Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh vi khuẩn gây bệnh thường gặp

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỂ ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP
Nguyễn Thị Ngọc Thu*, Nguyễn Trọng Hiệp*, Bùi Tùng Hiệp**

TÓM TẮT
Mở đầu: Việc định danh nhanh chóng vi khuẩn là điều cốt yếu trong việc điều trị bệnh nhân, đặc biệt trong
những nhiễm trùng nặng. Trong những phương pháp hiện đang sử dụng tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm
sàng để chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn, nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp thường sử dụng nhất. Tuy nhiên, nuôi
cấy đòi hỏi thời gian ít nhất từ 18-24 giờ cho vi khuẩn mọc và phải thêm nhiều thời gian nữa cho những thử
nghiệm tính chất sinh-hóa để để định danh.
Mục tiêu: Khảo sát thêm một phương pháp có khả năng định danh các vi khuẩn gây bệnh thường gặp.
Phương pháp: Mười một vi khuẩn gây bệnh thường gặp, bao gồm 6 vi khuẩn Gram âm (Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, và Pseudomonas
aeruginosa) và 5 vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 51299, Bacillus subtilis ATCC 6633,
Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696) đã được khuếch đại vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA
ribosom của tiểu đơn vị nhỏ và lớn, với những mồi P1(5’-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3’) và P2 (5’GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’).
Kết quả: Mỗi loài vi khuẩn khảo sát cho được một mẫu riêng biệt. Các mẫu này gồm nhiều vạch DNA
khuếch đại tạo ra, có tính khác biệt rõ ràng giữa các loài.
Kết luận: Các số liệu cho thấy tính hữu dụng của phương pháp này, có thể sử dụng, mang tính hiệu qủa và
chuyên biệt cao, giúp phân biệt giữa những loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp.
Từ khóa: Vi khuẩn gây bệnh thường gặp, họ Enterobacteriaceae, vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA
ribosom (rRNA) của tiểu đơn vị nhỏ và lớn, PCR, Staphylococcus aureus kháng methicillin

ABSTRACT
APPLYING THE MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUE
FOR IDENTIFICATION OF COMMON PATHOGENIC BACTERIA

Nguyen Thi Ngoc Thu, Nguyen Trong Hiep, Bui Tung Hiep
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 252 - 257
Background: Rapid identification of bacteria is crucial in patient therapeutics, especially in severe
infections. Among the various methods currently used in clinical laboratories for detection of bacterial infections,
culture is the most frequent one. However, culture method requires at least 18-24 h of incubation, additional time
is needed to perform biochemical tests to identify the bacteria.
Objectives: To develop an alternative method for identification of common pathogenic bacteria.
Method: Eleven common pathogenic bacteria, including six Gram-negative bacteria (Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, and Pseudomonas aeruginosa), and
five Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus
faecalis, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae) were amplified in the intergenic 16S-23S spacer regions
**Bệnh viện cấp cứu Trưng Vương, TP. HCM
*Khoa Dược- ĐH Y Dược TP HCM, TP. HCM
Tác giả liên hệ: TS. Nguyễn Trọng Hiệp
ĐT: 0907429991
Email:

252

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

of bacterial rRNA genes by using the PCR with primers P1(5’-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3’) and P2
(5’-GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’).
Results: Each studied species gave a specific ribotyping pattern. The pattern of DNA multiple bands is
produced which is very discriminatory.

Conclusion: These data demonstrated the utility of this method can very efficiently and specifically
differentiate between the common pathogenic bacteria.
Keywords: Common pathogenic bacteria, Enterobacteriaceae, the intergenic 16S-23S spacer regions of
bacterial rRNA genes, PCR, methicillin-resistant Staphylococcus aureus
ribosom (rRNA) cho tiểu đơn vị nhỏ và lớn (16S
ĐẶT VẤN ĐỀ
và 23S rRNA), gọi chung là phương pháp định
Việc định danh chính xác vi khuẩn gây
týp ribosom (ribotyping). Số lượng và kích
bệnh trong mẫu bệnh phẩm là yêu cầu quan
thước những vùng DNA khuếch đại mang tính
trọng, thiết yếu của một phòng xét nghiệm vi
đặc trưng cho từng loài sẽ giúp định danh các vi
sinh lâm sàng. Một số vi khuẩn mọc chậm
khuẩn gây bệnh(3,6,7,8,9,10). Chưa có nhiều nghiên
hoặc/ và yêu cầu nuôi cấy khó khăn thì các
cứu định danh các vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ
phương pháp nuôi cấy cổ điển thường qui gặp
thuật này tại Việt nam. Đề tài nhằm khảo sát
nhiều khó khăn hay mất nhiều thời gian nhiều
thêm một phương pháp áp dụng kỹ thuật sinh
tuần, đôi khi nhầm lẫn. Nhiều nghiên cứu cho
học phân tử, có khả năng định danh các vi
thấy các phương pháp định danh cổ điển dựa
khuẩn gây bệnh thường gặp.
trên hình thể học và phản ứng sinh hóa của
VẬTLIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
những bộ kit thương mại thông dụng, phổ
biến trên thế giới như API hoặc hệ thống định
Chủng vi khuẩn

danh tự động VITEK 2 (automated
11 chủng đại diện được cung cấp bởi phòng
identification system) khá đắt tiền dành cho vi
thí nghiệm Vi sinh – Ký sinh gồm 6 vi khuẩn
khuẩn gây bệnh cũng có một tỉ lệ không định
Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
danh được hoặc nhầm lẫn(1).
Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis,
Các phương pháp sinh học phân tử với ưu
Pseudomonas aeruginosa) và 5 chủng vi khuẩn
thế cho kết qủa định danh nhanh chóng (khoảng
Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923,
1 ngày so với trung bình 3 ngày của phương
Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ATCC
pháp cổ điển), chính xác vi khuẩn gây bệnh là
43300, Streptococcus faecalis ATCC 51299, Bacillus
hết sức cần thiết trong những bệnh nhiễm nặng
subtilis ATCC 6633, Corynebacterium diphtheriae
(nhiễm trùng huyết, viêm màng não v…v…), để
ATCC 51696).
từ đó có kết qủa kháng sinh đồ phù hợp, phác
Định danh vi khuẩn
đồ điều trị kháng sinh hiệu qủa góp phần trong
Trước hết, những chủng vi khuẩn đại diện
chiến lược sử dụng kháng sinh tốt trong bệnh
Gram
âm và Gram dương, được định danh bằng
viện. Tất cả sẽ ảnh hưởng đến việc làm giảm
bộ kit API 20E (BioMerieux®) hoặc bằng
thời gian và chi phí điều trị, tỉ lệ tử vong cũng

phương pháp thường qui.
như kiểm soát việc gia tăng tính đề kháng kháng
sinh(2,4).
Kỹ thuật sinh học phân tử
Trong vòng 10 năm qua, kỹ thuật sinh học
phân tử đã được sử dụng rộng rãi xác định tính
đa hình hoặc/và để định danh vi khuẩn tới loài,
dựa trên việc khuếch đại những vùng bảo thủ
trong vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA

Chuyên Đề Dược Khoa

Sau đó tất cả những chủng đại diện này
được thực hiện bằng kỹ thuật PCR khuếch đại
vùng nối nội của gen mã hóa cho RNA ribosom
của tiểu đơn vị nhỏ và lớn (16S và 23S rRNA)
với những mồi P1 (5’-TTG TAC ACA CCG CCC

253


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

GTC A-3’) và P2 (5’- GGT ACT TAG ATG TTT
CAG TTC-3’), được thiết kế bổ sung với những
đoạn có trình tự bảo thủ gần đầu 3’ của vùng
16S và đầu 5’ của vùng 23S trên gen mã hóa cho
RNA ribosom.

Chiết DNA vi khuẩn
Hoạt hóa vi khuẩn trên môi trường
Trypticase soy broth, sau đó thực hiện chiết
DNA bộ gen vi khuẩn bằng bộ kit Wisard® SV
genomic DNA purification system (A2361Promega) theo qui trình của nhà cung cấp.

Thực hiện phản ứng PCR
Sử dụng cặp mồi P1 và P2, phản ứng được
thực hiện trên máy luân nhiệt (ATC401 model;
Apollo-CLP). Thông số chạy PCR gồm biến tính
ban đầu 1 phút ở 940C; 30 chu kỳ (1 phút ở 940C,
1 phút ở 500C, 1 phút 30 giây ở 720C); 5 phút ở
720C) với GoTaq® Flexi DNA polymerase
(M8295- Promega). Sản phẩm khuếch đại được
điện di trong điện trường 100V trong 2 giờ trên
gel agarose 2.5 % có chứa ethidium bromide.
Sản phẩm được phát hiện dưới tia UV 254 nm,
chụp hình bằng hệ thống chụp gel (UV
Transilluminator- Wealtec), phân tích bằng phần
mềm Cross checker 2.91.

khuếch đại ảnh hưởng nhiều bởi thông số thành
phẩn MgCl2 và enzyme Taq polymerase của
phản ứng, cụ thể trong nghiên cứu này thì
MgCl2 (1.5mM) và enzyme Taq polymerase
(2.5U) cho kết qủa tốt nhất.
Kỹ thuật định týp ribosom giúp định danh
một cách nhanh chóng những vi khuẩn gây
bệnh thường gặp Gram âm và Gram dương vì

số lượng và kích thước những vùng DNA
khuếch đại mang tính đặc trưng cho từng
loài(3,6,7,8,9,10). Kết qủa cho thấy, với những vi
khuẩn Gram âm: Shigella flexneri được quan sát
có ba sản phẩm khuếch đại ở vị trí 1100, 800 và
700 bp. Salmonella typhi cũng cho ba băng kích
thước 1200, 900 và 700 bp. Proteus mirabilis cho
bốn băng với kích thước 1100, 900, 850 và 750
bp. Riêng Pseudomonas aeruginosa chỉ có duy nhất
một băng ở vị trí 850 bp (Hình 1). K. pneumoniae
thì cho ba băng ở những vị trí kích thước 850,
700, 550 bp. Với E. coli, chúng tôi nhận thấy vi
khuẩn này cho bốn băng với kích thước 1200,
850, 800 và 700 bp (Hình 2).
A

B

C

D

M

KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN
Những chủng đại diện vi khuẩn Gram âm
(E. coli, K. pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella
flexneri, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa)
những chủng lâm sàng ESBL E. coli, Klebsiella
pneumoniae đã được định danh bằng bộ kit API

20E (BioMerieux®), tất cả đều cho kết qủa định
danh với tỉ lệ % Id từ 73.2 đến 99.9%. Những
chủng đại diện vi khuẩn Gram dương
(Staphylococcus
aureus,
Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis,
Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae) đều
cho kết qủa định danh phù hợp bằng phương
pháp thường qui. Với kỹ thuật PCR định týp
ribosom, chúng tôi nhận thấy các băng DNA

254

1.5 kb
1 kb
700 bp
Hình 1. Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR
trên vi khuẩn Shigella flexneri; Salmonella typhi;
Proteus mirabilis; Pseudomonas aeruginosa
A: Shigella flexneri. B: Salmonella typhi. C: Proteus
mirabilis. D: Pseudomonas aeruginosa. M: Marker 100 bp.

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
MF

EM

1.2 kb
1 kb

500 bp

Hình 2. Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR
trên vi khuẩn K. pneumoniae và E. coli
E: Klebsiella pneumoniae. F: E. coli. M: Marker 100 bp
M G H I J K M2

1 kb

500 bp

Hình 3. Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR
trên vi khuẩn Gram dương
G: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. H:
Staphylococcus aureus. I: Corynebacterium diphtheriae. J:
Streptococcus faecalis. K: Bacillus subtilis. M: Marker 100
bp. M2: Marker 1 kb

Trên những vi khuẩn đại diện Gram dương
cũng cho kết qủa tương tự, các băng DNA
khuếch đại thu được đều có sự khác biệt, giúp

Chuyên Đề Dược Khoa

Nghiên cứu Y học

nhận diện tới loài nhờ vào số lượng và kích
thước của những băng khác nhau như:
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus và
Staphylococcus aureus đều cho ba băng kích thước
800, 750, 550 bp. Vi khuẩn Corynebacterium
diphtheriae cho ba băng kích thước 750, 700, 550
bp. Streptococcus faecalis cho bốn băng kích thước
730, 700, 600, 550 bp và Bacillus subtilis thì có
được ba băng ở những vị trí 730, 700, 550 bp
(Hình 3).
Ở Việt Nam, để định danh những vi khuẩn
gây bệnh, phần lớn các bệnh viện áp dụng
phương pháp cổ điển gồm nuôi cấy vi khuẩn kết
hợp với những thử nghiệm đặc tính sinh hóa.
Với những bệnh viện lớn có điều kiện thì có thể
dùng bộ kit nhóm API (20E, 20NE...), đây là bộ
kit sử dụng rất thông dụng ở những nước phát
triển. Theo một nghiên cứu năm 1981, Kenneth
E. Aldridge và cộng sự(5), đã so sánh khả năng
định danh của bộ kit này với những phương
pháp thông thường như những phản ứng sinh
hóa khi nghiên cứu 505 vi khuẩn thuộc Họ
Enterobacteriaceae gồm 202 chủng lâm sàng và
303 chủng đã được lưu trữ từ trước. Nghiên cứu
này cho thấy bộ kit API 20E thì chính xác và
nhanh hơn những thử nghiệm đặc tính sinh hóa
cổ điển. Tuy nhiên, bộ kit này cũng hiện diện
những hạn chế với sai sót khi định danh hoặc tỉ
lệ chính xác định danh yếu trên những loài vi
khuẩn khó nuôi cấy hoặc không nuôi cấy được.

Thực vậy, với việc sử dụng kit API 20E, 9 trường
hợp của Shigella sonnei được định danh là
Citrobacter freundii và trong 7 trường hợp của
Serratia marcescens được định danh là Serratia
liquefaciens, phần lớn những sai sót liên quan
những chủng tồn trữ nhưng cũng có một số
lượng có ý nghĩa chủng lâm sàng mới phân lập
bị nhầm lẫn. Mặt khác, theo một nghiên cứu gần
đây của Awong-Taylor J và cộng sự(1), để định
danh những vi khuẩn Gram dương không lên
men glucose bằng cách sử dụng bộ kit API
20NE, chỉ có 54% loài được nhận diện tới giống
và để định danh đến loài thì chỉ được 7% các
chủng. Bên cạnh đó, có tới 39% những chủng
thử nghiệm không định danh được. Với hệ

255


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

thống định danh tự động VITEK 2, các tỉ lệ
tương ứng là 53%, 1%, và 46%. Trong nghiên
cứu của chúng tôi, với số loài thử nghiệm còn ít
nhưng với 11 loài thử nghiệm bằng kỹ thuật
sinh học phân tử, tất cả đều có thể nhận định
đến loài.
Với kỹ thuật định type ribosom, chúng tôi

thấy những thuận lợi của phương pháp này như
độ chính xác cao và nhanh chóng (chỉ mất từ 5-7
giờ thao tác thay vì từ 1-2 ngày như phương
pháp cổ điển). Nghiên cứu của Fu Jun-fen năm
2002(3) thực hiện trên 27 loài vi khuẩn gồm
những vi khuẩn Gram dương thường gây
nhiễm trùng máu như Listeria monocytgenes,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Enterococcus durans...và vi khuẩn Gram âm
thường gây nhiễm trùng máu như Salmonella
typhi, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas
aeruginosa..., tất cả đều cho thấy khác biệt số
lượng, kích thước các băng khuếch đại, giúp
nhận định nhanh chóng loài (Bảng 1).
Một nghiên cứu khác của Mehwish Jamil và
cộng sự năm 2007(7), chỉ thực hiện trên vi khuẩn
Gram âm, gồm năm loài vi khuẩn gây bệnh
thuộc Họ Enterobacteriaceae (Escherichia coli,
Salmonella enterica serovar typhi (Salmonella typhi),
Proteus vulgaris, Klebsiella aerogenes và Cirtobacter
freundii) cũng như một vi khuẩn Gram âm khác
thường xuyên gây bệnh là Pseudomonas
aeruginosa. Tất cả đều được định danh một cách
nhanh chóng và dễ dàng tuy kích thước và số
lượng các băng khuếch đại có một số khác biệt
so với nghiên cứu chúng tôi, điều này do các tác
giả sử dụng những cặp mồi khác (Bảng 1).

Bảng 1. So sánh kết qủa nghiên cứu với tác giả khác
Vi khuẩn thử nghiệm
Escherichia coli
Salmonella typhi
Gram
âm

Gram
dương

Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella aerogenes
Klebsiella pneumoniae
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Citrobacter freundii
Shigella flexneri
Staphylococcus aureus
Meticillin-resistant
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidids
Streptococcus β-hemdyticus
Streptococcus faecalis
Enterococcus durans
Bacillus subtilis
Corynebacterium diphtheriae
Listeria monocytogenes

Kích thước của sản phẩm khuếch đại (bp)
Fu Jun-fen và cộng sự Mehwish Jamil và cộng sự Nghiên cứu của chúng tôi

4 băng (không nêu kích
1200, 850, 800, 700
1200, 850, 800, 700
thước)
1200, 900, 700
5 băng (không nêu kích
3000, 1200, 900, 850, 700
thước)
3150, 700
Không thực hiện
3100, 900
320
Không thực hiện
Không thực hiện
2500, 800
1200, 600

850
3000, 870, 700, 520
Không thực hiện
900, 800, 750, 700
Không thực hiện
3000, 850, 700, 580
Không thực hiện
Không thực hiện

850
Không thực hiện
850, 700, 550
Không thực hiện

1100, 900, 850, 750
Không thực hiện
1100, 800, 700
800, 750, 550

Không thực hiện

“

800, 750, 550

1200, 600
4 băng (không nêu kích
thước)
Không thực hiện
3100, 900
3 băng (không nêu kích
thước)
Không thực hiện
1500

“

Không thực hiện

“

Không thực hiện

“

730, 700, 600, 550
Không thực hiện

“

730, 700, 550

“
“

750, 700, 550
Không thực hiện

Để kết luận, trước hết thuận lợi của phương
pháp này là nhanh hơn những phương pháp
nuôi cấy và thử nghiệm các đặc tính sinh hóa
hoặc sử dụng bộ kit định danh nhiều vì có thể

256

đưa ra kết quả trong 5-7 giờ thay vì mất 36- 48
giờ. Hơn nữa, những phương pháp cổ điển có
thể cho ra một tỉ lệ sai sót cao trong khi định
danh vi khuẩn. Mặt khác, kỹ thuật định týp

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

ribosom có thể định danh những vi khuẩn
không nuôi cấy được cũng như những vi khuẩn
không lên men đường glucose. Kỹ thuật này
cũng có ưu thế hơn so với kỹ thuật PCR đơn
thuần khuếch đại trình tự gen 16S của rRNA
nếu áp dụng cho định danh, nhờ vào sự sử
dụng một cặp mồi duy nhất. Thật vậy, với kỹ
thuật PCR chỉ dựa trên trình tự gen 16S của
rRNA, chúng ta phải sử dụng những cặp mồi
đặc hiệu riêng cho từng loài hoặc nếu dùng mồi
chung cho nhiều loài thì phải kết hợp với việc
giải và so sánh trình tự sản phẩm PCR này. Do
đó, chúng tôi thấy phương pháp định týp
ribosom có thể thực hiện để định danh những vi
khuẩn gây bệnh thường gặp, góp phần vào việc
điều trị bệnh nhiễm trùng tại Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

Awong-Taylor J, Craven KS, Griffiths L, Bass C, Muscarella
M. (2008). Comparison of biochemical and molecular
methods for the identification of bacterial isolates associated
with failed loggerhead sea turtle eggs. J Appl Microbiol, 104(5):
1244-1251.
Bosshard PP, Abels S, Zbinden R, Bottger EC, Altwegg M.
(2003). Ribosomal DNA sequencing for identification of
aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory (an 18-

Chuyên Đề Dược Khoa

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Nghiên cứu Y học

month evaluation). Journal of Clinical Microbiology, 41(9): 413440.
Fu Jun-fen, Yu He-yong, Shang Shi-qiang, Hong Wen-lan, Lu
Miao-quan, Li Jian-ping. (2002). A molecular biological study
on identification of common septicemia bacteria using 16S23S rRNA gene spacer regions. Journal of Zhejiang University
(SCIENCE), 3(2): 237-242.
Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. (1994). PCR
primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of
pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal
fluid. J Clin Microbiol, 32: 335–351.

Kenneth E Aldridge, Rondy L Hodges (1981). Correlation
studies of Entero-Set 20, API 20E and conventional Media
systems for Enterobacteriaceae identification. Journal of Clinical
Microbiology, 13(1): 120-125.
Koeck JL, Chakour M, Teyssou R. (2001). Apport de la
biologie moléculaire au diagnostic bactériologique. Rev Fr
Lab, 335: 37-41.
Mehwish Jamil, Saira Bashir, Mashkoor Mohsin, Ayesha
Tariq, Aasia Bashir, Asma Haque, Yasra Sarwar, Aamir Ali,
Abdul Haque (2007). Differentiation of common Gram
negative pathogens by PCR-Ribotyping. Pak J Med Sci, 23(2):
233-237.
Mendoza M et al. (1998). Identification of Staphylococcus
species by 16S-23S rDNA intergenic spacer PCR analysis. Int J
Syst Bacteriol, 48(3): 1049-1055.
Riffard S, Lopresti F, Normand P et al. (1998). Species
identification of Legionella via intergenic 16S-23S ribosomal
spacer PCR analysis. Int J Sys Bacteriol, 48(3): 723-730.
Sogaard P, Gahrn-Hansen B, Hui-Ping Z, Frederiksen W.
(1986). An investigation of three commercial methods for
rapide identification of non-enteric gram-negative rods. Acta
Pathol Microbiol Immunol Scand Sect, 94: 357-363.

257