Xây dựng quy trình định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TESTOSTERON TRONG
LỘC NHUNG (Cornu cervi parvum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Đức Học*; Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương*
Lê Minh Hoàng**; Trịnh Thanh Hùng***; Võ Quang Hợp*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi
parvum) bằng HPLC. Đối tượng và phương pháp: mẫu Lộc nhung do Công ty Dược liệu Sơn
Lâm cung cấp, thu mua tại Hương Sơn, Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV. Xây
dựng và thẩm định phương pháp định lượng theo hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam. Kết
quả: xác định được điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV
đo ở 254 nm, dung môi pha động là ACN:H2O chạy theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,8
0
ml/phút, nhiệt độ cột 30 C. Phương pháp đã được thẩm định, bảo đảm các yêu cầu của
phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn
định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được
phương pháp định lượng testosteron trong Lộc nhung bằng phương pháp HPLC, áp dụng quy
trình trên để định lượng một số mẫu Lộc nhung trên thị trường.
* Từ khóa: Lộc nhung (Cornu cervi parvum); Testosteron; HPLC.

Determination of Testosterone from Deer Velvet (Cornu cervi parvum)
using HPLC
Summary
Objectives: Establishment and validation of testosterone from deer velvet (Cornu cervi parvum)
using HPLC. Materials and methods: Deer velvet was supported by Sonlam company that was
th
harvested from Hatinh province, passed requirement of Vietnamese Pharmacopoeia, Ed. 4 .
The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline.
Results: The quantification method of testosterone from deer velvet was established and

validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ. Conclusions:
The quantification method of testosterone from deer velvet was validated fully in accordance
with ICH and Vietnam Ministry of Health.
* Key words: Cornu cervi parvum; Testosterone; HPLC.
* Học viện Quân y
** Đại học Y Dược Cần Thơ
*** Bộ Khoa học và Công nghệ
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương ()
Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/08/2016
Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016

86


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lộc nhung (Cornu cervi parvum) là vị
thuốc quý, được lấy từ sừng non của hươu
hoặc nai đực. Lộc nhung có tác dụng
tăng cường sinh lực, giảm mệt mỏi, giúp
vết thương mau lành, lợi tiểu, tăng nhu
động ruột và dạ dày, giúp chuyển hóa tốt
protid và gluxit [2]. Đặc biệt, Lộc nhung
còn có tác dụng tốt cho nam giới, giúp
sinh tinh, bổ huyết, chữa liệt dương, hoạt
tinh, mạnh gân cốt, dùng cho mọi trường
hợp hư tổn cơ thể [2, 3]. Trong Lộc nhung
chứa nhiều thành phần tốt cho sức khoẻ
như: các khoáng chất và yếu tố vi lượng,
các axit amin và nội tiết tố (testosteron,

estron, cortison…) [2, 3]. Trong đó, testosteron
có tác dụng tăng cường khả năng sinh
tinh, chữa liệt dương... [2, 3]. Tuy nhiên,
hoạt chất này trong Lộc nhung vẫn chưa
được quan tâm và nghiên cứu nhiều về
phương pháp định lượng. Dược điển Việt
Nam IV đã có chuyên luận riêng, nhưng
các chỉ tiêu chất lượng chỉ dừng lại ở
mức định tính [1]. Vì vậy, chúng tôi thực
hiện nghiên cứu này nhằm: Cung cấp cơ
sở khoa học để đánh giá chất lượng Lộc
nhung thông qua việc định lượng testosteron
bằng HPLC.
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị.
- Lộc nhung thu mua tại Hương Sơn,
Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt
Nam IV (do Công ty Dược liệu Sơn Lâm,
Hà Nội cung cấp); một số mẫu Lộc nhung
khác thu mua trong khu vực Hà Nội.

- Chất chuẩn testosteron (99,5%, Lot.
3580002, SERVA Electrophoresis, Đức).
- Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt
tiêu chuẩn phân tích.
2. Phương pháp nghiên cứu.
Định lượng testosteron trong Lộc nhung
bằng phương pháp HPLC. Thẩm định
phương pháp thực hiện theo chỉ dẫn của

ICH và Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc
hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính
xác, giới hạn định lượng và giới hạn phát
hiện [1, 4].
- Mẫu chuẩn: chuẩn làm việc có nồng
độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml.
- Mẫu thử: khảo sát các phương pháp
xử lý mẫu khác nhau:
+ Phương pháp 1 (không qua cột chiết
pha rắn): cân chính xác 10,0 g bột Lộc
nhung đã được nghiền nhỏ và rây qua rây
355/180 (bột nửa mịn) vào bình nón có
nút mài, chiết siêu âm bằng EtOH 90%
trong 2 giờ ở 600C (40 ml x 2 lần). Ly tâm
(5.000 vòng/phút × 5 phút) lấy dịch chiết.
Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức
100 ml, bổ sung vừa đủ thể tích. Hút
chính xác 20 ml dịch chiết cho vào bình
cô quay chân không đến cắn. Hòa tan
cắn bằng 1,0 ml MeOH. Lấy 100 µl dịch ở
trên, tủa protein bằng 10 µl axít percloric
50%. Sau đó, trung hòa axít bằng 10 µl
NaOH 0,3 M. Ly tâm dịch ở tốc độ 12.000
vòng/phút x 10 phút, thu được dịch trong
dùng để phân tích HPLC.
+ Phương pháp 2 (sử dụng cột chiết
pha rắn SPE-C18): tiến hành tương tự
như phương pháp 1 đến bước cô quay
chân không. Hòa tan cắn bằng 2 ml
MeOH 25%, chuyển vào cột chiết pha rắn

87


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016
SPE đã được hoạt hóa trước (5 ml MeOH
25% × 2 lần, 5 ml nước cất). Rửa loại tạp
chất bằng 5 ml nước cất x 2 lần. Rửa giải
bằng 2 ml MeOH. Tất cả các bước loại
tạp và rửa giải trên được thực hiện với
tốc độ 30 - 45 giọt/phút. Đem dịch rửa giải
cô dưới áp suất giảm ở 600C tới cắn, hòa
tan cắn trong 200 µl MeOH. Ly tâm ở tốc
độ 12.000 vòng/phút thu được dịch trong
dùng để phân tích HPLC.

- Mẫu trắng: mẫu MeOH được thực
hiện đầy đủ theo các bước như phương
pháp 1.
- Điều kiện sắc ký: cột Sunfire C18
(250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV đo ở
254 nm, dung môi pha động là ACN:H2O
chạy theo chương trình gradient hoặc
đẳng dòng, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt
độ cột 300C. Thể tích bơm mẫu 10 µl.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Lựa chọn điều kiện sắc ký.
Khảo sát với hai điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),
detector UV đo ở bước sóng 254 nm, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C.
Trong đó dung môi pha động sử dụng ACN (A):H2O (B) với 2 điều kiện khác nhau.

Điều kiện (1) chạy đẳng dòng với tỷ lệ 47:53; điều kiện (2) chạy theo chương trình
gradient 0 → 20 phút, 30% A → 60% A; 20 → 30 phút, 60% A.
0.040

(a)
10.770

AU

0.030

0.020

0.010

0.000
3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

19.00

20.00

19.00

20.00

18.214

Minutes

0.040

AU

0.030

(b)

0.020

0.010

0.000
3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00
Minutes

(c)

18.323

AU

0.04

0.02

0.00
3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

19.00

20.00

Minutes

Hình 1: Sắc ký đồ testosteron chuẩn ở điều kiện 1 (a),
điều kiện 2 (b) và mẫu Lộc nhung ở điều kiện 2 (c).
Từ hình ảnh sắc ký đồ của testosteron ở 2 điều kiện trên cho thấy: ở điều kiện 1,
thời gian lưu của testosteron khoảng 10,77 phút, nhưng píc gioãng, không cân đối.
Ở điều kiện 2, thời gian lưu của testosteron khoảng 18,3 phút với píc cân đối và khả
năng phân tách tốt.
88


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
Để kiểm tra điều kiện sắc ký có phù
hợp với phân tích mẫu thử, tiến hành
chạy sắc ký với mẫu thử Lộc nhung (có
sử dụng cột chiết SPE) theo điều kiện 2.
Kết quả phân tích cho thấy: píc của
testosteron trong mẫu thử cân đối, sắc
nét, thời gian lưu tương ứng với thời gian
lưu của píc testosteron chuẩn và tách
khỏi píc tạp.
Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn
được điều kiện sắc ký HPLC cho phân
tích định lượng testosteron trong Lộc nhung
như sau:
- Cột sắc ký: Sunfire RP-C18 (250 x
4,6 mm; 5 µm, 100A0).

- Detetor UV đo ở bước sóng 254 nm.
- Pha động: ACN:nước cất chạy theo
chương trình gradient.
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.
- Nhiệt độ cột: 300C.
2. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu.
Tiến hành xử lý mẫu theo 2 phương
pháp: sử dụng và không sử dụng cột chiết
pha rắn như nêu ở phương pháp nghiên
cứu. Phân tích sắc ký theo điều kiện đã
lựa chọn được trình bày ở mục 1. Sắc ký
đồ của mẫu thử được xử lý theo 2 phương
pháp được trình bày trong hình 2.

0.050

0.040

AU

0.030

(a)

18.478

0.020

0.010

0.000
0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

Minutes

0.050

0.040

0.020

(b)

18.489

AU

0.030

0.010

0.000
0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00
Minutes

Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu thử được xử lý theo phương pháp 1 (a) và
phương pháp 2 (b).
Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy: khi không sử dụng cột chiết pha rắn, mẫu còn
nhiều tạp chất, píc testosteron tách không hoàn toàn ra khỏi píc tạp. Trong khi đó,

ở mẫu sử dụng cột chiết pha rắn, tạp chất giảm nhiều, píc của testosteron tách rõ
ràng ra khỏi píc tạp, ít làm bẩn cột phân tích, góp phần kéo dài tuổi thọ cột. Từ kết
quả này, chúng tôi lựa chọn phương pháp xử lý mẫu có sử dụng cột chiết pha rắn
SPE-C18.
89


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016
3. Thẩm định phương pháp phân tích.
* Tính tương thích hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu:
Tiến hành phân tích 5 lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ 5,77 µg/ml theo điều kiện
sắc ký đã lựa chọn. Kết quả cho thấy: thời gian lưu và diện tích píc thu được lần lượt
là 18,32 ± 0,03 phút ( ± SD, RSD = 0,16%) và 326.883 ± 5.289 µAU x s ( ± SD,
RSD = 1,62%). Cả thời gian lưu và diện tích píc đều có giá trị RSD < 2%. Đồng thời,
số đĩa lý thuyết là 7.429 và hệ số bất đối xứng là 1,06. Kết quả phân tích sắc ký đồ của
mẫu trắng, mẫu testosteron chuẩn và mẫu Lộc nhung được ghi ở hình 3, cho thấy
phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký.
0.020
0.018
0.016
0.014
0.012

A
U

0.010
0.008
0.006

(a)

0.004
0.002
0.000
-0.002
-0.004
6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00
Minutes

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

0.020
0.018

18.260

0.016
0.014

AU

0.012
0.010
0.008
0.006

(b)

0.004
0.002
0.000
6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

Minutes

0.020
0.018

18.323

0.016
0.014

AU

0.012
0.010

(c)

0.008
0.006
0.004
0.002
0.000
6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00

26.00

28.00

30.00

Minutes

Hình 3: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), testosteron chuẩn (b) và mẫu thử Lộc nhung (c).
Kết quả phân tích mẫu trắng, mẫu
testosteron chuẩn và mẫu thử Lộc nhung
trong cùng điều kiện cho thấy: tại thời
điểm xuất hiện píc testosteron trên sắc ký
đồ của dung dịch chuẩn, không thấy xuất
hiện píc trên dung dịch mẫu trắng. Đồng
thời, tại thời điểm này xuất hiện đáp ứng
píc tương ứng trên dung dịch mẫu thử
dịch chiết Lộc nhung. Píc cân đối, sắc nét
và tách hoàn toàn ra khỏi các píc tạp, hệ
số bất đối xứng gần bằng 1. Như vậy,
phương pháp này đảm bảo tính chọn lọc đặc hiệu.
90

* Khoảng tuyến tính:
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn testosteron
có nồng độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml trong
MeOH 70%. Phân tích sắc ký theo điều
kiện đã lựa chọn. Đánh giá mối tương quan

giữa diện tích píc và nồng độ testosteron.
Kết quả cho thấy (bảng 1, hình 4): đường
hồi quy thu được là đường thẳng với hệ
số tương quan R2 xấp xỉ bằng 1 (0,9999).
Hệ số ∆i ở tất cả các nồng độ trong
đường chuẩn đều < 15%. Như vậy, có mối
tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện
tích píc và nồng độ testosteron trong khoảng
nồng độ khảo sát.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
Bảng 1: Kết quả xây dựng đường chuẩn của testosteron.
Thứ tự

Nồng độ testosteron (µg/ml)

Diện tích píc (µAU x s)

Hệ số ∆i (%)

1

0,72

39.700

5,71

2

1,44

80.821

2,94

3

2,88

158.658

2,43

4

5,77

326.494

1,20

5

11,54

683.920

2,75

6

23,08

1.316.783

1,40

7

57,71

3.350.496

0,13

2

Diện tích píc (µV x s)

Y = aX + b

Y = 58.060 X - 4.491,9; R = 0,9999

4000000
3500000
3000000
2500000
2000000

1500000
1000000
500000
0

y = 58.060 x - 4.491,9
R² = 0,9999

0

10

20

30

40

50

60

70

Nồng độ (µg/ml)

Hình 4: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ testosteron.
* Độ lặp lại và độ đúng:
Chiết 6 mẫu thử Lộc nhung có khối lượng như nhau và phân tích sắc ký theo điều
kiện đã lựa chọn. Diện tích píc thu được là 54.815,60 ± 1.032,18 ( ± SD, n = 6) với

giá trị RSD = 1,88% < 2%. Điều này chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại cao.
Bảng 2: Kết quả xác định lặp lại của phương pháp.
Mẫu

Khối lượng mẫu (g)

Diện tích píc (µV × s)

1

10,0250

53.587

2

10,0014

54.675

3

10,0217

55.465

91


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016

4

10,0034

54.673

5

10,0462

55.678

6

10,0053

56.586
54.815,60

SD

1.032,18

RSD (%)

1,88

Độ đúng được thực hiện bằng phương pháp thêm chuẩn ở 3 mức 0,1440 µg,
0,2885 µg và 0,5770 µg/mẫu. Thêm các lượng chuẩn này vào mẫu thử Lộc nhung đã
biết hàm lượng testosteron và chiết mẫu theo quy trình đã lựa chọn. Từ diện tích píc

thu được, ngoại suy lượng testosteron thêm vào ban đầu.
Bảng 3. Tỷ lệ thu hồi testosteron trong mẫu thử.
Lượng thêm vào (µg)

0,1440 µg

0,2885 µg

0,5770 µg

Lượng tìm thấy (µg)

Tỷ lệ thu hồi (%)

0,1267

87,93

0,1240

86,11

0,1309

90,90

0,2684

93,10

0,2635

91,33

0,2703

93,69

0,5581

96,74

0,5493

95,20

0,5529

95,82

± SD

88,31 ± 2,41%

92,71 ± 1,23%

95,92 ± 0,77%

Với 3 mức thêm chuẩn, độ thu hồi đều đạt từ 88,31 - 95,92%. Như vậy, phương pháp
phân tích này đáp ứng yêu cầu độ đúng để phân tích testosteron trong Lộc nhung.

* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lượng (LOQ):
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác
định LOD và LOQ của phương pháp định
lượng dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu
trắng và độ dốc đường tuyến tính có giá
trị bằng k x SD/σ. Trong đó, k = 3,3 với
LOD và = 10 đối với LOQ; SD là độ lệch
chuẩn mẫu trắng và σ là độ dốc đường
tuyến tính.
92

Phân tích 3 mẫu trắng liên tiếp để xác
định độ nhiễu đường nền của mẫu trắng
tại thời điểm xuất hiện píc tương ứng
trên mẫu testosteron chuẩn theo điều
kiện sắc ký đã lựa chọn. Xác định SD
của mẫu trắng. Chúng tôi tính toán được
giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
testosteron trong Lộc nhung theo phương
pháp này lần lượt là 4,68 x 10-3 µg/ml và
14,19 x 10-3 µg/ml.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
4. Áp dụng để xác định hàm lượng
testosteron ở một số mẫu Lộc nhung
trên thị trường.
Chúng tôi sử dụng phương pháp đã xây
dựng để xác định hàm lượng testosteron

trong Lộc nhung thu mua trên thị trường.
Kết quả cho thấy hàm lượng testosteron
dao động từ 0,0990 - 0,1084 µg/g trong
các mẫu thử.
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được quy trình định lượng
testosterone trong Lộc nhung bằng phương
pháp HPLC với điều kiện sắc ký gồm:
cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),
detector UV đo ở 254 nm, dung môi pha
động là ACN:H2O chạy theo chương trình
gradient (0 → 20 phút, 30% ACN → 60%
ACN; 20 → 30 phút, 60% ACN), tốc độ
dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 30 0 C.
Phương pháp đã được thẩm định, bảo
đảm các yêu cầu của một phương pháp
phân tích định lượng theo hướng dẫn của

ICH và quy định của Bộ Y tế Việt Nam.
Phương pháp đảm bảo tính tương thích
hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu, có mối tương
quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích
píc và nồng độ testosteron trong khoảng
0,72 - 57,71 µg/ml, độ đúng cao (88,31 95,92%) và lặp lại (RSD < 2%); giới hạn
phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng
(LOQ) lần lượt là 4,68 x 10 -3 µg/ml và
14,19 x 10-3 µg/ml. Phương pháp trên đã
được sử dụng để phân tích một số mẫu
Lộc nhung trên thị trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. Nhà xuất
bản Hà Nội. Hà Nội. 2009.
2. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2004,
tr.937-940.
3. Phạm Thanh Kỳ. Dược liệu học, tập II.
Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2007, tr.285-288.
4. ICH. Validation of analytical procedures:
text and methodology. Q2R1. 2005.

93