Tổng hợp 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2-h-indol-2-on (tạp chất A) của diclofenac natri để làm chất đối chiếu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

TỔNG HỢP 1-(2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2HINDOL-2-ON (TẠP CHẤT A) CỦA DICLOFENAC NATRI
ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU
Nguyễn Thị Thanh Trà*, Hà Di u Ly**, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Trần Thành Đạo*

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Sự có mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất nhỏ trong nguyên liệu hay các chế phẩm thuốc đều
ảnh hưởng đến hiệu quả và mức độ an toàn của dược phẩm. Do vậy, x{c định giới hạn tạp chất liên quan là một
yêu cầu không thể thiếu trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm của các thuốc.
Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (Tạp
chất A) của Diclofenac dùng trong kiểm nghiệm.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp A của diclofenac được tổng hợp từ natri diclofenac bằng phản
ứng oxi hóa đóng vòng trong môi trường acid, xúc tác ánh sáng và sự hỗ trợ vi sóng. Sản phẩm được tinh chế
bằng sắc ký cột (Si-60) v| x{c định cấu trúc sản phẩm bằng phương ph{p phổ nghiệm UV, IR, MS và 1H-NMR
và 13C-NMR.
Kết quả: Tổng hợp được tạp A diclofenac độ tinh khiết cao h|m lượng 98,21% so với tạp chuẩn A (USP).
Kết luận: Quy trình điều chế tạp A diclorofenac đơn giản có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm
với hiệu suất khoảng 53%. Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt yêu cầu chất lượng đối với nguyên liệu đối chiếu.
Từ khóa: Tạp A diclofenac, tổng hợp, tạp đối chiếu

ABSTRACT
SYNTHESIS OF 1- (2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H-INDOL-2-ONE (IMPURITY A)
OF DICLOFENAC SODIUM AS REFERENCE MATERIAL
Nguyen Thi Thanh Tra, Ha Dieu Ly, Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Thanh Dao
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 521 - 527
Background: The presence of very small amounts of impurities in the active ingredients or in the dosage
forms may affect the effectiveness and safety to the patients. Therefore, determining the level of related impurities
is an indispensable requirement in the specifications of substances and products.

Objectives: Setting up a prosedure for synthesis of 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one used
as reference impurity for testing quality of diclofenac medicines.
Methods: A impurity of diclofenac was synthesized from sodium diclofenac by oxidation in acide medium
under accelerated by microwave and sunlight. The product was purified by column chromatography (Si-60) and
the structure of final product was determined by UV, IR, MS and 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy.
Results:A impurity of diclofenac was obtained with a high purity of 98.21% compared to standard A
impurity (USP).
Conclusions: A simple procedure for synthesis of diclofenac A impurity was developted successfully in
laboratory conditions with an overall yield of 53%. The product has a high purity of 98.21% which satisfies
requirements for establishment of reference materials.
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
** Viện Kiểm nghiệmThuốc, Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Th|nh Đạo
ĐT: 0903716482

Chuyên Đề Dƣợc

Email:

521


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Keywords: Diclofenac A impurity, synthesis, reference impurity
báo này chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp 1ĐẶT VẤN ĐỀ
(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on
Hiện nay, c{c nh| m{y dược phẩm trong

(Tạp chất A của diclofenac natri) hướng đến thiết
nước đều sản xuất thuốc với nguồn nguyên liệu
lập chất tạp đối chiếu.
chủ yếu là nhập khẩu. Do đó, kiểm nghiệm chất
ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
lượng nguyên liệu l| điều hết sức cấp thiết, đặc
biệt là tạp chất liên quan. Yêu cầu nghiêm ngặt
Dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydrovề tạp chất đã được các tổ chức quốc tế đưa ra v|
2H-indol-2-on còn gọi là tạp A của diclofenac.
là một trong những chủ đề chính trong các hội
Hóa chất
nghị quốc tế để thống nhất các nguyên tắt như
Nguyên liệu diclofenac natri, Số lô: DA006;
Q3A (R), Q3B (R) và Q3C của ICH.
hạn dùng: 2/2017; nơi sản xuất: Ấn Độ. Tạp A
Sựcó mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất
diclofenac natri chuẩn USP, Số lô: USP/LOM 175,
nhỏ cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu lực và mức
h|m lượng 99%, nguyên trạng. Methanol
độan toàn của dược phẩm. Các tạp chất chuẩn
(HPLC), ethyl acetat (PA)của JT Baker, acid
dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu hiện vẫn
phosphoric 85%, acid hydrocloric 37%, acid
chưa được tổng hợp và sản xuất nhiều tại Việt
sulfuric 98%, natri dihydro phosphat PA, bản
Nam, nếu phải mua thì rất đắt và phụ thuộc
mỏng silica gel F254 (Merck), silica gel cỡ hạt 60nhiều từ bên ngoài và mất thời gian đặt mua, do
200mm dùng cho sắc ký cột.
đó, đ}y l| vấn đề được nhiều xí nghiệp dược
Thiết bị

Việt Nam quan tâm.
Lò vi sóng Hitoshi G-475AW, máy hồng
Diclofenac, thuộc nhóm kháng viêm, giảm
ngoại Thermo-Science, máy sắc ký lỏng
đau không steroid l| một trong những nhóm
Shimadzu LC-20A với detector PDA, máy DSCthuốc được sử dụng nhiều nhất. Theo BP 2014,
Q20, m{y đo khối phổ tứ cực LC-MS/MS Agilent
diclofenac có 5 tạp chất li n quan, trong đó tạp A
1200 nguồn ESI, cột Inersil C18 (250 mm x 4,6
là vừa là sản phẩm trung gian vừa là sản phẩm
mm, 5 m), m{y đo cộng hưởng từ hạt nhân
phân hủy trong quá trình sản xuất(2). Vì vậy,
Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, viện Hàn lâm
trong dược điển USP, BP và EP hiện hành, qui
KH&CN Việt Nam).
định phảikiểm soát tạp Atrong nguyên liệu và
Phƣơng pháp nghiên cứu
thành phẩm.
Tạp diclofenac được tổng hợp theo sơ đồ
Với mong muốn tạo ra chất chuẩn tạp phục
1.
vụ cho công tác kiểm nghiệm để giảm chi phí
sản xuất cũng như gi{ th|nh sản phẩm, trong bài

Sơ đồ 1: Phản ứng tổng hợp tạp A của diclofenac

522

Chuyên Đề Dƣợc

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
Giai đoạn 1
Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành
diclofenac để hạn chế tối đa tạp hình thành trong
phẩn ứng tổng hợp tiếp theo(2,3).
Cân khoảng 12 g diclofenac natri, thêm
khoảng 500 ml dung dịch HCl 10% vào bình
Bucher 1L, khuấy mạnh liên tục. Kết tủa dạng
acid của diclofenac xuất hiện. Lọc lấy tủa. Kết
tinh diclofenac trong 300 ml methanol, sấy sản
phẩm ở 60oC trong 12 giờ. Sản phẩm thu được
đem đo phổ IR v| DSC để định tính v| x{c định
độ tinh khiết (điểm chảy diclofenac là 178,8oC)(5).

Giai đoạn 2: Tổng hợp tạp A từ diclofenac
Dựa theo các tài liệu đã nghi n cứu,
diclofenac trong môi trường acid, dưới t{c động
của vi sóng sẽ xảy ra phản ứng đóng vòng hình
thành tạp A(2,3,4). Cố định tỷ lệ (g/ml) chất nền
diclofenac và thể tích acid sulfuric là 1: 10. Tiến
hành khảo sát các công suất lò từ 50W, 150W,
250W, với nồng độ acid sulfuric lần lượt là 20%,
30%, 40% và 50% và thời gian phản ứng ở các
khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút để chọn ra
điều kiện tổng hợp thích hợp nhất.
Tinh chế: Sản phẩm tổng hợp được tinh chế
qua sắc kí cột tr n pha tĩnh hấp phụ (silica gel Si60), dung môi rửa giải ethyl acetat 100%.
X{c định cấu trúc: X{c định bằng c{c phương
pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, IR cũng

như so s{nh c{c số liệu phổ có được với tài liệu
tham khảo(3).
Xác định độ tinh khiết: Độ tinh khiết của sản
phẩm tổng hợp được x{c định bằng HPLCvới
điều kiện sắc ký tu}n theo điều kiện kiểm
nghiệm tạp A trong nguyên liệu diclofenac natri
của USP 35(6).
Dung dịch đệm phosphat pH 2.5: Trộn đều 2
thể tích tương đương acid phosphoric 0.01 M v|
natri hydrophosphat 0.01 M.
Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm
phosphat pH 2.5 (700:300).

Chuyên Đề Dƣợc

Nghiên cứu Y học

Dung môi: Methanol:Nước (70:30)
Cột: d|i 0.25 m, đường kính 4.6 mm
Pha tĩnh: octylsilyl silica gel (5 µm).
Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm
phosphat pH 2.5 (700:300).
Tốc độ dòng:1 ml/phút.
ước sóng phát hiện: 254 nm.
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.
Sử dụng chế độ Max plot giúp phát hiện các
pic tạp chất trên toàn thang sóng 190 – 800 nm.
Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic để
x{c định độ tinh khiết pic.

KẾT QUẢ
Gi i đoạn 1: Chuyển hoàn toàn diclofenac natri
thành diclofenac dạng acid
Thu được 9,8 g kết tinh trắng, bông xốp. Phổ
IR cho c{c dao động đặc trưng tương ứng với
diclofenac, điểm chảy 178,8oC phù hợp với điểm
chảy diclofenac. Tiến hành đo DSC để x{c định
độ tinh khiết của sản phẩm là 99,5 %.
Gi i đoạn 2: Tổng hợp tạp A của diclofenac

Khảo sát yếu tố công suất lò vi sóng
Cân khoảng 1,0 g diclofenac thu được vào 3
bình nón 100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4
20%, tiến hành phản ứng lần lượt với 3 công suất
50W, 150W, 250W trong 2 phút. Mỗi phản ứng
thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến
hành HPLC, sử dụng tạp chuẩn A của diclofenac
làm chất đối chiếu. x{c định hiệu suất phản ứng
dựa vào % diện tích pic của tạp A trên sắc ký đồ.
Lấy khoảng 1 ml dung dịch phản ứng chiết bằng
5 ml x 2 lần cloroform, l|m bay hơi dịch
cloroform cắn hòa tan trong pha động theo điều
kiện HPLC (Hình 1).
Tạp
được hình thành nhiều nhất ở công
suất 150W, trong khi ở công suất 250W sau 10
giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn toàn.
Chọn công suất 150W là công suất để thực hiện
phản ứng.

523


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

50W

150W

Hình 1: Kết quả khảo sát công suất phản ứng

Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch H2SO4
Cân khoảng 1,0 g diclofenac vào 4 bình nón
100 ml, thêm vào mỗi bình lần lượt 10 ml dung
dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau (20%, 30%,
40% và 50%). Tiến hành phản ứng ở công suất
150W trong 2 phút. Mỗi phản ứng thực hiện 3

lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC
để x{c định hiệu suất phản ứng.
Tạp được hình thành nhiều nhất với dung
dịch H2SO4 40%, trong khi dung dịch H2SO4 50%,
sau 20 giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn
toàn. Chọn dung dịch H2SO4 40% để thực hiện
phản ứng tổng hợp.

Hình 2: Kết quả khảo sát nồng độ acid sulfuric phản ứng

524

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

Khảo sát yếu tố thời gian phản ứng

Hình 3: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng
Cân khoảng 1 g diclofenac vào 5 bình nón
100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4 40%
tiến hành phản ứng ở công suất 150W lần lượt
trong các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút.
Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu
phản ứng tiến h|nh HPLC để x{c định hiệu
suất phản ứng.
Tạp diclofenac được tạo thành nhiều nhất
với thời gian 8 phút. Ở thời gian sau 10 phút các
tạp khác bắt đầu xuất hiện nhiều.
Qui trình tổng hợp tạp A diclofenac
Cân khoảng 6g diclofenac vào bình nón
200ml, thêm vào 60 ml dung dịch H2SO4 40%, đặt
vào lò vi sóng ở công suất 150W trong 8 phút,
hỗn hợp phản ứng tạo th|nh thu được khối dẻo
màu vàng (5,4 g). Hiệu suất khoảng 90%.

Tinh chế

Sắc ký cột (50 x 10 cm), silica gel (60-200 µm),
dung môi rửa giải ethyl acetat, kiểm tra các phân
đoạn bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat -

Chuyên Đề Dƣợc

methanol (8:2), phát hiện vết bằng đèn UV 254
nm, đối chiếu với vết của chuẩn tạp A diclofenac
của USP, thu được ph}n đoạn có chứa tạp A (3,2
g) ký hiệu DFA. Hiệu suất của toàn bộ quá trình
tổng hợp và tinh chế là 53,3%.
Xác định cấu trúc

Tính chất
Tinh thể màu trắng, điểm chảy: 251 oC(6). .
Phổ IR cho c{c dao động ở 1731cm-1 (nhóm
C= O của vòng lactam), 1612 cm-1 (C-N), và 782,
749 cm-1 (C-Cl), ứng với phổ IR của tạp A của
diclofenac USP. Phổ ESI-MS của sản phẩm tổng
hợp có m/z = 299,9958 [M+Na]+; M phù hợp với
công thức phân tử của tạp A: C14H9Cl2NO (M =
278,1338). Phổ 1H-NMR của DFA cho các tín hiệu
cộng hưởng của vòng 2,6 diclorophenyl: [H =
7,51ppm (d; 2H; J = 8,0 Hz), H-3’; H-5’+, *H = 7,34
ppm (t; 1H; J = 6,5 Hz và J = 7,0 Hz), H-4’+; Vòng
1,3 dihydro - 2H -indol - 2 on: [H = 7,38 ppm (d;
1H; J = 8,0 Hz), H-9], [H = 7,20 ppm (t; 1H; J = 7,5
Hz và J = 7,5 Hz), H-8], [H = 7,09 ppm (t; 1H; J =

525

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

7,5 Hz và J = 7,5 Hz), H-7], [H = 6,40 ppm (d; 1H;
J = 7,5 Hz), H-6] và 2 proton methylen -CH2 ở C-3
có H = 3,78.
Phổ 13C-NMR của DFA cho các tín hiệu cộng
hưởng:173,6 (C-2); 35,73 (C-3); 124,3 (C-4); 143,3
(C-5); 109,2 (C-6); 129,03 (C-7); 123,05 (C-8); 124,8
(C-9); 135,5 (C-1’); 130,5 (C-2’, C-6’); 130,8 (C-3’,
C-5’); 127,9 (C-4’).Từ các kết quả phổ MS, IR, và
NMR, khẳng định DF điều chế được là tạp A
(1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2on) của diclofenac natri.

Pha dung dịch tạp A có nồng độ 500
µg/ml. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần. kết quả
RSD của các thông số sắc ký đều nhỏ hơn 2%,
As trong khoảng 0,8 – 1,5; Rs ≥ 1,5. Như vậy
qui trình x{c định độ tinh khiết tạp đạt tính
phù hợp hệ thống.

Hàm lượng của tạp A
Theo điều kiện triển khai HPLC, h|m lượng
của tạp A tổng hợp được l| 98,21% được nối từ
chuẩn USP số lô LOM 175, hàm lượng 99%,
nguyên trạng.

Xác định độ tinh khiết của tạp A

Tính phù hợp của h thống

Hình 4: Sắc ký đồ của DFA

BÀN LUẬN
Tạp A của diclofenac natri là sản phẩm
đóng vòng của diclofenac dưới tác dụng của
nhiệt độ trong môi trường acid, dưới tác dụng
của siêu âm hoặc vi sóng tạp A sẽ xuât hiện
nhiều hơn. Qui trình tổng hợp đã được tìm
điều kiện tối ưu để có hiệu suất tối đa, đồng
thời phương pháp tách và tinh chế chất tổng
hợp khác với tài liệu, nhanh gọn hơn. Các tác
nhân cho phản ứng đóng vòng là các chất dễ
tìm, rẻ tiền, máy móc đơn giản. Tạp A là chất
kém tan trong nước và tan tốt trong các dung
môi hữu cơ như cloroform, ethyl acetat,
methanol. Vì vậy thử kết tinh tạp A trong

526

methanol và trong môi trường nước. Nhưng
kết tinh thu được vẫn không sạch nên phải
tinh chế bằng săc ký cột cổ điển. Pha động để
rửa giải tạp A trong sắc lý cột cổ điển sau khi
lựa chọn các dung môi khác nhau là ethyl
acetat 100%, đây là 1 dung môi khá an toàn.
Đối với tạp E, thử nghiệm 2 phản ứng tổng

hợp dựa theo nguồn gốc phát sinh và tài liệu về
tổng hợp, cả 2 phản ứng hiệu suất đều rất thấp.
Hơn nữa, tạp E trên thị trường khá rẻ nên lựa
chọn cách mua tạp E về để tinh chế. Tạp E tan
trong cloroform, methanol, ethyl acetat, tan
chậm trong nước thử tinh chế tạp E bằng các
phương pháp kết tinh nhưng không thành công

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
nên đã lựa chọn phương pháp tinh chế bằng sắc
ký cột cổ điển. Pha động để rửa giải tạp A trong
sắc lý cột cổ điển sau khi lựa chọn các dung môi
khác nhau là cloroform: methanol (99:1).

2.

KẾT LUẬN

4.

Từ nguyên liệu đầu natri diclofenac, qua 2
bước đã tổng hợp được 1-(2,6-diclorophenyl)1,3-dihydro-2H-indol-2-on còn gọi là tạp A
diclofenac. Sản phẩm cuối được chứng minh cấu
trúc bằng phương ph{p phổ IR, MS, 1H-NMR,
13C-NMR. H|m lượng của tạp
đạt 98,21% khi
so sánh với chất chuẩn tạp A USP của diclofenac

bằng HPLC.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

3.

5.

6.

Nghiên cứu Y học

Görög S, (2000), “Identification and Determination of Impurities in
Drugs”. Elsevier Science, e ook IS N: 9780080534404. Pages
772.
Palomo ME, allesteros MP, Frutos P (1999), “ nalysis of
diclofenac sodium and derivatives”, Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis 21, 83 – 94
Somashekar PL, Sanjay Pai PN, Rao G (2013), “Synthesis and
Characterization of Specified Impurities of ceclofenac”,
Chem Sci Trans, 2(3),813-820
Tudja P, Khan MI, Mestrovic E, Horvat M, Golja P (2001),
“Thermal ehaviour of Diclofenac Sodium: Decomposition
and Melting Characteristics”, Chem. Pharm. Bull, 49(10) 1245—
1250
United States Pharmacopoeia 37 (2014) Electronic Edition,
Diclorofenac sodium.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ng|y b|i b{o được đăng:

15/03/2018

British Pharmacopoeia 2014, Diclofenac sodium. Electronic
Edition

Chuyên Đề Dƣợc

527