Nghiên cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



VÕ THỊ VIỆT TRINH



NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ







HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


VÕ THỊ VIỆT TRINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
1. TS: Phan Thị Phương Dung
2. ThS: Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương
sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW


HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện khóa luận với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời
điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân
thành của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian qua.
Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
TS. Phan Thị Phương Dung, ThS. Tạ Mạnh Hùng và Th.S Trần Lan Hương
là những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn tôi từng ngày trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị tại Trung tâm đánh giá tương đương
sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện

thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược
Hà Nội, những người đã tận tâm dạy dỗ, trang bị cho tôi các kiến thức và kỹ năng
trong học tập, nghiên cứu suốt 5 năm qua.
Chân thành cảm ơn những người anh chị em cùng những người bạn của tôi đã
luôn sát cánh, quan tâm, giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn khi thực hiện đề tài để tôi có
thể đi đến ngày hôm nay.
Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất
dành cho gia đình của tôi - những người thân yêu đã luôn tin tưởng, động viên và
chăm sóc tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên



Võ Thị Việt Trinh



MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về carbamazepin (CBZ) 2
1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý 2
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 2
1.1.3. Dược động học 3
1.1.4. Chỉ định và chống chỉ định 4

1.1.5. Một số chế phẩm trên thị trường 4
1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC 5
1.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 8
1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 8
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 8
1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 9
1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 11
1.2.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC 14
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 15
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 19
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 19
2.2. Nội dung nghiên cứu 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu 21
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích 22


2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 23
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương 27
3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 27
3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu có CBZ 31
3.1.3. Qui trình phân tích CBZ trong huyết tương 33
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 33
3.2.1. Tính chọn lọc-đặc hiệu 33
3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 35
3.2.3. Giới hạn định lượng dưới 36
3.2.4. Độ đúng – độ lặp lại trong ngày và khác ngày 37
3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp 38

3.2.6. Độ ổn định của mẫu huyết tương 41
3.3. Bàn luận 41
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC









DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CBZ : Carbamazepin
CBZ-E : Carbamazepine 10, 11- epoxide
CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control
Sample)
HT : Huyết tương
IS : Nội chuẩn (Internal Standard)
LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification)
LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control
Sample)
MeCN : Acetonitril
MeOH : Methanol

MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality
Control Sample)
P.A : Tinh khiết phân tích (pure analysis)
QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample)
SKĐ : Sắc ký đồ
SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration)
US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and
Drug Administration)
UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible)






DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Nội dung Trang
1.1 Các chế phẩm carbamazepin trên thị trường 5
1.2 Một số nghiên cứu định lượng carbamazepin trong dịch sinh học 6
2.1 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 19
2.2 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 20
2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 20
2.4 Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu 20
2.5 Chuẩn bị đường chuẩn 22
2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 22
2.7 Chuẩn bị mẫu kiểm tra xác định độ đúng 24
3.1
Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời

gian lưu của carbamazepin và nội chuẩn
35
3.2 Kết quả thẩm định đường chuẩn 35
3.3 Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới 36
3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 37
3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 38
3.6 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 39
3.7 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi carbamazepin 40
3.8
Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn nội trong thời gian
ngắn
41
3.9
Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn carbamazepin gốc dài
ngày
41
3.10
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ
đông–rã
42
3.11
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng
trong thời gian ngắn
43
3.12
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở
nồng độ thấp
44
3.13
Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở

nồng độ cao
44
3.14 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu sau xử lý 45


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình Nội dung Trang
1.1 Cấu trúc cột LC-DB 12
1.2 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 13
3.1 Phổ hấp thụ UV – VIS của carbamazepin 27
3.2 Sắc ký đồ khảo sát trimetazidin làm nội chuẩn 28
3.3 Sắc ký đồ khảo sát olanzapin làm nội chuẩn 28
3.4 Sắc ký đồ khảo sát acid fenofibric làm nội chuẩn 28
3.5 Sắc ký đồ khảo sát propylparaben làm nội chuẩn 28
3.6
Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH :
đệm phosphat pH 7,0 (60:40) và tốc độ dòng 1,0 mL/phút
30
3.7
Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH :
đệm phosphat pH 7,0 (58:42) và tốc độ dòng 1,0 mL/phút
30
3.8
Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH :
đệm phosphat pH 7,0 (58:42) và tốc độ dòng 1,3ml/phút
30
3.9
Sắc ký đồ mẫu chuẩn carbamazepin và nội chuẩn với quy trình xử lý
mẫu được chọn
32

3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 34
3.11
Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn carbamazepin (nồng
độ 0,1µg/mL) và nội chuẩn
34


1



ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh động kinh được định nghĩa là sự rối loạn từng cơn chức năng của thần
kinh trung ương do sự phóng điện đột ngột, quá mức, đồng thời của các neuron.
Bệnh xuất hiện ở tất cả mọi nơi trên thế giới và có thể ở mọi lứa tuổi. Trong số các
bệnh nhân động kinh, khoảng 50% trẻ em có vấn đề khó khăn về nhận thức, 6%
bệnh nhân có bất thường về vận động, 6% rối loạn tâm thần nặng, 1/15 bệnh nhân
phụ thuộc vào người khác cho các công việc hằng ngày vì lý do bệnh động kinh và
mức độ tàn phế liên quan đến nó. Trên thế giới người mắc bệnh động kinh chiếm
khoảng 0,5% dân số và tại Việt Nam khoảng 2% dân số bị động kinh trong đó gần
60% số bệnh nhân là trẻ em [1], [20], [26].
Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong những
thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị bệnh động kinh, đặc biệt là động kinh cục bộ và
động kinh thể co cứng giật rung. Tuy nhiên khoảng điều trị của carbamazepin hẹp,
cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ và có nhiều trường hợp bệnh
nhân ngộ độc thuốc. Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thường thể hiện rất
rõ và phức tạp. Do đó việc nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, dược lâm
sàng của các chế phẩm carbamazepin, đặc biệt kiểm soát nồng độ carbamazepin
trong huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể là hết
sức cần thiết. Tại Việt Nam, năm 2010, Bộ Y Tế đã quy định các thuốc chứa hoạt

chất carbamazepin phải có báo cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo
mới được cấp phép đăng ký và lưu hành trên thị trường Việt Nam [7].
Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ carbamazepin trong
huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học
các chế phẩm chứa hoạt chất carbamazepin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao” với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết
tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA.
2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định của US-FDA.
2



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CARBAMAZEPIN (CBZ)
1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý
1.1.1.1. Công thức cấu tạo


- Công thức phân tử: C
15
H
12
N
2
O.
- M=236,27g/mol.
- Tên khoa học: 5H-Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide [10], [21].
1.1.1.2. Đặc điểm hóa lý

- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng.
- Rất khó tan trong nước và ether, hơi tan trong aceton và ethanol (96%), dễ tan
trong dicloromethan, methylen clorid, chloroform.
- Nhiệt độ nóng chảy: 189-193
°
C [3], [5], [10], [14].
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
Carbamazepin là một hợp chất iminostilben - nhóm cấu trúc dibenzazepine, là
một trong những thuốc cơ bản trong điều trị động kinh cục bộ và động kinh co
cứng-giật rung. CBZ làm ổn định tình trạng quá kích thích tại màng thần kinh, kìm
hãm sự phóng lặp lại các xung thần kinh, giảm sự dẫn truyền synap của các xung
kích thích. Sự ức chế cảm ứng điện dòng Na
+
có thể là cơ chế hoạt động chính của
CBZ, nhờ đó CBZ có thể ức chế sự chuyển vận catecholamin, quá trình giải phóng
glutamate [2], [4], [23].
Tác dụng chống co giật của CBZ đặc biệt hiệu quả ở các bệnh nhân động kinh
cục bộ phức hợp tuy nhiên không hiệu quả trong động kinh cơn vắng. CBZ làm tăng
3



ngưỡng động kinh, làm giảm nguy cơ co cứng và giảm các triệu chứng cai nghiện
rượu.
CBZ có tác dụng hướng tâm thần, nâng cao tâm trạng ở một số bệnh nhân
trầm cảm bị động kinh và điều trị phối hợp với các thuốc chống loạn thần trong giai
đoạn cấp tính của bệnh tâm thần phân liệt. CBZ cũng có tác dụng điều trị bệnh rối
loạn lưỡng cực, đặc biệt trong trường hợp bệnh nhân không đáp ứng điều trị với cả
lithium và valproat.
Ngoài ra, CBZ còn có tác dụng giảm đau do thần kinh như đau dây thần kinh

sinh ba, giảm triệu chứng đau mãn tính phát sinh từ các hội chứng thần kinh ngoại
vi khác [2], [4], [9].
1.1.3. Dược động học
Sau khi uống, CBZ hầu như được hấp thu hoàn toàn, tuy chậm và thất thường.
Thời gian cần để đạt tới nồng độ đỉnh trong máu sau khi uống CBZ dạng viên nén,
hỗn dịch, viên nén giải phóng kéo dài, viên nang giải phóng kéo dài lần lượt là:
4,5h; 1,5h; 3-12h và 4,1-7,7 giờ.
Thuốc phân phối nhanh vào mô, rộng khắp cơ thể, phát hiện có trong dịch não
tủy, não, dịch tá tràng, mật, nước bọt, cả nhau thai và sữa mẹ. Tỷ lệ liên kết với
protein huyết tương: 75-78%, nồng độ thuốc trong dịch não tủy tương đương trong
huyết tương. Thể tích phân bố là: 0,88  0,06 lít/kg ở người lớn và 1,2  0,2 lít/kg ở
trẻ em.
Cơ chế chuyển hóa của CBZ không hoàn toàn sáng tỏ, theo nghiên cứu thì con
đường chuyển hóa chính là quá trình oxy hóa bởi CYP3A, chủ yếu tạo thành
carbamazepin-epoxid (CBZ-E) là một chất chuyển hóa có hoạt tính. Ở người lớn,
CBZ-E có trong máu với nồng độ từ 10 - 15% nồng độ của hợp chất mẹ, ở trẻ em là
20%. CBZ-E có thể gây độc thần kinh, đặc biệt khi dùng thuốc đồng thời với
phenytoin hoặc phenobarbital và việc tăng tỷ lệ epoxid có thể giải thích độc tính
thần kinh của CBZ ở nồng độ điều trị trong huyết thanh.
4



Thải trừ: CBZ-E tiếp tục chuyển hóa thành hợp chất bất hoạt và đào thải vào
nước tiểu. Chỉ có 3% CBZ bài tiết không thay đổi trong nước tiểu ở dạng không
chuyển hóa, ở phân tỷ lệ này là 15%. Thời gian bán thải:
- CBZ: Liều ban đầu :25 giờ đến 65 giờ. Liều lặp lại (sau 3-5 tuần) : 12 giờ
đến 17giờ (do quá trình tự cảm ứng của CBZ trong 3-5 tuần đầu).
- CBZ-E: 6,1 giờ [2], [9], [23].
1.1.4. Chỉ định và chống chỉ định

1.1.4.1. Chỉ định:
- Bệnh động kinh: Ðộng kinh cục bộ có triệu chứng phức tạp (động kinh tâm thần
vận động và động kinh thùy thái dương), động kinh lớn (co giật cứng toàn bộ). Các
kiểu động kinh hỗn hợp gồm các loại trên, hoặc các loại động kinh cục bộ hoặc toàn
bộ khác.
- Ðau do nguyên nhân thần kinh: Giảm đau do dây thần kinh sinh ba và giảm đau
dây thần kinh lưỡi hầu, đau trong zona, giang mai thần kinh….
- Dự phòng bệnh hưng - trầm cảm (không đáp ứng với liệu pháp thông thường).
- Ðiều trị hội chứng cai rượu.
1.1.4.2. Chống chỉ định
- Loạn chuyển hóa porphyrin cấp tính.
- Quá mẫn với CBZ hoặc dị ứng với các thuốc có cấu trúc liên quan như các thuốc
chống trầm cảm ba vòng.
- Block nhĩ - thất.
- Người có tiền sử loạn tạo máu và suy tủy.
- Người mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu [2], [4].
1.1.5. Một số chế phẩm trên thị trường
Các chế phẩm CBZ trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng
200mg. Ngoài ra còn có các dạng viên nén nhai, viên nén giải phóng kiểm soát, viên
nang giải phóng chậm, hỗn dịch uống với hàm lượng 100, 200 hoặc 300 mg cho
phù hợp với nhu cầu người sử dụng. Một số chế phẩm chứa CBZ trên thị trường
được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 sau:
5



Bảng 1.1. Một số chế phẩm CBZ trên thị trường [24], [25].
1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC
Hiện nay, định lượng CBZ nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang
hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định lượng CBZ trong dịch

sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác như HPLC, điện di mao quản,
phóng xạ miễn dịch [12], [13]. Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn
STT

Dạng bào chế Tên biệt dược Hàm lượng

Nhà sản xuất

1

Viên nén
Tegretol 200mg Novartis
Carbadac 200mg Cadila Heathcare
Calzepin 200mg Hovid Sdn. Bhd
Carbamazepin-200 200mg
Công ty CP dược
phẩm ECO
Carbamazepin 200mg
Sishui Xier Kang
Pharmaceutical.Co.Ltd

Carbamazepin
tablet BP 200mg
200mg Flamingo Pharm.Ltd
Carbatol 200 200mg Torrent Pharm.Ltd
2 Viên nén nhai Tegretol 100mg Novartis
3
Viên nén giải
phóng kiểm
soát

Tergetol-CR
100mg
200mg
Novartis
4
Viên nang giải
phóng chậm
Carbatol
200mg
300mg
Shire US
5 Hỗn dịch uống

Carbamazepin
suspension
100mg/5ml

Alpharma
6



được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số phương pháp
định lượng CBZ trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng CBZ trong dịch sinh học.
Nhận xét:
Phương pháp 1: Phương pháp cho độ nhạy cao và thời gian chạy sắc ký là 8
phút, thuận lợi cho quá trình phân tích. Tuy nhiên dung môi chiết chỉ sử dụng
cloroform – khó bay hơi nên có nhược điểm thời gian cô dài, dễ tạo nhũ tương gây
khó khăn cho quá trình chiết. Ngoài ra chất chuẩn nội 5 (p-metylphenyl) -5-

phenylhydantoin của phương pháp không phổ biến, một chất hiện tại phòng thí
nghiệm chúng tôi chưa có nên khó có thể áp dụng phương pháp vào nghiên cứu
.
TT/
Tài
liệu
Mẫu
Xử lý
mẫu
IS
Điều kiện sắc ký
Cột Pha động Detector

1
[15]
Huyết
tương
người
Chiết
lỏng-lỏng
bằng
chlorofom
5 (p-
metylphenyl) -5-
phenylhydantoin

µ-Bondapark
C18
(30cm×4mm)
Acetonitril:

nước = 37:63
(v/v)
Tốc độ dòng:
1,5ml/phút
UV,
λ 254 nm

2
[18]
Huyết
tương
người
Chiết pha
rắn (SPE)
phenobarbital
Bakerbond-
BDC C18
(250mm x 4.6
mm)
Acetonitril :
10mM đệm
phosphat pH
7,0 = 30 :70
(v/v)
Tốc độ dòng:
1,5mL/phút
UV,
λ 210 nm

3

[17]
Huyết
tương
thỏ
Tủa
protein
bằng
methanol
(MeOH)
propylparaben
µ-Bondapark
C18
(150mm×4,6
mm)
MeOH:
nước=50:50
(v/v)
Tốc độ dòng:
1ml/phút
UV,
λ 285nm

7



Phương pháp 2: Phương pháp cho độ chính xác cao (92,09% - 108,5%),
khoảng nồng độ tuyến tính từ 0.2-25 µg/mL, thời gian chạy sắc ký ngắn (khoảng 8
phút). Tuy nhiên sử dụng quy trình xử lí mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi
phí cao. Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương

pháp này gặp nhiều khó khăn do không đủ kinh phí mua cột chiết và trang thiết bị
chiết pha rắn. Vì vậy phương pháp này khó có thể áp dụng ngay ở nước ta hiện nay
.
Phương pháp 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung môi
MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa sạch, pic
của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ và thời gian lưu của
chuẩn nội khoảng 11,4 phút gây kéo dài thời gian phân tích, không thuận lợi cho
quá trình phân tích nhiều mẫu trong ngày.
Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý
hóa của CBZ, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội
chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân
tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm
nghiệm của Việt Nam.

We used a Model 601 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk,
Conn. 06856) high-pressure liquid









8

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,
loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [6], [8].
1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh
được áp suất (thường 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng
ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký.

Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung
môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hòa
tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí).

Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ
thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay)
hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.

Cột sắc ký
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy
ra quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa
chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký.
Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích quá trình sắc ký. Nói

chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm.

Bộ phận phát hiện (Detector)
9



Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp, thường có các loại sau: Detector hấp thụ UV-
VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [6], [8].
1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký
1.2.3.1. Thời gian lưu t
R
& Thể tích lưu V
R


Thời gian lưu (t
R
)
Thời gian lưu (t
R
) của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến
lúc xuất hiện đỉnh của pic.
Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó là hằng số đối với
một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu
thực (t
R

’), được tính bằng công thức sau:
t
R
’ = t
R
– t
M.

Với: t
M
là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.
Nếu t
R
quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu t
R
quá lớn thì pic bị loãng, thời gian
phân tích kéo dài.

Thể tích lưu (V
R
)
Thể tích lưu (V
R
) là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ.
V
R
= t
R
×F

c
Với: F
c
là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian.
Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu
đến khi ra khỏi hệ thống [6], [8].
1.2.3.2. Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung
bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.
K =





Trong đó: C
S

và C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động
10



Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất
pha tĩnh, nhiệt độ.
Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [6].
1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai

pha và được tính theo sức chứa của cột:
k’ = k x




=




=
′



=







Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc: bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ,
đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho:
1≤ k ’≤8 [6], [8].
1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số

chọn lọc α :
α =




=
′

′

=

()



()



Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α>1
Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [6], [8].
1.2.3.5. Hệ số đối xứng của pic F
F =



Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [6], [8].
1.2.3.6. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:
 = 16[



]

ℎ = 5,54[





]


Trong đó: W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [6], [8].
11



1.2.3.7. Độ phân giải R
s
của cột
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

R
s
=
.(
(

)


(

)

)




hoặc
,.(
(

)


(

)

)


/

/

Trong đó:
t
(R)A
; t
(R)B
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).
W
A
; W
B
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W
1/2A
; W
1/2B
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: R
S
> 1; giá trị tối ưu R
s
= 1,5 [6], [8].
1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.2.4.1. Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách
của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký

được chia thành 2 loại:
- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân
tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.
- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích
thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al
2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ
pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:
12



- R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH2-
NH2, alkyl nitril – CH
2
– CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha
thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [16].
- Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế
bằng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-
R của mạch carbon (C
2
;C

8
;C
18
) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm
OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít
phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để
phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [6].
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những
nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH
phân tích.
Trong môi trường quá acid, pH < 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi
nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác
với cột.
Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất
tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –Si-
C
18
, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là
hiện tượng kéo đuôi. Kết quả giảm đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như
trimethylclorosilan ClSi(CH
3
)
3
hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác
với nhóm –OH này. Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc cột LC-DB
13

Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần
tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH
3
)
2
-C
18
bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH,
được trình bày ở hình 1.2.

Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C
18
một số nhóm phân
cực để tăng thêm độ phân cực của dây C
18
làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn
đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS–Expended Polar Selectivity) [16].
1.2.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của
chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký
như: độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R

s
, độ rộng của đáy pic… nên việc
phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.

Yêu cầu của 1 pha động
- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.
- Hòa tan chất cần phân tích.
- Có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.

Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả
- Bản chất của dung môi để pha pha động.
14



- Thành phần các chất trong pha động.
- pH của pha động.
- Tốc độ dòng của pha động.

Chọn đệm – pH:
Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử
dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ
làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.

Tốc độ dòng của pha động:
Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá
trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được
tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [16].

1.2.4.3. Lựa chọn Detector
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển
thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UV-
VIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác
nhau [16].
1.2.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC
1.2.5.1. Cách đánh giá pic
- Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc
dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.
- Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều
cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.
1.2.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp
chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp
chuẩn hóa diện tích.
15



Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng
thuốc trong huyết tương. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược
điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra
do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có
hàm lượng chất cần định lượng thấp.

Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử
những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký
trong cùng điều kiện.


Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời
gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là:
- Chuẩn hóa 1 điểm.
- Chuẩn hóa nhiều điểm. Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu có nồng độ
chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng nhau. Tiến
hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa
tỷ số diện tích (hay chiều cao) pic của chất chuẩn với chuẩn nội (S
S
/ S
IS
) so với tỷ
số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (C
S
/ C
IS
). Dựa vào đường chuẩn để tìm ra
nồng độ chất thử [6], [8].
1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC
1.3.1. Khái niệm
Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để
đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm
16

chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực
hiện phân tích những mẫu được khảo sát.
Quá trình phân tích mẫu sinh học thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như
lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp, lẫn nhiều tạp là các chất nội
sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá
thể, do vậy phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng
vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [11], [19], [22].
1.3.2. Nội dung thẩm định phương pháp
1.3.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu
Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất
cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở
khác. Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể
nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác.
Tính chọn lọc-đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên sắc ký đồ cho
các đáp ứng pic thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:
- Pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp.
- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích
không được vượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ.
- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được
vượt quá 5% đáp ứng của IS [11], [19], [22].
1.3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay
chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính
là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng
tuyến tính.
Đường chuẩn phải có ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một
mẫu dịch sinh học. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của

các mẫu phân tích. Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy:
17



y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân
tích hồi quy (phương pháp bình phương tối thiểu)
Đường chuẩn đạt yêu cầu của thẩm định phải thỏa mãn các điều kiện sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85-115%, trừ tại
điểm LLOQ được chấp nhận 80% -120%.
- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó
LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.
- Có hệ số tương quan r ≥ 0,98 [11], [19], [22].
1.3.2.3. Độ đúng - Độ chính xác
* Độ đúng
Độ đúng của phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả phân tích
với giá trị thực của mẫu đã biết.
Độ đúng của phương pháp phân tích đạt khi tại mỗi nồng độ phải nằm trong
khoảng từ 85% đến 115%, trừ giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép từ
80 – 120% [11], [19], [22].

Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết
quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu
thử đồng nhất. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày,
được biểu thị bằng giá trị của hệ số biến thiên CV(%).
Độ chính xác của phương pháp phân tích đạt yêu cầu khi thỏa mãn 2 điều kiện sau:
- Độ lặp lại trong ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15%.
- Độ lặp lại giữa các ngày: Giá trị CV% phải ≤ 15% [11], [19], [22].
1.3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ
đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy độ
đúng và độ chính xác của phương pháp.
Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ
nếu thỏa mãn: