Ứng dụng kỹ thuật inverse‐shifting PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia A thể nặng

Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT INVERSE‐SHIFTING PCR XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN 
ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A THỂ NẶNG  
Nguyễn Hữu Huy*, Nguyễn Thị Băng Sương**, Đỗ Thị Thanh Thủy**, Ngô Thị Hồng Phước** 

TÓM TẮT 
Mở  đầu:  Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X do sự thiếu hụt hoặc 
khiếm khuyết yếu tố VIII, một loại protein đông máu. Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/5000 trẻ trai. Bệnh 
Hemophilia A thể nặng (nồng độ yếu tố VIII thấp hơn 1%) chiếm khoảng 40% các trường hợp mắc bệnh. Bệnh 
nhân mắc bệnh dễ xuất huyết do chấn thương hay tự phát, tụ máu trong cơ, chảy máu ở khớp. Đột biến đảo đoạn 
intron 22 gây ra 40‐50% các trường hợp Hemophilia A thể nặng. 
Mục tiêu: Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 ở bệnh nhân Hemophilia A thể nặng và người nữ dị hợp tử 
trong gia đình bệnh nhân. 
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thực hiện phân tích 2 gia đình với 2 bệnh nhân nam được chẩn 
đoán Hemophilia A thể nặng và 5 thành viên nữ. Phản ứng Inverse PCR gồm 3 bước: (a) cắt bằng enzyme BclI; 
(b) nối lại sản phẩm cắt tạo DNA vòng; (c) thực hiện phản ứng multiplex PCR và đọc kết quả. 
Kết quả: Phát hiện 2 bệnh nhân nam mang đột biến đảo đoạn intron 22, 4 người nữ dị hợp tử là người lành 
mang gen bệnh và 1 người nữ đang có thai là người bình thường. 
Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật Inverse PCR để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 
22 gây bệnh Hemophilia A thể nặng ở bệnh nhân và người lành mang gen bệnh. 
Từ khoá: Inverse PCR, đảo đoạn intron 22, Hemophilia A 

ABSTRACT 
APPLICATION INVERSE‐SHIFTING PCR TO IDENTIFY INVERSION INTRON 22 CAUSE  
OF SEVERE HEMOPHILIA A 
Nguyen Huu Huy, Nguyen Thi Bang Suong, Do Thi Thanh Thuy, Ngo Thi Hong Phuoc 
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 202 ‐ 207 
Introduction:  Hemophilia A is a recessive X‐linked genetic disorder caused by missing or defective factor 

VIII, a clotting protein. Hemophilia A occurs in approximately 1 in 5,000 live births. Severe hemophilia A (factor 
levels less than 1%) represents approximately 40% of cases. People with severe hemophilia A experience bleeding 
following an injury and may have frequent spontaneous bleeding episodes, often into their joints and muscles. 
Factor VIII intron 22 inversions (Inv22) cause 40%–50% of severe cases of hemophilia A. 
Objective: Identify inversion intron 22 in severe Hemophilia A patients and heterozygous female carriers. 
Patients  and  Method:  To  conduct  the  genetic  analysis  in  2  families  of  2  patients  diagnosed  of  severe 
hemophilia  A  and  5  female  members.  Inverse  PCR  involved  3  steps:  (a)  BclI  restriction;  (b)  self‐ligation  of 
restriction fragments, providing BclI rings; and (c) standard multiplex‐PCR analysis.  
Results: 2 male patients had intron 22 inversion, 4 female members were carrier and 1 female member, who 
was pregnant, was fortunately non carrier. 
Conclusion:  We  have  successfully  applied  inverse  PCR  to  identify  inversion  intron  22  cause  of  severe 
Hemophilia A. This helped for the detection of patients and identification of female carriers. 
Keywords: Inverse PCR, inversion intron 22, Hemophilia A 
* Khoa sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên,TPHCM.  ** Đại học Y Dược TPHCM. 
Tác giả liên lạc: TS.BS Nguyễn Thị băng Sương  , ĐT: 0914007038  , Email:  

202

Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
Hemophilia  A  là  căn  bệnh  rối  loạn  đông 
máu di truyền nghiêm trọng do sự thiếu hụt hay 
khiếm khuyết yếu tố VIII đồng thời đây cũng là 
căn bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể 
giới tính X phổ biến nhất với tần suất mắc bệnh 
là 1/5000 trẻ trai(1). Nguyên nhân gây bệnh là do 
đột  biến  trên  gen  F8  nằm  trên  cánh  dài  nhiễm 

sắc thể giới tính X tại vị trí Xq28, gen có chiều dài 
186 kb, gồm 26 exon và mã hóa cho RNA dài 9 
kb(3).  Sản  phẩm  của  gen  F8  là  yếu  tố  VIII  nằm 
trong phức hợp hoạt hóa yếu tố X đóng vai trò 
rất  quan  trọng  trong  con  đường  đông  máu,  sự 
thiếu  hụt  yếu  tố  VIII  sẽ  dẫn  đến  rối  loạn  đông 
máu và các biểu hiện lâm sàng là xuất huyết tự 
phát hay do chấn thương nhẹ, tụ máu trong cơ, 
chảy  máu  ở  khớp,  đôi  khi  có  tiểu  máu.  Bệnh 
Hemophila  A  được  chia  thành  3  loại  dựa  vào 
nồng độ yếu tố VIII trong huyết thanh: thể nặng 
khi yếu tố VIII có nồng độ rất thấp (<1% so với 
giá trị bình thường), thể trung bình (1‐5%) và thể 
nhẹ (5‐40%). với tỷ lệ lần lượt của các thể bệnh là 
40%,  10%  và  50%  các  trường  hợp  mắc 
Hemophilia  A(6).  Khoảng  70%  các  trường  hợp 
mắc bệnh là do di truyền gen đột biến và 30% là 
do đột biến de novo. Các đột biến gây nên bệnh 
Hemophilia A chủ yếu là các đột biến điểm nằm 
rải rác khắp chiều dài của gen. Tuy nhiên 40‐50% 
các trường hợp Hemophilia A thể nặng là do đột 
biến đảo đoạn intron 22(4). Nguyên nhân của đảo 
đoạn intron 22 là do một đoạn trình tự dài 9,5 kb 
nằm trong intron 22 của gen F8 gọi là int22h‐1 có 
độ  tương  đồng  rất  cao  với  2  vùng  int22h‐2  và 
int22h‐3 nằm cách xa gen F8, các trình tự này có 
thể tái tổ hợp tương đồng trong nhiễm sắc thể X 
làm  phá  vỡ  khung  đọc  của  gen  F8  gây  ra  bệnh 
Hemophilia A thể nặng(8). 
Do Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên 

kết  với  nhiễm  sắc thể giới  tính  X  nên  bệnh  chủ 
yếu gặp ở nam giới vì người nam chỉ có 1 nhiễm 
sắc thể X nên nếu có đột biến sẽ biểu hiện ngay 
ra kiểu hình còn người nữ phải đột biến ở trên 2 
nhiễm sắc thể X mới bị mắc bệnh. Người nữ dị 
hợp tử mang gen bệnh sẽ có 50% nguy cơ truyền 

Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học

Nghiên cứu Y học

gen X bị đột biến cho con của mình. Do vậy nếu 
không có các chương trình tầm soát gen bệnh thì 
bệnh  Hemophilia  A  sẽ  lan  truyền  rộng  trong 
cộng đồng, tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao, người 
bệnh sẽ trở thành gánh nặng cho gia đình và xã 
hội. Hiện nay có 3 phương pháp chính để phát 
hiện  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  là  Southern 
Blot,  Long  distance‐PCR và  Inverse  PCR  trong 
đó  Inverse  PCR  được  đánh  giá  là  một  phương 
pháp đặc hiệu, đơn giản, tiết kiệm chi phí, phù 
hợp với điều kiện Việt Nam. Từ cơ sở đó, chúng 
tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu với mục tiêu: 
“Ứng  dụng  kỹ  thuật  Inverse‐shifting  PCR  xác 
định  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  ở  bệnh  nhân 
Hemophilia A thể nặng”. 

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Đối tượng nghiên cứu 
Gồm 2 gia đình 

Gia  đình  bệnh  nhân  thứ  nhất  gồm  1  bệnh 
nhân nam mắc bệnh Hemophilia A thể nặng và 
3  thành  viên  nữ  là  mẹ  và  2  chị  của  bệnh  nhân 
trong đó một người chị đang mang thai. 
Gia  đình  bệnh  nhân  thứ  hai  gồm  1  bệnh 
nhân nam mắc bệnh Hemophilia A thể nặng và 
2 thành viên nữ là mẹ và dì của bệnh nhân. 
Mẫu  DNA  chứng  dương  là  plasmid  tạo 
dòng từ bệnh nhân đảo đoạn intron 22 và mẫu 
DNA  người  bình  thường  không  mắc  bệnh 
Hemophilia A 

Phương pháp nghiên cứu 
Kỹ thuật tách chiết DNA  
Mẫu  máu  ngoại  vi  được  xử  lý  bằng  chất 
chống đông EDTA, được tách chiết trong 24 giờ. 
Quy trình tách chiết DNA từ 2 ml máu ngoại vi 
được  tiến  hành  theo  Promega  Kit.  Nồng  độ  và 
độ tinh sạch của sản phẩm DNA được kiểm tra 
trên  máy  quang  phổ  NanoDrop  2000,  những 
mẫu  có  tỷ  lệ  giá  trị  mật  độ  quang  ở  bước  sóng 
260/280  nm  đạt  từ  1,8  –  2,0  được  dùng  để  tiến 
hành phản ứng PCR và giải trình tự gen. 

203


Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014

Kỹ  thuật  Inverse  PCR  xác  định  đột  biến  đảo 
đoạn intron 22 
Phương  pháp  Inverse  PCR  gồm  3  bước 
chính 
‐  Cắt  bằng  enzyme  BclI:  Thành  phần  phản 
ứng gồm 1,5 μg DNA genome, 3 μl buffer 10X, 
1,2 μl enzyme BclI (Promega), bổ sung nước cất 
cho đủ thể tích 30 μl. Ủ 50oC/4 giờ. Tinh sạch sản 
phẩm  cắt  bằng  Phenol/chloroform.  Tủa  sản 
phẩm  bằng  ethanol  tuyệt  đối  và  CH3COONa. 
Hòa sản phẩm trong 20 μl nước cất. 
‐  Nối  bằng  T4  DNA  Ligase:  Thành  phần 
phản  ứng  gồm  20  μl  DNA  sản  phẩm  cắt,  20  μl 
buffer  10X,  1  μl  T4  DNA  Ligase  (Promega).  Ủ 
16oC/16‐18  giờ.  Tinh  sạch  sản  phẩm  nối  bằng 
Phenol/chloroform. Tủa sản phẩm bằng ethanol 
tuyệt  đối  và  CH3COONa.  Hòa  sản  phẩm  trong 
20 μl nước cất. 
‐  Phản  ứng  Inverse  PCR:  Thành  phần  phản 
ứng gồm 0,1 μl Taq Takara, 2 μl buffer 10X, 1,5 
μl dNTPs, 2 μl sản phẩm nối, 0,5 μl mồi ID, 0,5 
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 

μlmồi  ED,  0,5  μl  mồi  IU,  bổ  sung  nước  cất  cho 
đủ thể tích 15 μl. 
Chu  trình  nhiệt:  Biến  tính  ở  98oC  trong  5 
phút,  sau  đó  là  40  chu  kỳ  gồm  98oC  trong  10 
giây; 55oC trong  20  giây;  72oC trong 30  giây,  và 
giai đoạn kết thúc gồm 72oC trong 2 phút. 

Bảng 1‐ Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng 
Inverse PCR 
Trình tự
Sản phẩm
Tên
Primer
ID
5'-ACATACGGTTTAGTCACAAGT-3
487 bp
(ID / IU):
Bình
thường
ED
5'- TCCAGTCACTTAGGCTCAG-3 559 bp (ED
/ IU): Đảo
IU
5'-CCTTTCAACTCCATCTCCAT-3
đoạn intron
22

Các  sản  phẩm  nhân  bản  của  phản  ứng 
Inverse  PCR  được  điện  di  trên  gel  agarose  2%. 
Kích thước của các sản phẩm được xác định khi 
so sánh với thang chuẩn 1kb plus (Invitrogen). 

Kết quả Inverse PCR của gia đình bệnh nhân thứ nhất 

600bpp
500bp6

 
Hình 1‐ Kết quả Inverse PCR gia đình bệnh nhân thứ nhất 
Giếng  T:  Thang  1  Kb  Plus  DNA;  Giếng  (‐): 
Chứng  âm;  Giếng  1:  Bệnh  nhân;  Giếng  2:  Mẹ 
bệnh nhân; Giếng 3: Chị bệnh nhân; Giếng 4: Chị 
bệnh nhân đang mang thai; Giếng 5: Người bình 
thường; Giếng 6: Chứng dương. 

204

Nhận  xét:  Bệnh  nhân  ở  giếng  1  có  1  băng 
DNA tương ứng với băng kích thước 559 bp của 
chứng dương ở giếng số 6 chứng tỏ bệnh nhân 
có  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22.  Người  chị  của 
bệnh  nhân  đang  mang  thai  có  1  băng  DNA 

Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 
tương ứng với băng kích thước 487 bp của người 
bình thường ở giếng số 5 chứng tỏ người này là 
người bình thường. Mẹ bệnh nhân ở giếng số 2 
và  người  chị  của  bệnh  nhân  ở  giếng  số  3  có  2 

Nghiên cứu Y học

băng DNA tương ứng với băng 559 bp và 487 bp 
chứng  tỏ  hai  người  này  mang  kiểu  gen  dị  hợp 
tử.  Bệnh  nhân  bị  mắc  bệnh  Hemophilia  A  thể 

nặng do di truyền từ mẹ.  

Kết quả Inverse PCR của gia đình bệnh nhân thứ hai 

600bpp
500bp6

 
Hình 2‐ Kết quả Inverse PCR gia đình bệnh nhân thứ hai 
Giếng  T:  Thang  1  Kb  Plus  DNA;  Giếng  (‐): 
Chứng  âm;  Giếng  1:  Bệnh  nhân;  Giếng  2:  Mẹ 
bệnh  nhân;  Giếng  3:  Dì  bệnh  nhân;  Giếng  4: 
Người bình thường; Giếng 5: Chứng dương 
Nhận  xét:  Bệnh  nhân  ở  giếng  1  có  1  băng 
DNA tương ứng với băng kích thước 559 bp của 
chứng dương ở giếng số 5chứng tỏ bệnh nhân có 
đột  biến  đảo  đoạn  intron  22.  Mẹ  bệnh  nhân  ở 
giếng số 2 và người dì của bệnh nhân ở giếng số 
3 có 2 băng DNA tương ứng với băng 559 bp và 
487 bp chứng tỏ hai người này mang kiểu gen dị 
hợp  tử.  Bệnh  nhân  bị  mắc  bệnh  Hemophilia  A 
thể nặng do di truyền từ mẹ. 

BÀN LUẬN 
Hemophilia  A  là  bệnh  di  truyền  lặn  liên 
kết  với  nhiễm  sắc  thể  giới  tính  X  do  đột  biến 
tại gen F8 dẫn đến thiếu hụt yếu tố VIII gây ra 
rối  loạn  đông  máu.  Các  đột  biến  ở  gen  F8  vô 
cùng  đa  dạng  bao  gồm  mất  toàn  bộ  gen,  đảo 
đoạn  DNA  lớn,  các  đột  biến  vô  nghĩa,  sai 

nghĩa, lệch khung, splicing... đều có thể gây ra 
những  bất  thường  trong  sự  biểu  hiện,  tiết  và 

Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học

thời  gian  phân  hủy  của  yếu  tố  VIII.  Trong  số 
các  đột  biến  ở  gen  F8  thì  đột  biến  quan  trọng 
nhất là đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm 40‐
50%  các  trường  hợp  Hemophilia  thể  nặng(4). 
Đặc biệt, 21% các trường hợp đảo đoạn intron 
22 sẽ sản xuất kháng thể kháng lại yếu tố VIII 
điều  trị  bổ  sung  dẫn  đến  rất  nhiều  khó  khăn 
trong việc điều trị bệnh Hemophilia(9). 
Gen F8 là một trong những gen lớn nhất với 
kích thước 186 kb nằm ở vị trí Xq28. Gen F8 có 
26 exon có kích thước từ 69 đến 3106 bp. Chiều 
dài của vùng intron lên đến 177,9 kb với intron 
lớn nhất là intron 22 dài 32,8kb(3). 
Vào  năm  1990,  Levison  đã  phát  hiện  trong 
gen F8 có chứa 1 gen khác là gen F8A, gen này 
nằm ngược chiều với gen F8 và nằm trong vùng 
intron  22(5).  Sau  đó,  Freije  và  Schlessinger  đã 
phát hiện trong nhiễm sắc thể X có 3 bản sao của 
gen  F8A,  1  nằm  ở  vùng  intron  22  và  2  bản  sao 
còn lại nằm ngược hướng cách gen F8 500kb(2). 
Vào  năm  1993,  hai  nhóm  nghiên  cứu  đã  chứng 
minh  nguyên  nhân  của  50%  các  trường  hợp 
Hemophilia  A  thể  nặng  là  do  một  đột  biến  tại 

205

Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014

vùng  intron  22  ngăn  cản  sự  phiên  mã  liên  tục 
của mRNA từ exon 22 sang exon 23. Cả 2 nhóm 
đã đề xuất một mô hình dựa trên sự tái tổ hợp 
tương đồng giữa các đoạn gen F8A nằm ở intron 

22 và ngược chiều gen F8. Khi sự tái tổ hợp diễn 
ra  sẽ  làm  đảo  ngược  trình  tự  DNA  nằm  bên 
trong và phá vỡ khung đọc gen F8(4,7). 

 
Hình 3‐ Cơ chế đảo đoạn intron 22 của gen F8 
Vào  năm  2005,  Rosetti  đã  thiết  kế  phương 
pháp Inverse PC nhằm phát hiện đột biến đảo 
đoạn intron 22. Sau khi xử lý cắt bằng enzyme 
BclI  và  nối  lại  bằng  T4  Ligase  sẽ  tạo  ra  DNA 
vòng  chứa  vùng  trình  tự  intron  22.  Rosetti  đã 
thiết kế 3 mồi trong đó 2 mồi ID và IU bắt cặp 
với trình tự nằm ở trong gen F8 khi PCR sẽ tạo 
ra  sản  phẩm  có  kích  thước  487  bp  tương  ứng 
với  gen  F8  bình  thường  không  xảy  ra  đảo 
đoạn.  Mồi  ED  bắt  cặp  với  trình  tự  ở  giữa 
int22h‐2  và  int22h‐3  nằm  bên  ngoài  gen  F8. 
Khi  xảy  ra  đảo  đoạn  thì  một  phần  int22h‐1 
được thay thế bằng đoạn int22h‐2 hoặc int22h‐

3, mồi ED sẽ kết hợp với mồi IU để tạo thành 
sản phẩm PCR kích thước 559 bp(10). 
Phương  pháp  Inverse  PCR  có  nhiều  ưu 
điểm hơn so với 2 phương pháp Southern Blot 
và Long distance PCR trước đó dùng để chẩn 
đoán  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  là thời  gian 
thực  hiện  nhanh  hơn  phương  pháp  Southern 
Blot  (2  ngày  so  với  8  ngày)  và  tương  đương 
phương  pháp  Long  distance‐PCR.  Đồng  thời 

206

phương pháp này không sử dụng chất đồng vị 
độc  hại  như  phương  pháp  Southern  Blot  hay 
yêu  cầu  nghiêm  ngặt  về  chất  lượng  Taq,  chu 
trình  nhiệt,  chất  lượng  DNA  bản  mẫu  như 
phương pháp Long distance‐PCR. Inverse PCR 
được  đánh  giá  là  phương  pháp  đơn  giản,  tiết 
kiệm chi phí, đảm bảo tính đặc hiệu cao do sự 
đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn phù hợp ứng 
dụng ở điều kiện Việt Nam(6). 
Khi ứng dụng phương pháp Inverse PCR để 
xác  định  đột  biến  đảo  đoạn  intron  22  ở  2  gia 
đình  bệnh  nhân  thì  2  bệnh  nhân  nam  đều  di 
truyền đột biến từ mẹ của mình. Đa số các người 
nữ trong 2 gia đình đều là người lành mang gen 
bệnh (4/5 người), nếu họ mang thai thì cần tiến 
hành chẩn đoán trước sinh và thực hiện tư vấn 
di truyền vì nguy cơ họ truyền gen bệnh cho con 
là 50%. Đối với người chị bệnh nhân đang mang 

thai ở gia đình thứ nhất thì không cần tiến hành 
chọc ối vì người mẹ không mang gen bệnh nên 
sẽ không truyền gen bệnh cho thai nhi. 
 

Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 
2.

Freije  D,  Schlessinger  (1992),  “A  1.6‐Mb  contig  of  yeast 
artificial  chromosomes  around  the  human  factor  VIII  gene 
reveals  three  regions  homologous  to  probes  for  the  DXS115 
locus  and  two  for  the  DXYS64  locus”,  Am  J  Hum  Genet, 
51(1):66‐80. 
Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, Wion KL, Chen EY, Eaton 
DH,  Vehar  GA,  Capon  DJ,  Lawn  RM  (1984), 
“Characterization  of  the  human  factor  VIII  gene”,  Nature, 
312:326–330. 
Lakich  D,  Kazazian  HH,  Jr.,  Antonarakis  SE,  Gitschier  J 
(1993),  “Inversions  disrupting  the  factor  VIII  gene  are  a 
common  cause  of  severe  haemophilia  A”,  Nat  Genet,  5:236–
241.  
Levinson B, Kenwrick S, Gamel P, Fisher K, Gitschier J (1992), 
“Evidence  for  a  third  transcript  from  the  human  factor  VIII 
gene”, Genomics, 14(3):585‐9. 
Liliana  C.  Rossetti,  Claudia  P.  Radic,  Miguel  M.  Abelleyro, 
Irene  B.  Larripa,  and  Carlos  D.  De  Brasi  (2011),  “Eighteen 
Years  of  Molecular  Genotyping  the  Hemophilia  Inversion 

Hotspot:  From  Southern  Blot  to  Inverse  Shifting‐PCR”,  Int  J 
MolSci, 12(10): 7271–7285. 
Naylor J, Brinke A, Hassock S, Green PM, Giannelli F, (1993), 
“Characteristic mRNA abnormality found in half the patients 
with severe haemophilia A is due to large DNA inversions”, 
Hum Mol Genet, 2(11):1773‐8. 
Naylor  JA,  Buck  D,  Green  PM,  Williamson  H,  Bentley  D, 
Giannelli  F  (1995),  “Investigation  of  the  factor  VIII  intron  22 
repeated  region  (int22h)  and  the  associated  inversion 
junctions”,Hum Mol Genet, 4:1217‐1224. 
Oldenburg  J,  Schröder  J,  Hermann  Brackmann  HH,  Müller‐
Reible  C,  Schwaab  R,  Tuddenham  E  (2004),  “Environmental 
and  genetic  factors  influencing  inhibitor  development”, 
Semin Hematol, 41:82–88. 
Rossetti  LC,  Radic  CP,  Larripa  IB,  De  Brasi  CD  (2005), 
“Genotyping  the  hemophilia  inversion  hotspot  by  use  of 
inverse PCR”, Clin Chem, 51:154–158. 
Wood  WI,  Capon  DJ,  Simonsen  CC,  Eaton  DL,  Gitschier  J, 
Keyt B, Seeburg PH, Smith DH, Hollingshead P, Wion KL, et 
al  (1984),  “Expression  of  active  human  factor  VIII  from 
recombinant DNA clones”, Nature, 312:330–337. 

3.

4.

5.

6.

7.

8.

 
Hình 4‐ Nguyên tắc của phương pháp Inverse PCR 
xác định đảo đoạn intron 22 

9.

KẾT LUẬN 
Nghiên  cứu  đã  ứng  dụng  thành  công  kỹ 
thuật  Inverse  PCR  xác  định  đột  biến  đảo  đoạn 
intron  22  ở  bệnh  nhân  Hemophilia  A  và  người 
lành  mang  gen  bệnh.  Trong  2  gia  đình  bệnh 
nhân  được  phân  tích  thì  có  1  người  nữ  mang 
kiểu  gen  bình  thường,  2  bệnh  nhân  bị  đột  biến 
đảo đoạn intron 22 và 4 người nữ là người lành 
mang gen bệnh. 

10.

11.

 
Ngày nhận bài báo: 

 

 

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1.

Nghiên cứu Y học

Bolton‐Maggs  PH,  Pasi  KJ  (2003),“Hemophilias  A  and  B”, 
Lancet, 361:1801‐1809. 

Ngày bài báo được đăng: 

 

05/9/2014 

 

29/9/2014 
20/10/2014 

 

 

 

Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học

207