Buớc đầu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen các locus STR phân tích thể khảm ADN đánh giá tình trạng mọc ghép sau ghép tế bào gốc đồng loài tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

TP CH Y DC HC QUN S S 6 - 2013

BớC ầU NG DụNG KY THUậT GIảI TRìNH Tự GEN CáC
LOCUS STR PHâN TíCH THể KHảM ADN áNH GIá TìNH TRạNG
MọC GHéP SAU GHéP tế bào gốc ồNG LOàI
TạI VIệN HUYếT HO C TRUYềN MáU Trung ơng
Lờ Xuõn Hi*
TóM TắT
ADN t ngi cho v ngi nhn trc ghộp c khuch i bng kớt AmpF/STR Identifiler
khuch i 15 du n STR v 1 du n gii tớnh. Gii trỡnh t cỏc du n ny. Cn c vo c im
khỏc bit gia cỏc alen STR ngi cho v ngi nhn, xỏc nh alen mang thụng tin tt nht tớnh
toỏn mc khm. xỏc nh chớnh xỏc mc khm, trn hn hp ADN ngi cho v ngi
nhn trc ghộp theo t l xỏc nh t 0 - 100%, sau ú phõn tớch tớnh toỏn % ADN ngi cho bng
cỏch tớnh % donor peak area (% din tớch nh ngi cho) ri dng ng cong chun tng quan
gia % ADN ngi cho thc t v % ADN ngi cho tớnh toỏn. Thụng qua ng cong chun ny,
cú th ni suy kt qu % khm ca mu bnh nhõn (BN) sau ghộp. Kt qu: bng k thut gii trỡnh
t gen cỏc locus STR cho 8 cp ghộp t bo gc (TBG) ng loi, xỏc nh c 6 trng hp
khm hon ton v 2 trng hp khm hn hp vo ngy D30 sau ghộp. Kt lun: Ln u tiờn
Vit Nam, ỏp dng thnh cụng phng phỏp gii trỡnh t gen xột nghim phõn tớch tỡnh
trng khm. Phng phỏp ny cú tin cy, chớnh xỏc cao, cho phộp ỏnh giỏ tỡnh trng mc
ghộp/thi ghộp BN sau ghộp ty/ghộp TBG to mỏu ng loi.
* T khoỏ: T bo gc ồng loi; Gii trỡnh t gen; Th khm AND.

Applying sequence genetic loci STR technique in
analysis of DNA chimerism to evaluate status
of gemmation after hematopoietic stem cell
transplantation at National Hospital of
Hematology and Transfusion
SUMMARY
DNAs from pretransplant recipients and donors were amplified with the AmpF/STR Identifiler kit
that contain 15 STR markers and 1 sex marker. The fluorescent PCR products were the fractionated

on polyacrylmide gels in an ABI DNA sequencer. Results were analyzed using Genemapper ID 3.2
softwear. We selected the best markers as informative alens which can distinguish donor from
recipient. For quantitative analysis of the engraftment, we prepared a mixed chimeric sample
by mixing pretransplant recipient and donor DNAs in different ratios to produce a standard curve.

* Viện Huyết học Truyền máu TW
Ng-ời phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hải ()
Ngày nhận bài: 17/5/2013;
Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/6/2013

70


TP CH Y DC HC QUN S S 6 - 2013
Ngày bài báo đ-ợc đăng: 21/6/2013

After amplifying the posttransplant recipient DNA, we were able to detect the extent of engraftment
by interpolating the percent peak area of the informative alens from this standard curve. Results: We
retrospectively analyzed 8 patients who had received allogenic PSCT at D30 post-transplant. At D30,
75% of patients had complete chimerism, 25% of patients only have mix chimerism. Conclusion: It is
the firt time such kind of engraftment analysis is established in Vietnam. This method provides an
useful tool in assessment of chimerism in posttransplant patients.
* Key words: Hematopoietic stem cell transplantation; Short tendem repeat; Chimerism.

ặT VấN đề
Ghộp TBG to mỏu l mt phng phỏp
iu tr mi cú th cha khi nhiu bnh
mỏu lnh tớnh v ỏc tớnh [6, 7]. S xut hin
cỏc t bo ngi cho trong mỏu ngi nhn
sau ghộp ng loi l mt ch s quan trng

cho phộp tiờn lng kh nng thi ghộp, tỏi
phỏt, hoc bnh ghộp chng ch [2]. Cho
d ch c n mt t l nh t bo mỏu, BN s
phi i mt vi nguy c tỏi phỏt. Do vy
mc tiờu ca ghộp TBG to mỏu ng loi
l mnh ghộp (tc t bo ngi cho) mc
100% trong mỏu ngi nhn [3].
Th khm trong ghộp TBG to mỏu l
mt trng thỏi c bit v min dch v di
truyn, c trng bi s c ng tn ti ca
cỏc qun th t bo cú ngun gc t hai cỏ
th khỏc nhau. Cỏc dng th khm trong
ghộp TBG to mỏu cú th gp, bao gm th
khm hon ton (mc ghộp hon ton trong
ghộp TBG to mỏu) hoc th khm hn
hp hay khm mt phn (mc ghộp mt
phn hoc trong trng hp thi ghộp) [5].
Cú nhiu phng phỏp khỏc nhau c s
dng nhm xỏc nh dng th khm. V
nguyờn lý, cỏc phng phỏp ny u phi
da vo nhng im khỏc bit v min dch
hoc di truyn gia ngi cho v ngi nhn.
Trong ghộp TBG to mỏu, nht l ghộp t
ngi cho l anh/ch em c ng huyt thng
thỡ khỏc bit v h khỏng nguyờn HLA ớt cú
giỏ tr trong phõn tớch th khm, cỏc khỏc

bit v h khỏng nguyờn hng cu v nhim
s c th gii tớnh ch cú th s dng trong
cỏc trng hp ngi cho v ngi nhn

khỏc nhúm mỏu v khỏc gii. So vi nhng
phng phỏp khỏc, phng phỏp phõn tớch
th khm da vo s khỏc bit gia cỏc
du n ADN c trng cỏ th ngi cho v
ngi nhn cú u th l s dng c cho
tt c cỏc trng hp ghộp TBG to mỏu
ng loi. Phng phỏp ny chớnh xỏc hn
cỏc phng phỏp khỏc v hin ang c
s dng lm phng phỏp chớnh trong
ỏnh giỏ u ghộp hoc thi ghộp trong
ghộp ty/TBG to mỏu ng loi [4]. Nu ti
bt c thi im no sau ghộp, BN c
xột nghim mỏu m khụng cú ADN ngi
bnh thỡ BN ú dng th khm hon ton
(complete chimerism - CC) hay mc ghộp
hon ton. Tỡnh trng khm hon ton
c cho l cú nguy c tỏi phỏt thp v tiờn
lng tt hn. Nu xột nghim thy cú c
ADN ngi cho v ADN ngi bnh thỡ BN
ú dng khm hn hp (mixed chimerism
- MC). Th khm hn hp chng t s cú
mt ca c t bo ngi cho v ngi nhn
trong qun th t bo quan tõm. Nu sau
ghộp theo dừi thy BN ch cú MC m khụng
cú CC, chng t kt qu ghộp cha t c
mc ghộp hon ton, nu thy bnh nhõn
t c CC, sau ú li xut hin MC, chng
t cú biu hin thi ghộp. Nh vy, v thc
hnh, xột nghim phõn tớch tỡnh trng th

71


TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
khảm rất có
ngh a trong theo dõi tiên
lượng sau ghép TBG tạo máu đồng loài [4].
®èi TƯỢNG Vµ PHƯƠNG PH¸P
NGHIªN CỨU
1. Mẫu máu BN.
Phân tích 16 mẫu ADN trước ghép và 8
mẫu ADN sau ghép (ngày D30 sau ghép) từ
8 cặp BN ghép TBG tạo máu đồng loài từ
anh/chị em ruột có ph hợp HLA, điều trị tại
Khoa Ghép TBG, Viện Huyết học Truyền
máu TW từ tháng 9 - 2012 đến 3 - 2013.
Tiến hành phân tích tại Khoa Miễn dịch - Di
truyền và Sinh học phân tử, Viện Huyết học
Truyền máu TW và Labo phân tích di truyền,
Công ty Gentis.
.P

á

u.

* Chuẩn bị mẫu:
Tách chiết ADN genome bằng kít QuickgADN MiniPrep (ZymoResearh, USA). Phân
tích, đánh giá nồng độ ADN và chất lượng
ADN sau tách chiết trên máy Nanodrop của

h ng Quiawel (Anh).
* Chuẩn bị xây dựng đường chuẩn hỗn
hợp khảm ADN:
Trước khi định lượng tình trạng mọc mảnh
ghép trong máu ngoại vi, xây dựng đường
chuẩn bằng cách phân tích các mẫu hỗn
hợp ADN người cho và người nhận theo tỷ
lệ đ xác định trước. Để tạo mẫu chuẩn cho
từng cặp ghép, chúng tôi trộn các mẫu ADN
(10 ng/ul) đ tách của BN và người hiến trước
ghép theo tỷ lệ khác nhau từ 0 - 100%. Các
mẫu này được phân tính giải trình tự locus
STR, căn cứ vào đặc điểm khác biệt alen
STR giữa người cho và người nhận, tính
toán xác định tình trạng khảm (% donor).
Căn cứ vào % donor tính toán được và %
donor thực tế (% ADN người cho trong hỗn
hợp ADN đ chuẩn bị), d ng phần mềm
Microsoft Excel để xây dựng đường cong

73

tương quan d ng cho tính toán định lượng
theo hàm nội suy.
* Khuếch đại các đoạn STR (Short Tandem
Repeat, các đoạn lặp ngẫu nhiên):
Sau khi tách chiết thu được ADN từ các
mẫu, chạy phản ứng PCR khuếch đại ADN
bằng bộ kít AmpF/STR® Identifiler® PCR
Amplification Kit (Applied Biosystems, M ).

Kít này cho phép khuếch đại 15 locus STR
và 1 locus gen giới tính. Phản ứng chạy
trên máy PCR 9700 (ABI, M ) với chu kỳ
nhiệt như sau: 950C: 11 phút, 940C: 1 phút,
590C: 1 phút x 28 chu kỳ, 720C: 1 phút, 600C:
60 phút.
* Điện di mao quản và phân tích:
Xác định kiểu gen của sản phẩm chạy
phản ứng PCR của mẫu nghiên cứu bằng
phương pháp điện di mao quản trên máy
giải trình tự gen ABI 3100 (Applied Biosystem,
M ). Sau điện di, xử l kết quả thu được
bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 để xác
định alen của mỗi locus.
* Tính toán hỗn hợp thể khảm:
Tỷ lệ % ADN người cho được tính toán từ
mỗi cặp locus STR mang thông tin. % diện
tích đỉnh người cho (% peak area) được
tính toán theo công thức sau: % peak area
= [(AD1+AD2) x 100%]/(AD1+AD2+AR1+AR2),
ở đây A k hiệu cho diện tích đỉnh, D k
hiệu cho các alen người cho, R k hiệu cho
các alen người nhận (hình 1). Trong trường
hợp người cho và người nhận c ng có chung
một số alen, chỉ những alen mang thông tin
mới được đưa vào tính toán. Bằng cách nội
suy diện tích đỉnh của alen mang thông tin
có sử dụng đường chuẩn đ xây dựng,
tính toán được tình trạng mọc ghép thể hiện
bằng % ADN người cho.

* Định nghĩa khảm hoàn toàn (CC) và
khảm hỗn hợp (MC):


TP CH Y DC HC QUN S S 6 - 2013
cho v ADN ngi nhn theo t l bit)
v d ng t l % ny v ng cong chun.
% ADN ng-ời cho thực tế (Mẫu tạo dựng)

Khm hon ton (CC) c xỏc nh khi
xut hin > 95% t bo to mỏu ngi cho
sau ghộp TBG to mỏu ng loi. Khm
hn hp (MC) c xỏc nh khi cú 5 - 95%
TBG to mỏu ngi cho sau ghộp TBG to
mỏu ng loi [6].

% ADN ng-ời cho tính theo % diện tích đỉnh (Peak area)

Hỡnh 2: Tng quan % ADN ngi cho tớnh
theo % din tớch nh ca cỏc locus mang
thụng tin v % ADN thc t (y = -0,006x2 +
1,730x - 5,472; r2 = 0,995).
2. Tỡm cỏc alen STR mang thụng tin.
Hỡnh 1: Cỏch tớnh toỏn tỡnh trng khm hn
hp. R1 v R2 l tớn hiu alen 1 v 2 ca
ngi nhn; D1 v D2 l tớn hiu alen 1 v 2
ca ngi cho; A l din tớch nh tớn hiu
c hiu. (A) Cỏch tớnh khi cỏc alen ca c
ngi cho v ngi nhn cú nhng nh
khỏc nhau. (B) Cỏch tớnh trong trng hp

cú 2 alen d hp t v cú 1 alen c ng cú
ngi cho v ngi nhn.
KếT QUả NGHIêN CứU
1. t tru
u .

,

ớ

xỏ v

Vỡ cỏc alen ng n hn cú th khuch i
hiu qu hn alen di, do ú cn phi kớch
hot mt di hn hp th khm cú th
tng ng vi cỏc mu sau ghộp gp trờn
lõm sng. Pha loóng mu ADN ỏnh giỏ
tng quan, kh nng lp li, tp trung
v nhy ca STR-PCR trong ỏnh giỏ
nh lng hn hp th khm. Tớnh toỏn %
din tớch nh ngi cho alen mang thụng
tin cỏc mu to dng (mu trn ADN ngi

Cú rt nhiu t hp alen ngi cho v
ngi nhn, tuy nhiờn, ch cú mt s t hp
cú mang thụng tin cn thit phỏt hin
cỏc alen ngi cho. Mc d cú mt s
locus xột v mt k thut cú mang thụng tin,
nhng thc t chỳng khụng tt d ng xỏc
nh th khm hn hp vỡ cú s xut hin

ca cỏc bng búng tn ti di dng nh
2 bng ph dc theo cỏc nh alen chớnh.
Nhỡn chung, cỏc bng búng l mt bng
lp li nh hn nh alen chớnh v cú din
tớch nh hn so vi alen chớnh. Cỏc bng
búng ny cú th gõy nh hng n vic
la chn locus mang thụng tin.
.
t

m

m BN v
u
.

t

u

tớ

Bng 1 cho bit mt s thụng tin c bn
v 8 BN ghộp TBG ng loi ti Vin Huyt
hc Truyn mỏu TW t thỏng 9 - 2012 n
3 - 2013. Trong s 8 BN ny, 1 BN nam
(12,5%) v 7 BN n (87,5%); 2 BN c
ghộp khỏc gii (25%), 6 BN ghộp c ng gii
(75%); 1 BN m c bnh ỏi huyt s c t kch
phỏt ban ờm (PNH), 2 BN ri lon sinh ty

74


TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
(MDS), 5 BN bạch cầu cấp d ng tủy (AML). BN ghép có tuổi nhỏ nhất 25, lớn nhất 51.
Bảng 1: Đặc điểm BN ghép TBG tạo máu đồng loài.
CHÈN ®O¸N

TUæI BN

PHï HîP GIíI

GIíI

TINH TRANG KH¶M D30

PNH

38

Không

Nữ

MC

(32%)

AML

25

không

Nữ

CC

100%

AML

37

Có

Nữ

CC

97%

MDS

34

Có

Nữ

MC

67%

MDS

45

Có

Nữ

CC

100%

AML

36

Có

Nam

CC

100%

AML

51

Có

Nữ

CC

98%

AML

47

có

Nữ

CC

100%

Vào thời điểm ngày 30 sau ghép, 6 BN (75%) đạt tình trạng khảm hoàn toàn, 2 BN
(25%) chỉ đạt khảm hỗn hợp, trong đó 1 BN đạt thể khảm 32% và 1 BN đạt 67%.

Hình 3: Hình ảnh điện di mao quản phân tích mẫu BN số 2. Các alen phân tích từ phải
sang trái là: D3S1358, TH01, D13S317; D16S539; D2S1338. Hàng trên c ng là mẫu
ADN người cho trước ghép. Hàng 2 là mẫu ADN BN trước ghép. Hàng 3 là mẫu AND
BN ngày 30 sau ghép (D30). Ngày D30 sau ghép, phân tích mẫu máu BN thấy 100% là

ADN của người cho, 0% là ADN BN.

75


TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
Các mẫu máu được tách ADN và khuếch đại marker STR. Hình 2 là hình ảnh phân tích
5 locus STR của 1 BN (BN số 2) trước ghép và ngày 30 sau ghép. Phân tích cho thấy ở
BN này, các locus D13S31, D16S539, D2S1338 là những locus mang thông tin.
thông tin. Việc nhân bản đồng thời nhiều
BµN LUËN
locus trong một ống phản ứng cho phép xác
Ngày nay, ghép TBG tạo máu là một

định được locus mang thông tin. Khi thực

phương pháp điều trị có thể cứu sống BN

nghiệm pha lo ng mẫu người cho và người

m c bệnh máu ác tính hoặc BN suy tủy

nhận để xây dựng đường chuẩn, chúng tôi

xương. Sau ghép TBG, biểu hiện tái phát

nhận thấy, mức 5% có thể tái lập được bằng

bệnh là một dấu hiệu thất bại của ca ghép.

phương pháp thực nghiệm. Thậm chí, mức

Phát hiện sớm tình trạng tái phát có thể

< 5% vẫn có thể tìm thấy đỉnh khác biệt.

giúp sớm quyết định biện pháp điều trị bổ

Ngoài ra, việc phân tích nhiều alen làm tăng

sung hiệu quả. Do vậy, với những BN ghép

độ tin cậy của kết quả, do làm tăng cơ hội

TBG tạo máu đồng loài, cần thiết phải làm

đánh giá các đỉnh mang thông tin. Một số

xét nghiệm phân tích đậu mảnh ghép sau

locus mặc d mang

ghép để khẳng định mảnh ghép đ mọc và

nhưng không tốt để xác định tình trạng

để phát hiện tình trạng mọc ghép hay tái

khảm, vì có sự tồn tại của các dải lặp lại

phát sau ghép [5].

(hay “bóng đỉnh”), các dải này chủ yếu xuất

ngh a về mặt k thuật,

Các đặc tính đa hình của ADN được

hiện ở dạng 2 đỉnh phụ dọc theo đỉnh alen

d ng để theo dõi mọc ghép sau ghép đồng

chính. Sự có mặt của các đỉnh lặp lại ảnh

loài, không d ng đánh giá tình trạng mọc

hưởng đến việc lựa chọn locus mang thông

ghép sau ghép tự thân [5]. Trong trường

tin d ng để phân tích mọc ghép. Do đó, khi

hợp người cho là anh/chị em sinh đôi giống

phân tích cần loại bỏ các alen phụ này.

nhau về di truyền, các đặc tính đa hình của
ADN cũng không có giá trị. Tính đa hình có

KÕT LUËN

giá trị nhất d ng cho mục đích này là biến

Viện Huyết học Truyền máu TW hiện đ
tiến hành ghép TBG đồng loài cho một số
mặt bệnh như rối loạn sinh tủy, bệnh bạch
cầu cấp d ng tủy, đái huyết s c tố kịch phát
ban đêm. Tuổi của BN ghép nhìn chung là
trẻ (< 55 tuổi). Kết quả sau ghép có đến 75%
đạt tình trạng khảm hoàn toàn, 25% đạt tình
trạng khảm hỗn hợp. Kết quả này phản ánh
chất lượng ghép của Việt Nam ở mức độ
khá, tương đương trình độ của khu vực.

thể ở một số trình tự lặp lại nhất định, các
trình tự lặp lại này được gọi là đoạn lặp
ng n ngẫu nhiên (STR) [1]. Locus STR mang
thông tin là locus mà ở đó có ít nhất 1 alen
người nhận có số lượng đoạn lặp lại khác
với alen người cho. Vì người cho và người
nhận thường có quan hệ họ hàng với nhau,
nên người cho và người nhận có nhiều alen
giống nhau. Vì vậy, cần phân tích trên nhiều
locus STR để xác định được ≥ 1 locus mang

Với việc phân tích các alen STR, lần đầu
tiên ở Việt Nam, đ áp dụng thành công

2

TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
phương pháp sinh học phân tử trong đánh
giá tình trạng khảm sau ghép TBG đồng
loài với độ tin cậy, độ chính xác cao, loại trừ
được những khó khăn trong xác định mọc
ghép ở trường hợp ghép c ng nhóm máu,
ghép đồng giới.
TµI LIÖU THAM KH¶O
1. Butler JM. Forensic ADN typing: Biology
and technology behind STR marker. Academic
Press. London. 2001.
2. Catalin Marian, Andrei Anghel, Simona
Maria Bell, Beatrix Katalin Frencz, Sorin Ursoniu,
Milan Dressler, Octavian Popescu, Bruce Budowle.
STR data for the 15 AmpF/STR Identifiler loci in
the Western Romanian population. Forensic Science
International. 2007, 170, pp.73-75.
3. Chen DP, Tsao KC, Wang PN, Tseng
CP, Sun CF. Quantitative analysis of chimerism
after allogeneic peripheral blood stem cell
transplantation. Chang Gung Med J. 2002 Nov,
25 (11), pp.734-742.

77

4. Lobashevsky AL, Senkbeil RW, Townsend
JE, Mink CA, Thomas JM. Quantitative analysis
of chimerism using a short tandem repeat method
on fluorescent automated ADN sequencer. Clin

Lab Haematol. 2006, 28, pp.40-49.
5. Ma X, Wu D, Sun A et al. The value of
monitoring minimal residual disease in the patients
with donor lymphocyte infusion as intervention of
relapse/refractory acute lymphoblastic leukemia
after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
Am J Hematol. 2010, 85, pp.141-142.
6. Goh RY, Kim SH, Han JY. Lineage-specific
chimerism analysis in nucleated cells, T cells and
natural killer cells after myeloablative allogeneic
hematopoietic stem cell transplantation. Korean
J Hematol. 2011 Mar, 46 (1), pp.18-23.
7. Weng L, Dyson J, Dazzi F. Low-intensity
transplant regimens facilitate recruitment of
donor-specific regulatory T cells that promote
hematopoietic engraftment. Proc Natl Acad Sci.
USA. 2007, 104, pp.8415-8420.


TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013

78