Đánh giá chất lượng và cơ chế tác dụng của globulin miễn dịch đặc hiệu nguồn gốc từ trứng gà kháng độc tố tả (cholera toxin)

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA
GLOBULIN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU NGUỒN GỐC TỪ
TRỨNG GÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ (CHOLERA TOXIN)
Hoàng Trung Kiên*; Nguyễn Đặng Dũng*
TÓM TẮT
Theo một số nghiên cứu gần đây trên động vật thực nghiệm, kháng thể kháng độc tố tả (ĐTT)
(cholera toxin) hoặc kháng tiểu phần B của ĐTT (CT-B subunit) có thể được sử dụng như là một
biện pháp tạo miễn dịch thụ động đặc hiệu nhằm điều trị và/hoặc dự phòng trường hợp nhiễm vi
khuẩn (VK) tả đường tiêu hóa. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát chất lượng và có chế tác
dụng của kháng thể IgY kháng ĐTT được phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng
nguyên ĐTT. Kết quả cho thấy kháng thể IgY kháng độc tố VK tả phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây
miễn dịch thể hiện hoạt tính đặc hiệu với độc tố VK tả trên in vitro, ngăn không cho độc tố gắn vào
thụ thể GM1.
* Từ khóa: Độc tố tả; Kháng thể IgY.

Study on quality and mechanism of action of yolk
immunoglobulin (IgY) specific to cholera toxin
Summary
Recently, several papers revealed that antibodies against cholera toxin (CT) or CT-B subunit
showed protective effect when used as preventive or therapeutic method on animal models orally
infected with V.cholerae. In the present study, we investigated the purity and tested the reactivity
of IgY isolated from eggs laid of previously immunized hens. The results showed that the IgY
preparation isolated from eggs laid of immunized hens was relatively pure and could inhibit binding of
CTB with GM1 in vitro.
* Key words: Cholera toxin; Immunoglobulin Y (IgY).

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên
nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu,

chủ yếu ở trẻ em, đặc biệt các quốc gia đang
phát triển. Một trong những tác nhân gây tiêu
chảy cấp là nhiễm K tả (Vibrio cholerae)

theo đường tiêu hóa. Theo thống kê của Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm
2013, trong năm 2012 đã ghi nhận 245.393
trường hợp mắc bệnh tả tại tất cả các châu
lục trên toàn thế giới, với 3.034 trường hợp
tử vong [7]. Cơ chế bệnh sinh của bệnh có
sự tham gia của ĐTT (cholera toxin - CT),

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đặng Dũng ()
Ngày nhận bài: 30/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/12/2013
Ngày bài báo được đăng: 16/12/2013

7


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
do VK tả tiết ra sau khi nhiễm vào ruột bệnh

nguyên là 0,1 mg/ml, sau đó gây miễn dịch

nhân; ĐTT gây tổn thương tế bào niêm mạc

cho gà mái, thu hoạch trứng và tách chiết

ruột, làm tăng tiết dịch tại ruột, dẫn đến ỉa

kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng theo các

chảy cấp. Một số nghiên cứu gần đây cho

quy trình đã được mô tả trong nghiên cứu

thấy, bên cạnh các biện pháp dự phòng và

trước của chúng tôi [1].

điều trị kinh điển khi nhiễm VK tả (như sử
dụng vắcxin, bổ sung nước, điện giải; sử
dụng kháng sinh), việc sử dụng kháng thể
đặc hiệu với VK tả hoặc với ĐTT có thể là
một biện pháp dự phòng và/hoặc điều trị
đặc hiệu có tác dụng bảo vệ rõ rệt trên mô
hình động vật thực nghiệm nhiễm VK tả
đường tiêu hóa [4, 6].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo

* Kiểm tra khả năng gắn kết của CT-B
với GM1 in vitro:
- Gắn GM1 lên phiến ELISA: ủ 50 µl GM1
(100 pmol/ml) trong mỗi giếng của phiến
ELISA, thời gian 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Tiến hành phản ứng: bổ sung vào mỗi
giếng 50 µl cộng hợp HRP-CTB ở những
nồng độ khác nhau, sao cho lượng CTB
trong mỗi giếng lần lượt là 1,25; 2,5 và 5

sát độ tinh sạch, đồng thời đánh giá hoạt

ng; rửa giếng bằng PBS-T, sau đó bổ sung

tính kháng thể IgY phân lập từ trứng gà

vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi

được gây miễn dịch với ĐTT trên in vitro.

50 ml OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2 ngay
trước khi sử dụng); ủ phiến ELISA ở nhiệt

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

độ phòng 15 phút trong bóng tối; ngừng

NGHIÊN CỨU

phản ứng bằng cách bổ sung 50 ul HCl 2N.

1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu.
- Độc tố VK tả (cholera toxin- CT) (Sigma,
Hoa Kỳ).
- Hoá chất, sinh phẩm chủ yếu: hóa chất

- Đo mật độ quang (OD) của các giếng
tại bước sóng 492 nm.
* Ph¶n øng ELISA đánh giá hoạt tính của

kháng thể IgY kháng CT-B:

chạy điện di SDS-PAGE; GM1, cộng hợp CTB

- Ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) trong mỗi giếng

(cholera toxin-B subunit)- HRP (horse radish

của phiến ELISA trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.

peroxidase) (Bio-Rad, Hoa Kỳ; Sanofi, Pháp).

- Bổ sung cộng hợp HRP-CTB cùng với

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.

kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà

* Gây miễn dịch cho gà mái với kháng

gây miễn dịch với kháng nguyên CT. Giếng đối

nguyên ĐTT và phân lập IgY:
- Tạo kháng nguyên ĐTT: trộn huyền
dịch ĐTT với tá chất freund hoàn chỉnh

chứng âm, sử dụng BSA thay cho IgY. Bên
cạnh đó, I Ig (intravenous immunoglobulin) được
sử dụng như đối chứng dương trong thí nghiệm.

hoặc không hoàn chỉnh (tỷ lệ 1:1 về thể

- Rửa phiến ELISA bằng PBS-T. Bổ sung

tích); nồng độ ĐTT trong huyền dịch kháng

vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi 50 ml

8


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2). Ủ phiến
ELISA trong bóng tối 15 phút ở nhiệt độ
phòng; ngừng phản ứng bằng cách bổ sung
50 ul HCl 2N. Đo OD của các giếng tại bước
sóng 492 nm.

khoảng 70 kDa và 35 kDa, tương ứng với
chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY.
2. Khả năng gắn kết của CTB với GM1
in vitro.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau
phân lập.
Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgY
sau thẩm tích loại muối bằng kỹ thuật điện
di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính protein.

CT-B concentration (ng/well

Hình 2: Khả năng gắn kết của CTB với
GM1 in vitro.
Kết quả thí nghiệm cho thấy ở các nồng
độ khác nhau, CTB đều thể hiện khả năng
gắn kết đặc hiệu với GM1 in vitro.
3. Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
của CTB với GM1.

Hình 1: Kết quả điện di SDS-PAGE trong
điều kiện biến tính IgY.

Hình 3: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
CTB- GM1 in vitro.
(GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 5 ng/giếng).

Kết quả cho thấy, sản phẩm IgY thu
được sau thẩm tích loại bỏ muối amoni
sulfate có độ tinh sạch cao, với 2 băng trên
điện di SDS-PAGE có trọng lượng lần lượt

9


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

Hình 4: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
CTB- GM1 in vitro.

(GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 1 ng/giếng)

Hình 5: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
CTB- GM1 in vitro.
(GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 0,2 ng/giếng)
Kết quả phản ứng ELISA cho thấy: kháng
thể IgY thu được từ lòng đỏ trứng gà gây
miễn dịch bằng độc tố VK tả phản ứng đặc
hiệu với CTB, đồng thời thể hiện tác dụng
ức chế sự gắn kết của CTB với GM1, trong
khi BSA (đối chứng âm) không thể hiện tác
dụng này. I Ig chỉ thể hiện tác dụng ức chế
gắn kết của CTB với GM1 khi nồng độ CTB
là 1,0 và 0,2 ng/giếng (hình 4, 5), không thể
hiện tác dụng này ở nồng độ CTB 5 ng/giếng
(hình 3). Việc sử dụng I Ig như đối chứng
dương trong thí nghiệm này dựa vào kết
quả nghiên cứu của Yuki N. và CS (1996)
công bố, trong đó, nhóm nghiên cứu nhận
thấy I Ig có tác dụng ngăn cản sự gắn kết
của ĐTT với GM1 in vitro [5]. Kết quả nghiên
cứu cho thấy chế phẩm IgY do chúng tôi

10

tạo ra thể hiện hoạt tính ức chế gắn kết của
CTB với GM1 mạnh hơn rõ rệt so với hoạt
tính của IVIg: ở tất cả các nồng độ CTB
được khảo sát, IgY đều thể hiện tác dụng
ức chế. Lý do có được kết quả này là do

IgY sử dụng trong thí nghiệm là sản phẩm
thu được sau gây miễn dịch đặc hiệu với
CT. Do đó, IgY có khả năng gắn kết đặc
hiệu với CTB, dẫn đến ức chế gắn kết của
CTB với GM1. Hoạt tính này của IgY kháng
ĐTT có thể là một cơ chế tác dụng của IgY
đặc hiệu với CT tạo ra hiệu quả bảo vệ: IgY
ức chế gắn của CTB với thụ thể GM1 trên
tế bào niêm mạc ruột, do đó ngăn chặn
ĐTT bám lên màng tế bào niêm mạc ruột,
cuối cùng, giảm tác động gây tổn thương tế
bào niêm mạc ruột của ĐTT.
Bằng phương pháp gây miễn dịch trên
gà mái và thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ
trứng của gà gây miễn dịch, Hoàng Trung
Kiên và CS đã thu được IgY từ lòng đỏ
trứng gà kháng K E. ictaluri (gây bệnh mủ
gan cá tra) [1], hoặc kháng thể đặc hiệu với
VK tả [2]. Tim Sunnary và CS với phương
pháp tương tự đã thu được kháng thể IgY
kháng trực khuẩn mủ xanh, có tác dụng ức
chế trực khuẩn mủ xanh trên mô hình vết
thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực
khuẩn mủ xanh [3].
Trong nghiên cứu này, gây miễn dịch
cho gà mái với kháng nguyên là ĐTT tự
nhiên (CT), cho phép phân lập được kháng
thể IgY từ trứng của gà được gây miễn
dịch, có phản ứng đặc hiệu với CTB. Theo
một số nghiên cứu gần đây, kháng thể IgY

đặc hiệu với kháng nguyên CT-B, thể hiện
tác dụng bảo vệ trên mô hình động vật thí
nghiệm nhiễm VK tả theo đường tiêu hóa
[4]. Kết quả thu được trong nghiên cứu này
gợi ý: IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT
(CT) và/hoặc CTB thể hiện tác dụng bảo vệ


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014
trên mô hình động vật nhiễm VK tả đường
tiêu hóa thông qua cơ chế ức chế gắn kết
của CTB với GM1.
KẾT LUẬN
Chế phẩm kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng
gà được gây miễn dịch với kháng nguyên
CT tương đối tinh khiết, có tác dụng ức chế
sự gắn kết của CTB với GM1 in vitro.
KẾT LUẬN
1. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn
Ngọc Tuấn. Nghiên cứu chế tạo kháng thể
kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở
cá tra bằng công nghệ tạo kháng thể IgY gà.
Tạp chí Thông tin y dược. 2010, số 3, tr.71-76
2. Hoàng Trung Kiên, Lê Thu Hồng, Lê Thu
Hà, Nguyễn Đặng Dũng. Nghiên cứu quy trình
gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng K tả
(Vibrio cholerae) trên gà mái. Tạp chí Y - Dược
học quân sự. 2013, tập 38, số 1,tr. 46-51.

thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trên vết

thương bỏng thực nghiệm nhiễm trực khuẩn mủ
xanh. Tạp chí Y - Dược học quân sự. 2011, tập
36, số 8, tr.44-49.
4. Hirai K, Arimitsu H, Umeda K. Passive oral
immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY)
to Vibrio cholerae effectively prevents cholera.
ActaMedica Okayama. 2010, 64 (3), pp.163-170.
5. Nobuhiro Yuki, Fuminori Myiagi. Possible
mechanism of intravenous immunoglobulin treatment
on anti-GM1 antibody-mediated neuropathies.
Journal of the Neurological Sciences. 1996, Vol.
139, Issue 1, pp.160-162.
6. Osek J, Jonson G, Svennerholm AM,
Holmgren J. Role of antibodies against biotypespecific Vibrio cholerae pili in protection against
experimental classical and El Tor cholera. Infect
Immun. 1994, 62 (7), pp.2901-2907.
7. World Health Organization. Cholera, 2012.
Weekly Epidemiological Record. 2013, Vol 88,
No 31, pp.321-336.

3. Tim Sunnary, Đỗ Minh Trung, Lê Thu
Hồng, Lê Văn Đông. Tác dụng in vivo của kháng

11


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

12