 2 vòng PCR, sản
phẩm PCR của mồi exon 7 gen SMNt
(nhân cả exon 7 SMNt và exon 7 SMNc)
có kích thước 188 bp, sản phẩm PCR của
mồi exon 8 gen SMNt (nhân cả exon 8
SMNt và exon 8 SMNc) có kích thước
190 bp.
- Ủ enzym cắt giới hạn:
Sau khi nhân gen xong, tiến hành ủ
enzym giới hạn. Trong nghiên cứu, chúng
tôi dùng 2 loại enzym cắt giới hạn DraI và
DdeI (Hãng Thermo Sciencetific) để phân
biệt exon 7 gen SMNt với exon 7 gen SMNc,
phân biệt exon 8 gen SMNt với exon 8
gen SMNc:
+ Enzym DraI có vị trí cắt:
5’…TTT AAA…3’
3’…AAA TTT…5’
+ Enzym Dde I có vị trí cắt:
5’…C TNAG…3’
3’…GANT C…5’
- Sản phẩm PCR được ủ với enzym giới
hạn DraI và DdeI từ 2 - 3 giờ. Điện di kiểm
tra sản phẩm PCR trên gel agarose 3%.
- Sản phẩm PCR sau khi ủ với enzym
DraI: exon 7 gen SMNt không bị enzym
cắt nên còn nguyên với kích thước 188
bp, exon 7 gen SMNc bị enzym DraI cắt
thành 2 băng có kích thước tương ứng
164 bp và 24 bp.

- Sản phẩm PCR sau khi ủ với enzym
DdeI: exon 8 gen SMNt không bị enzym


Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
cắt nên vẫn còn nguyên kích thước 190
bp, exon 8 gen SMNc bị enzym cắt thành
2 băng có kích thước tương ứng 120 bp
và 70 bp.

có khoảng 2 - 3 TB bạch cầu thì tiến hành
hút 1 TB bạch cầu.

Kết quả nghiên cứu và bàn luận
1. Kết quả bước tách và hút bạch
cầu.
- Kết quả tách bạch cầu:
Sau khi tách bạch cầu bằng phương
pháp Ficoll-Paque, tiến hành hút bạch
cầu. Để đánh giá hiệu quả tách và hút
bạch cầu, nhỏ trực tiếp xanh methylen
vào giọt dịch chứa TB bạch cầu và soi
trên kính hiển vi.

Hình 1: Giọt dịch sau khi tách được bạch
cầu từ mẫu máu ngoại vi ở vật kính 10X.
Trên hình cho thấy, ở vi trường vật
kính 10X có rất nhiều TB bạch cầu, nên
có thể khẳng định chúng tôi đã tách được
bạch cầu bằng phương pháp Ficoll-paque.

- Hút 1 TB bạch cầu:
Pha loãng giọt dịch chứa bạch cầu gốc
theo các bước đã nêu, đến giọt PBS1X
thứ 5, kiểm tra dưới kính hiển vi 32X thấy

100

Hình 2: Giọt dịch bạch cầu pha loãng với
PBS1X giọt 5 ở vi trường 32X.
Đồng thời, để đánh giá hiệu quả hút
TB bạch cầu, tiến hành theo đúng các
bước rồi nhỏ lên lam kính làm 100 tiêu
bản, sau đó nhuộm giemsa 16%.

Hình 3: Tiêu bản nhuộm giemsa để đánh
giá kỹ thuật hút 1 TB bạch cầu.
Bảng 1: Bảng kết quả hút 1 TB bạch cầu.
Lo¹i TB

Sè l-îng tiªu b¶n

Tû lÖ

Tiêu bản có 1 TB

75

75%

Tiêu bản có 2 - 3 TB

20

20%

Tiêu bản không có TB

5

5%

100

100%

Tổng


Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Kết quả hút 1 bạch cầu khá cao, đủ đảm
bảo để hoàn thiện quy trình phát hiện đột
biến gen gây bệnh teo cơ tủy trên 1 TB
bạch cầu.
2. Kết quả nhân exon 7, 8 gen SMN
từ 1 TB bạch cầu.
Mỗi mẫu máu, chúng tôi hút 5 nhóm
1 TB bạch cầu cho vào 5 ống 0,2 ml khác
nhau, sau đó tiến hành ly giải TB rồi nhân
exon 7, 8 gen SMNt.

Hình 4: Kết quả điện di trên gel agarose
3% sản phẩm PCR sau khi ủ với enzym
giới hạn của gia đình BN C3.
B3 và M3 đều có 2 băng tương ứng
188 bp và 164 bp, nghĩa là cả B3 và M3
đều có exon 7 SMNt (không bị cắt nên
còn nguyên kích thước 188 bp), exon 7
SMNc bị cắt thành 2 mảnh (164 bp và 24
bp). Trong khi đó, con C3 chỉ có 1 băng
tương ứng 164 bp, nghĩa là con C3 bị mất
đồng hợp exon 7 SMNt, chỉ có exon 7

SMNc nên bị enzym giới hạn cắt thành 2
băng (164 bp, 24 bp). Như vậy, BN C3
mất đồng hợp exon 7 và 8 gen SMNt. Kết
quả này phù hợp với kết luận chẩn đoán
gen của Bệnh viện Nhi Trung ương.
Chúng tôi đã thành công trong việc
nhân exon 7, 8 gen SMNt từ một TB bạch
cầu và trong bước ủ enzym giới hạn.

Hình 5: Kết quả điện di trên gel agarose
3% sản phẩm PCR sau khi ủ với enzym
giới hạn của gia đình BN C7.
Cả bố B7 và mẹ M7 của BN C7 đều có
exon 7 gen SMNt nên khi ủ sản phẩm
PCR với enzym giới hạn DraI có 2 băng
(188 bp của exon 7 SMNt và 164 bp của
exon 7 SMNc), tương tự đối với exon 8
của gen SMNt. Như vậy, BN C7 cũng mất

đồng hợp exon 7 và exon 8 của gen
SMNt và cũng phù hợp với kết quả chẩn
đoán gen của Bệnh viện Nhi Trung ương.

Tiến hành nghiên cứu trên các gia đình
BN khác, chúng tôi thu được kết quả:
Bảng 2: Kết quả phát hiện đột biến gen SMNt trên 1 TB bạch cầu của 4 gia đình có
con mắc bệnh SMA.
TT

101

BN

Gen SMNt

Bè bn

Gen SMNt

mẹ bn

Gen SMNt


Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015
Exon 7

Exon 8

Exon 7

Exon 8

Exon 7

Exon 8

1

SMAC1

-

-

SMAB1

+

+

SMAM1

+

+

2

SMAC2

-

-

SMAB2

+

+

SMAM2

+

+

3

SMAC3

-

-

SMAB3

+

+

SMAM3

+

+

4

SMAC7

-

-

SMAB7

+

+

SMAM7

+

+

Cả 4 BN teo cơ tủy trong nghiên cứu đều mất đồng hợp exon 7 SMNt, đặc điểm này
phù hợp với kết quả chẩn đoán gen SMNt từ mẫu máu toàn phần của Bệnh viện Nhi

Trung ương cũng như của nhiều tác giả khác [6, 7, 8].
Đồng thời, tất cả bố, mẹ của những BN trên đều có mặt của exon 7, 8 SMNt và thực tế,
các cặp bố mẹ đều là người không biểu hiện bệnh teo cơ tủy. Nghĩa là, chỉ cần có 1 nhiễm
sắc thể trong cặp tương đồng số 5 có gen SMNt bình thường (dạng dị hợp) cũng dịch
mã đủ lượng protein SMN cho TB thần kinh vận động hoạt động bình thường.
Kết luận và kiến nghị

Từ những kết quả trên, có thể
khẳng định bước đầu đó thành
cụng trong việc hoàn thiện được
quy trỡnh xỏc định đột biến gen
SMNt gây bệnh teo cơ tủy từ 1
TB.
Tài liệu tham khảo
1. Burglen L, Lefebvre S, Clermont O et al.
Structure and organization of the human survival
motor neurone (SMN) gene. Genomics. 1996, 32,
pp.497-482.
2. Dreesen JC, Bras M, Die- Smulders C et al.
Preimplantation genetic diagnosis of spinal
muscular atrophy. Mol Hum Reprod. 1998, 4 (9),
pp.881-885.
3. Graeme Daniels, Rachel Pettigrew, Alan
Thornhill et al. Six unaffected livebirths following
preimplatation diagnosis for spinal muscular
atrophy. Mol Hum Reprod. 2001, 7 (10),
pp.995-1000.
4. Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S et al.
Identification and characterization of a spinal
muscular atrophy-determining gene. Cell.

102

1995, 80, pp.155-165.
5. Meiki J, Abdelhak S, Sheth P et al.
Gene for chronic proximal spinal muscular
atrophies maps to chromosome 5q. Nature.
1990, 344, pp.767-768.
6. Meiki J, Abdelhak S, Sheth P et al. De
Novo and inherited deletions of the 5q13
region in spinal muscular atrophies. Science.
1994, 264, pp.1474-1477.
7. Pearn J. Classification of spinal muscular
atrophies. Lancet. 1980, 1, pp.919-922.
8. Rodrigues NR, Owen N, Talbot K,
Ignatius J, Dubowitz V, Davies KE. Deletions
in the survival motor neurone gene on 5q13 in
autosomal recessive spinal muscular atrophy.
Hum Mol Genet. 1995, 4, pp.631-634.
9. Taylor JE, Thomas NH, Lewis CM et al.
Correlation of SMNt and SMNc gene copy
number with age of onset and survival in
spinal muscular atrophy. Eur J Hum Genet.
1998, 6, pp.467-474.
10. Wirth B. An update of the mutation spectrum
of the survival motor neurone gene (SMN1) in
autosomal recessive spinal muscular atrophy
(SMA). Hum Mutat. 2000, 15, pp.228-237.

Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015

102