Nghiên cứu định lượng diltiazem trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC-MS/MS

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG DILTIAZEM TRONG
HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS
Nguyễn Văn Bạch*; Tạ Mạnh Hùng**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - khối phổ (HPLCMS/MS) để định lượng diltiazem (DIL) trong huyết tương chó. Phương pháp: chiết DIL từ huyết
tương chó bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng. Khảo sát các điều kiện sắc ký; lựa chọn nội
chuẩn; thẩm định độ đặc hiệu, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu
suất chiết, nội chuẩn và độ ổn định của DIL theo các tiêu chí của FDA. Kết quả: chiết DIL từ
huyết tương chó bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với hệ dung môi diethyleter-cloroform, nội
chuẩn là felodipin (FELO); xác định được các điều kiện sắc ký như: cột, pha động, tốc độ dòng,
detector. Phương pháp đã được thẩm định và đạt các tiêu chí theo quy định của FDA. Kết luận:
có thể sử dụng phương pháp HPLC-MS/MS để định lượng DIL trong huyết tương chó khi đánh
giá sinh khả dụng của DIL trên chó thực nghiệm.
* Từ khóa: Diltiazem; Huyết tương chó; HPLC-MS/MS.

Quantitative Determination of Diltiazem in Dogs Plasma by HPLCMS/MS
Summary
Objectives: To determine diltiazem (DIL) in dog plasma by high performance liquid
chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Methods: A liquid-liquid extraction
technique was used to extract DIL in dog plasma. Chromatographic conditions were studied;
selection of internal standard; essessment of the specificity, selectivity, the linear range, lower
limit of quantification, extraction efficiency, internal standard and stability of DIL following the
guidance of FDA. Results: DIL in dog plasma was performed by liquid-liquid extraction with
solvent mixtures diethyl ether-chloroform, felodipin as internal standard; chromatographic
conditions were established, including: column, mobile phase, a flow-rate, detector. The method
has been evaluated and achieved the FDA’s regulations. Conclusion: The HPLC-MS/MS
method can be used to determine the DIL in dog plasma, which would evaluate bioavailability of
the DIL in experimental dogs.
* Key words: Diltiazem; Dog plasma; HPLC-MS/MS.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Diltiazem là dược chất có tác dụng
chẹn kênh canxi, làm giãn động mạch vành,

cả mạch ngoại vi, làm giảm co bóp cơ tim,
làm chậm nhịp tim, được sử dụng trong
dự phòng và điều trị cơn đau thắt ngực [6].

* Học viện Quân y
** Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Bạch ()
Ngày nhận bài: 04/04/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016
Ngày bài báo được đăng: 20/09/2016

29


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Một số chức năng của hệ tim mạch có
nhịp sinh học, nên các bệnh về tim mạch
cũng có nhịp sinh học. Chúng tôi đã bào
chế thành công viên nén DIL 60 mg giải
phóng theo nhịp để đáp ứng yêu cầu
“nhịp sinh học” của loại bệnh này. Chế
phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở theo các tiêu
chí về viên nén của Dược điển Việt Nam
IV và của dạng thuốc giải phóng theo
nhịp. Việc xác định sinh khả dụng và
tương đương sinh học dựa vào các thông

số dược động học của viên nén DIL 60 mg
giải phóng theo nhịp mà chúng tôi bào
chế được là cần thiết [4]. Nhằm mục đích
đánh giá sinh khả dụng trên chó thực
nghiệm, chúng tôi tiến hành: Xây dựng và
thẩm định phương pháp HPLC-MS/MS để
định lượng DIL trong huyết tương chó [2].
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị.
* Nguyên liệu và hóa chất:
- Diltiazem hydroclorid chuẩn: hàm
lượng 99,9% (do Viện Kiểm nghiệm
Thuốc Trung ương cấp).
- Felodipin chuẩn (nội chuẩn): hàm
lượng 99,8% (do Viện Kiểm nghiệm
Thuốc Trung ương cấp).
- Viên nén DIL 60 mg giải phóng theo
nhịp (tự bào chế) đạt tiêu chuẩn cơ sở.
- Huyết tương chó trắng: do Ban
Cung cấp Động vât thí nghiệm, Học viện
Quân y cấp đạt tiêu chuẩn thử thuốc.
- Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn
cho HPLC hoặc tinh khiết phân tích.
* Thiết bị:
Máy HPLC-MS/MS TSQ Quantum
Ultra (Thermo Scientific); máy lắc GPL
3006 (Đức); cân phân tích Meller Toledo
30

có độ chính xác 0,1 mg và các dụng cụ
khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Xây dựng phương pháp:
- Xử lý mẫu huyết tương chó bằng
phương pháp chiết lỏng-lỏng. Cụ thể: lấy
1 ml huyết tương chó chứa 5 ng DIL và
250 ng FELO chuẩn cho vào ống nghiệm
chiết. Thêm 1,0 ml dung dịch amoniac 0,1 M
và 7 ml hỗn hợp dung môi diethylethercloroform (7:3). Lắc đều trong khoảng 10
phút, ly tâm, lấy lớp dung môi. Bốc hơi
dung môi dưới dòng khí nitơ, thu lấy cắn.
Hòa tan cắn trong 1 ml pha động. Sau khi
lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm vào cột
sắc ký 10 µl.
- Điều kiện sắc ký: dựa vào tài liệu [1, 5],
chúng tôi khảo sát các điều kiện sắc ký
của phương pháp HPLC-MS/MS gồm:
cột, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dòng,
thể tích tiêm mẫu và kiểu phổ khối.
* Thẩm định phương pháp định lượng
DIL trong huyết tương:
Theo hướng dẫn của FDA gồm các
phương pháp: thẩm định mẫu trắng, mẫu
chuẩn, mẫu thử và mẫu kiểm chứng.
Đánh giá các tiêu chí: độ đặc hiệu, độ
chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến
tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng,
độ lặp lại trong ngày và khác ngày, hiệu
suất chiết và độ ổn định của mẫu huyết

tương [3].
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Xây dựng và thẩm định phương
pháp định lượng DIL trong huyết
tương chó.
* Xây dựng phương pháp:
- Xử lý mẫu: so với phương pháp tủa
protein, phương pháp chiết lỏng-lỏng có


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
kiểu phổ khối: MS/MS, nguồn ion hóa
ESI (+).

nhiều ưu điểm như: tiến hành đơn giản,
dễ triển khai và giảm sai số khi tiến hành
phân tích. Vì vậy, chúng tôi chọn phương
pháp chiết lỏng-lỏng.

* Thẩm định phương pháp:
- Độ đặc hiệu và chọn lọc:

- Điều kiện sắc ký: định lượng DIL theo
phương pháp HPLC-MS/MS với các điều
kiện sau:

Xác định độ thích hợp của hệ thống
HPLC-MS/MS: tiêm lặp lại 6 lần các dung
dịch chuẩn DIL có nồng độ khoảng 400
ng/ml chứa FELO với nồng độ khoảng

250 ng/ml (mẫu spike). Xác định thời gian
lưu (TR), diện tích píc của DIL và FELO
trên sắc đồ.

Cột: C18 (50 x 3 mm; 2,1 µm); nhiệt
độ cột: 40°C; pha động: methanol-amoni
acetat 2 mM (90:10, v/v); tốc độ dòng:
0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 10 µl;

Bảng 1: Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống HPLC-MS/MS (n = 6).
DIL

FELO

STT
TR (phút)

Diện tích (mAU.S)

TR (phút)

Diện tích (mAU.S)

1

1,47

55693143

1,63

23936463

2

1,47

53010711

1,62

23615459

3

1,45

54899222

1,64

24236487

4

1,46

52599837

1,62

22777336

5

1,48

54263361

163

23849527

6

1,45

56275337

1,62

24586267

X

1,46

54456935

1,63

23833590

RSD (%)

0,83

2,7

0,50

2,6

Hệ thống HPLC-MS/MS hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt. Giá trị RSD (%) của
thời gian lưu và diện tích píc của DIL và FELO đều lần lượt nhỏ hơn 1,0% và 5,0% (giá
trị RSD cao nhất của TR là 0,83% và của diện tích píc 2,7%).
- Độ đặc hiệu và chọn lọc của phương pháp: phân tích các mẫu huyết tương trắng
và mẫu huyết tương tự tạo chứa FELO với nồng độ 250 ng/ml và DIL chuẩn với nồng
độ 5 ng/ml (bằng khoảng 1/30 đến 1/20 Cmax khi uống liều đơn 60 mg DIL).
31


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016

Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng.

Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huyết tương tự tạo chứa DIL (nồng độ 5 ng/ml) và
FELO (nồng độ 250 ng/ml).
Kết quả trên cho thấy tại các thời điểm
1,49 và 1,63 phút, không xuất hiện các

píc có mảnh phổ khối m/z = 414,5
177,8 (DIL) và m/z = 383,4
338,1
(FELO). Diện tích píc của mẫu trắng tại
các thời điểm trùng với thời gian lưu của
DIL và FELO đều bằng 0. Các píc DIL và
FELO ở mẫu LLOQ đều có tỷ lệ S/N
> 500. Vì vậy, phương pháp phân tích
32

DIL đáp ứng được yêu cầu về độ đặc
hiệu và chọn lọc theo hướng dẫn của
FDA.
- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:
Pha các mẫu DIL chuẩn trong huyết
tương chó trắng có nồng độ khoảng 5 478 ng/ml. Xác định mối tương quan giữa
nồng độ DIL với tỷ lệ diện tích píc của
DIL/ FELO trên sắc ký đồ.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Bảng 2: Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích píc của DIL/FELO và nồng độ DIL chuẩn
trong huyết tương chó.
Nồng độ (ng/ml)

4,8

9,6

23,9

Diện tích píc của
DIL (mAU.S)

1753805

3596455

9583909

Diện tích píc của
FELO (mAU.S)

28882780

29652473

31765544 27376294 27197079 29306286

Tỷ lệ diện tích píc
DIL/FELO

0,061

0,121

0,302

0,563

1,137

8,2

6,8

6,5

5,4

5,6

RSD (%)

47,9

95,7

191,5

383,0

478,7

15399556 30915949 58709102 106649051 128309847

27769163

28178456

2,003

3,841

4,553

4,7

3,5

2,8

95,7

92,0

95,9

Y = 0,0096 X + 0,097

Phương trình hồi
quy

2

R = 0,9975

Độ đúng (%)

94,4

105,4

111,5

105,8

108,1

5
y = 0.0096x + 0.097
2
R = 0.9975

TỷlệdiệntichpicDIL/FELO

4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

100

200

300

400

500

600

Nồng độ DIL (ng/ml)

Hình 3: Đồ thị đường chuẩn của DIL trong huyết tương chó.
Trong khoảng nồng độ 4,8 - 478,7 ng/ml, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ
DIL với tỷ lệ giữa diện tích píc của DIL/FELO với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 (R2 =
0,9975). Độ đúng đạt tỷ lệ cao (từ 94,4 - 111,5%), độ lặp lại tốt (2,8 - 8,2%) nằm trong
giới hạn cho phép theo quy định của FDA (±20% đối với nồng độ thấp nhất và ±15%
đối với các nồng độ còn lại).
- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):
Phân tích các mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương chứa DIL ở nồng độ
4,8 ng/ml (nồng độ thấp nhất trong khoảng tuyến tính). Xác định đáp ứng đỉnh của mẫu
chuẩn và tính nồng độ DIL trong mẫu chuẩn.
33


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Bảng 3: Kết quả xác định giá trị LLOQ của phương pháp (n = 6).
Mẫu trắng

Mẫu chuẩn LLOQ (4,8 ng/ml)

STT

Diện tích píc tại vị trí
trùng thời gian lưu
với DIL (mAU.S)

Diện tích píc
của DIL
(mAU.S)

Diện tích píc
của FELO
(mAU.S)

Nồng độ tính từ
phương trình hồi
quy (ng/ ml)

Độ đúng so với
lý thuyết (%)

1

0

1389355

22658790

4,1

95,5

2

0

1405503

23555350

3,9

92,3

3

0

1511875

22526934

4,6

106,7

4

0

1370366

22819364

4,0

93,1

5

0

1438183

22319586

4,4

101,5

6

0

1777471

30354462

3,8

90,2

X

0

1482126

24039081

4,1

96,6

7,2

7,2

RSD (%)

Tại vị trí có thời gian lưu (1,6 phút), đáp ứng của mẫu chuẩn có nồng độ 4,8 ng/ml
lớn hơn 5 lần đáp ứng của mẫu trắng. Độ lặp lại với giá trị RSD < 10,0% và độ đúng từ
90,2 - 106,7% (nằm trong giới hạn 80 - 120%). Như vậy, mẫu chứa DIL có nồng độ
4,8 ng/ml đáp ứng yêu cầu LLOQ của phương pháp phân tích dịch sinh học.
- Độ đúng - độ lặp lại trong ngày và khác ngày:
Pha các mẫu LQC (13,8 ng/ml), MQC (230,7 ng/ml) và HQC (323,0 ng/ml). Xác định
nồng độ DIL bằng phương pháp đường chuẩn và tỷ lệ (%) giữa nồng độ xác định
được từ đường chuẩn so với nồng độ lý thuyết. Kết quả xác định độ đúng, lặp lại trong

ngày và khác ngày (3 ngày phân tích khác nhau) của phương pháp như sau.
Bảng 4: Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày (n = 6).
LQC (13,8 ng/ml)

MQC (230,7 ng/ml)

Tỷ lệ diện
tích
DIL/FELO

Nồng độ
xác định
được
(ng/ml)

Độ
đúng
(%)

Tỷ lệ diện
tích
DIL/FELO

Nồng độ
xác định
được
a
(ng/ml)

1

0,161

13,8

100,0

2,327

2

0,156

13,3

96,1

3

0,148

12,5

4

0,160

5
6

STT

34

HQC (323,0 ng/ml)

(%)

Tỷ lệ diện
tích
DIL/FELO

Nồng độ
xác định
được
a
(ng/ml)

Độ
đúng
(%)

212,9

92,3

3,236

296,6

91,8

2,245

205,4

89,0

3,280

300,6

93,1

90,5

2,265

207,3

89,8

3,125

286,3

88,6

13,7

98,8

2,309

211,3

91,6

3,205

293,7

90,9

0,152

13,0

93,6

2,275

208,2

90,2

3,206

293,8

91,0

0,180

15,5

112,0

2,289

209,4

90,8

3,354

307,4

95,2

Độ
đúng

X

98,4

90,6

91,8

RSD (%)

7,6

1,3

2,4


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Bảng 5: Kết quả thẩm định độ đúng và độ lặp lại khác ngày (n = 6).
LQC
(13,8 ng/ml)
Ngày

I

II

III

MQC
(230,7 ng/ml)

HQC
(323,0 ng/ml)

Nồng độ xác
định được

(ng/ml)

Độ đúng
(%)

Nồng độ xác
định được
(ng/ml)

Độ đúng
(%)

Nồng độ xác
định được
(ng/ml)

Độ đúng
(%)

1

13,8

99,5

212,9

92,3

296,6

91,8

2

13,3

96,1

205,4

89,0

300,6

93,1

3

12,5

90,5

207,3

89,8

286,3

88,6

4

13,7

98,8

211,3

91,6

293,7

90,9

5

13,0

93,6

208,2

90,2

293,8

91,0

6

15,5

112,0

209,4

90,8

307,4

95.2

1

14,6

101,5

262,0

109,0

286,9

85,3

2

15,1

104,9

261,4

108,8

349,6

103,9

3

16,1

111,3

257,8

107,3

360,2

107,1

4

16,1

111,6

254,8

106,1

343,8

102,2

5

15,6

108,1

257,9

107,3

369,4

109,8

6

15,8

109,8

268,9

111,9

347,6

103,3

1

15,1

104,7

240,6

100,1

340,1

101,1

2

15,8

109,5

237,8

98,9

301,5

89,6

3

15,5

107,4

235,4

98,0

319,3

94,9

4

15,2

105,2

235,2

97,9

316,3

94,0

5

14,5

100,3

240,1

99,9

310,1

92,2

6

13,4

92,8

229,6

95,6

312,9

93,0

X

103,2

99,1

96,0

RSD (%)

6,7

7,7

7,2

Ở cả 3 nồng độ, phương pháp đều cho
độ đúng trong ngày và khác ngày cao
(90,6 - 103,2%) và độ lặp lại trong ngày
và khác ngày với giá trị RSD < 10%
(1,3 - 7,6% đối với độ lặp lại trong ngày
và từ 6,7 - 7,7% đối với độ lặp lại khác
ngày). Điều đó chứng tỏ: phương pháp
phân tích có độ đúng, độ lặp lại đáp ứng
được các yêu cầu của phương pháp
phân tích các chất trong dịch sinh học.

- Hiệu suất chiết của phương pháp:
+ Hiệu suất chiết FELO (nội chuẩn):

phân tích các mẫu huyết tương trắng
chó chứa FELO (nồng độ 250 ng/ml)
theo quy trình đã lựa chọn. Xác định
diện tích píc của FELO. Song song với
mẫu trên, xác định diện tích píc của
dung dịch chuẩn FELO có cùng nồng độ
được pha trong huyết tương chó đã
xử lý.
35


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
Bảng 6: Hiệu suất chiết nội chuẩn FELO (n = 6).
STT

Diện tích píc FELO (mAU.S)

Hiệu suất chiết (%)

Mẫu huyết tương (có chiết)

Mẫu spike (không chiết)

1

22764320

33476941

68,00

2

23557488

34162547

68,95

3

24427925

33172556

73,64

4

22628958

32278905

70,10

5

22428570

34564121

64,89

6

24333856

34264278

71,02

X

23356852,83

33653224,7

69,40

RSD

3,8

2,5

4,2

Hiệu suất chiết của FELO xấp xỉ 70% (69,4%), độ lặp lại của phương pháp chiết tốt
(RSD < 5%). Như vậy, quy trình xử lý mẫu huyết tương chó đã được nghiên cứu thích
hợp để chiết tách FELO.

Hiệu suất chiết DIL: phân tích các mẫu LQC, MQC, HQC của DIL có nồng độ 13,8;
230,7 và 323,0 ng/ml trong huyết tương chó. Song song với các mẫu trên, phân tích
các dung dịch chuẩn của DIL trong huyết tương chó đã xử lý có nồng độ DIL tương
ứng.
Bảng 7: Hiệu suất chiết DIL (n = 6).
Mẫu LQC (13,8 ng/ml)

Mẫu MQC (230,7 ng/ml)

Mẫu HQC (320,0 ng/ml)

STT

Mẫu
có
chiết

Mẫu
spike

Hiệu
suất
(%)

Mẫu có
chiết

Mẫu
spike

Hiệu
suất
(%)

Mẫu có
chiết

Mẫu
spike

Hiệu
suất
(%)

1

10,5

13,6

77,0

168,9

228,3

74,0

253,4

320,8

79,0

2

10,5

13,5

78,1

160,8

225,9

71,2

249,1

319,4

78,0

3

9,5

12,9

74,0

167,0

222,6

75,0

252,6

319,8

79,0

4

10,6

14,1

75,1

164,5

218,7

75,2

249,8

320,3

78,0

5

10,7

13,3

80,0

162,5

224,8

72,3

256,4

320,5

80,0

6

9,8

13,0

76,0

175,2

225,2

77,8

247,8

319,7

77,5

X

76,7

74,1

78,6

SD

2,16

2,30

0,92

RSD (%)

2,8

3,1

1,1

Ở cả 3 nồng độ, phương pháp đều cho hiệu suất chiết cao (74,1 - 78,6%) với độ lặp
lại tốt (các giá trị RSD đều < 5%). Do đó, phương pháp xử lý mẫu đã được xây dựng
phù hợp để chiết tách DIL từ huyết tương chó.
36


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
- Độ ổn định của mẫu huyết tương:
+ Độ ổn định của mẫu sau 3 chu kỳ đông và rã đông: phân tích các mẫu LQC và
HQC theo phương pháp đã xây dựng. Xác định nồng độ DIL có trong mẫu. Kết quả so
sánh nồng độ DIL trong các mẫu LQC và HQC ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) với
bảo quản sau 3 chu kỳ đông - rã đông như sau:
Bảng 8: Độ ổn định của DIL trong mẫu huyết tương chó sau 3 chu kỳ đông - rã
đông (n = 5).
Mẫu LQC (13,8 ng/ml)

Mẫu HQC (323,0 ng/ml)

Nồng độ ban
đầu (ng/ml)

Nồng độ sau đông-rã

(ng/ml)

Nồng độ ban đầu
(ng/ml)

Nồng độ sau đông- rã
(ng/ml)

(1)

(2)

(1)

(2)

1

13,8

13,3

320,2

318,6

2

13,5

13,6

321,3

315,8

3

14,1

13,4

328,8

320,7

4

14,3

12,7

317,7

312,6

5

13,6

14,0

312,9

310,5

X

13,86

13,4

320,2

315,6

RSD (%)

2,4

3,5

1,8

1,3

STT

p1,2

0,114 (> 0,05)

0,194 (> 0,05)

Nồng độ ban đầu và sau 3 chu kỳ đông - rã của DIL trong hai lô mẫu khác nhau
không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, DIL trong mẫu huyết tương ổn định
qua 3 chu kỳ đông - rã đông.
Độ ổn định dài ngày: so sánh nồng độ DIL trong mẫu LQC, HQC tại các thời điểm
ngay sau khi pha và sau 10, 20 và 30 ngày bảo quản mẫu ở nhiệt độ -350C.
Bảng 9. Kết quả độ ổn định dài ngày của DIL trong huyết tương chó (n = 5).
Kết quả định lượng DIL
Giai đoạn

STT

Mẫu LQC (13,8 ng/ml)
Nồng độ
(ng/ml)

Mẫu ban đầu

1

13,8

2

13,5

3

14,1

4

14,3

5

13,6

Thông số
thống kê

Mẫu HQC (323,0 ng/ml)
Nồng độ
(ng/ml)

Thông số
thống kê

320,2
321,3
= 13,86
RSD = 2,4%

X

328,8
317,7

= 320,2
RSD = 1,8%

X

312,9

37


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016

Sau 10 ngày

Sau 20 ngày

Sau 30 ngày

1

13,9

311,5

2

14,2

3

13,7

4

12,8

5

13,6

304,1

1

14,2

312,8

2

15,1

3

14,7

4

13,2

5

13,9

316,3

1

13,4

310,8

2

14,1

3

12,4

4

13,5

5

12,9

X = 13,64

RSD = 3,8%
p = 0,451
(> 0,05)

= 14,32
RSD = 4%
p = 0,162
(> 0,05)

X

= 13,26
RSD = 4,8%
p = 0,101
(> 0,05)

X

317,8
305,7
318,2

324,5
309,7
311,9

320,7
302,4
315,9

X = 311,46
RSD = 2,1%
p = 0,056
(> 0,05)

= 315,03
RSD = 1,8%
p = 0,199
(> 0,05)

X

= 311,3
RSD = 2,3%
p = 0,065
(> 0,05)

X

306,7

Nồng độ DIL ở các mẫu bảo quản ở nhiệt độ -350C trong vòng 10, 20 và 30 ngày so
với nồng độ DIL trong mẫu định lượng ngay khi pha khác biệt không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05). Điều đó chứng tỏ: DIL ổn định trong huyết tương trong 30 ngày bảo
quản ở nhiệt độ -350C.
KẾT LUẬN
- Đã xây dựng được phương pháp
HPLC-MS/MS để định lượng DIL trong
huyết tương chó. Chiết DIL từ huyết
tương chó bằng phương pháp chiết lỏnglỏng với hỗn hợp dung môi dietyletercloroform (tỷ lệ 7:3). Các điều kiện sắc ký

gồm: xột C18 (50 x 3 mm; 2,1 µm), nhiệt
độ cột 40oC; pha động là methanol-amoni
acetat 2 mM (tỷ lệ 90:10); tốc độ dòng
0,3 ml/phút, detector khối phổ và chuẩn
nội FELO.
- Đã thẩm định được độ đặc hiệu chọn lọc, độ đúng, độ lặp lại, khoảng
tuyến tính, giới hạn định lượng dưới,
hiệu suất chiết và độ ổn định của DIL
38

trong huyết tương chó. Quy trình đã đáp
ứng được yêu cầu của một phương
pháp phân tích trong dịch sinh học theo
quy định của FDA. Phương pháp này có
thể áp dụng để định lượng DIL trong
huyết tương chó khi nghiên cứu sinh
khả dụng và xác định các thông số
dược động học của viên nén DIL 60 mg
giải phóng theo nhịp trên chó thực
nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bialer M et al. Pharmacokinetic analysis
of two new sustained-release products of
diltiazem designed for twice- and once-daily
treatment. Biopharm Drug Dispos. 1994, 15,
pp.45-52.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016
2. Center for Drug Evaluation and

Research. Guidance for Industry Bioanalytical
Method Validation, FDA, U.S. Department of
Health and Human Services. 2001.
3. Food and Drug Administration USA.
Guidance for Industry: Q1A(R2) Stability
Testing of New Drug Substances and
Products. 2003.
4. Gaoo J. Bioanalytical method validation
for studies on pharmacokinetics, bioavailability
and bioequivalence: Highlights of the fda’s

guidance. Asian J Drug Metab Pharmacokinet.
2004, 4 (1), pp.5-13.
5. Shivram K, Shah AC, Newalkar BL,
Kamath BV. Stability indicating high-performance
liquid chromatographic method for the assay
of diltiazem hydrochloride in tablets. J Liq
Chromatogr. 1992, 15, pp.2417-2422.
6. Sista S, Lai JC, Eradiri O, Albert KS.
Pharmacokinetics of a novel diltiazem HCl
extended-release tablet formulation for
evening administration. J Clin Pharmacol.
2003, 43 (10), pp.1149-1157.

39