Nghiên cứu tác dụng kháng virus herpes simplex (HSV) của cao chiết hạ khô thảo (prunella vulgaris L.)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV)
CỦA CAO CHIẾT HẠ KHÔ THẢO (PRUNELLA VULGARIS L.)
Đào Thị Kim Đính*, Huỳnh Thị Kim Loan**, Trần Thu Hoa***, Trần Công Luận*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng virus herpes týp 1 và týp 2 của các cao chiết từ Hạ khô thảo thu hái ở
Việt Nam nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược có khả năng kháng HSV.
Phương pháp: Chiết cao toàn phần, tách phân đoạn ethylacetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo.
Nhuộm tế bào Vero với xanh methylen và đo mật độ quang ở bước sóng 620 nm, so sánh tế bào Vero tiếp
xúc/không tiếp xúc với các cao chiết, tế bào Vero không nhiễm virus và tế bào Vero nhiễm virus để xác định độc
tính trên tế bào của các cao chiết và khả năng kháng virus.
Kết quả: Ba loại cao đạt tiêu chuẩn theo qui định về độ ẩm DĐVN III. Cao toàn phần cùng các phân
đoạn ethylacetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo có tác dụng ức chế HSV tốt với chỉ số hệ số chọn lọc
CC50/ IC50 đối với HSV-1 và HSV-2 từ 16,29 đến 28,08. Như vậy, cả ba loại cao đều có ý nghĩa trong trị
liệu (có hệ số chọn lọc >10).
Kết luận: Cao toàn phần Hạ khô thảo, phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước đã được chứng minh có
tác dụng ức chế HSV-1 và HSV-2, có thể được sử dụng để làm thuốc kháng herpes hiệu quả.
Từ khóa: Hạ khô thảo, kháng herpes, HSV-1 và HSV-2.
Chữ viết tắt: CC, nồng độ gây độc; CC50, liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy; IC50, nồng độ ức chế 50% tế
bào nuôi cấy; HSV, Herpes simplex virus; CPE, bệnh tích tế bào; SI, hệ số chọn lọc; TCID50, liều gây nhiễm 50%
tế bào nuôi cấy.

ABSTRACT
STUDY ON IN VITRO ANTI-HERPES SIMPLEX VIRUS ACTIVITY
OF EXTRACTS FROM VIETNAMESE MEDICINAL HERB PRUNELLA VULGARIS L.
Dao Thi Kim Dinh, Huynh Thi Kim Loan, Tran Thu Hoa, Tran Cong Luan
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh* Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 313 - 317

Objective: To investigate the in vitro antiherpetic activity of extracts from Prunella vulgaris.
Methods: Methylene blue staining method for CPE inhibition assay and for evaluation the effects of samples
by comparison untreated Vero cells or Vero cells infected with HSV-1 or HSV-2. Antiviral activity was finally
expressed as a selectivity index (SI), the value of CC50 divided by 50% inhibitory concentration (EC50).
Results: Prepare water extract, ethyl acetate fraction and aqueous fraction from Prunella vulgaris L.. All
three extracts exhibit a potent antiherpetic activity with the SI of more than 16.29 to 28.08.
Conclusion: Extracts from Prunella vulgaris L. are potential antiherpetic agents as herbal products.
Keywords: Prunella vulgaris L., Antiherpetic, HSV-1, HSV-2.
Abbreviation: CC, cytotoxic concentration; CC50, 50% cytotoxic concentration; CPE, cytopathic effect; IC50,
50% Inhibitory concentration; HSV, Herpes simplex virus; SI, selectivity index, TCID50, 50% tissue culture
infectious dose.
*

Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM
Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Công Luận

Chuyên Đề Dược Khoa

**

***ĐH. Y Dược Tp. HCM
Viện Pasteur Tp. HCM
ĐT: 0903671323
Email:

313


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hạ

khô

thảo

(Prunella

vulgaris

L.

Lamiaceae) mọc ở một số vùng núi cao từ
1000 m trở lên củaViệt Nam, như Tam Đảo
(Vĩnh Phúc); Sa Pa, Mường Khương, Bát Sát,
Bắc Hà (Lào Cai); Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản
Bạ (Hà Giang); Sìn Hồ, Tủa Chùa (Lai Châu);
Mù Cang Chải (Yên Bái)(7). Thành phần hóa
học của Hạ khô thảo gồm có các acid
triterpenoic, flavonoid, các phenolic và
diterpen. Các chất tan trong nước của Hạ khô
thảo có tác dụng hạ huyết áp ổn định, kháng
đột biến và an thần. Khả năng kháng virus
herpes bởi một polysaccharid tách từ Hạ khô
thảo đặc biệt được quan tâm(3). Ngoài ra, tanin
(polyphenol) chiết từ Hạ khô thảo có tác dụng
kháng HIV cũng đã được chứng minh(5).
Virus Herpes simplex (HSV) là tác nhân

gây bệnh rất thường gặp, gây các bệnh khác
nhau từ nhẹ đến nặng, trong một số trường
hợp chúng có thể gây tử vong. Các thuốc
nucleosid dùng điều trị nhiễm HSV thường có
hiệu quả trong điều trị nhiễm HSV ban đầu

hoặc là tái nhiễm, tuy nhiên việc sử dụng tràn
lan các thuốc này đã làm nảy sinh các chủng
HSV đề kháng với các thuốc tương đồng, đặc
biệt là ở các bệnh nhân tổn thương miễn dịch.
Tìm thuốc mới có nguồn gốc tự nhiên có tác
dụng kháng virus mà ít độc đang được quan
tâm, trong đó Hạ khô thảo cũng được nghiên
cứu theo hướng này(3,6,9). Báo cáo này của
chúng tôi nhằm chứng minh tác dụng ức chế
HSV của cao toàn phần, phân đoạn ethyl
acetat và phân đoạn nước của Hạ khô thảo
chưa được khảo sát ở Việt Nam.

NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
- Phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo
(Prunella vulgaris L.) được thu hái tại Phó
Bảng, Hà Giang và được định danh bởi
Nguyễn Tập – Khoa Tài nguyên dược liệu,
Viện Dược liệu (Hình 1). Nguyên liệu được xác
định độ ẩm, độ tro toàn phần và độ tro không
tan trong acid theo DĐVN III. Phân tích sơ bộ
thành phần hóa thực vật bằng phương pháp
của trường đại học dược Rumani có cải tiến.

Hình 1. Cành mang hoa tươi và cụm quả khô Hạ khô thảo.
nước được cô cách thủy đến dạng cao đặc
- Chiết xuất dược liệu: 100 g bột dược liệu
(10,8% độ ẩm). Dùng 10 g cao toàn phần hòa
được đun hồi lưu 3 lần với nước ở 1000C trong 1
trong
nước cất và lắc chiết phân đoạn bằng kỹ
giờ mỗi lần theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:nước). Dịch

314

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
thuật lỏng – lỏng với các dung môi từ ít phân
cực đến phân cực thu được lần lượt các phân
đoạn ethyl acetat, n-butanol và nước.
- Acyclovir (Sigma).
- HSV týp 1 và HSV týp 2 từ bệnh phẩm
được phân lập, định danh và lưu trữ tại Viện
Pasteur Tp.HCM.
- Tế bào Vero CCL-81 (ATCC), được nuôi
cấy trong môi trường CMRL (Gibco) có chứa 5%
huyết thanh bào thai bê. Tế bào được nhân định
kỳ trong 7 ngày. Tế bào dùng gây nhiễm virus
được nhân theo tỷ lệ 2x105 tế bào ml-1 và tạo
thành một lớp sau khi nhân được 2-3 ngày.

Tạo nguồn HSV chuẩn
HSV được gây nhiễm vào tế bào Vero, ủ
o
37 C, quan sát tế bào mỗi ngày, khi tế bào có
hiện tượng CPE hoàn toàn, đem đông tan băng 3
lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung 20% huyết
thanh bào thai bê bất hoạt, phân chia lượng nhỏ
1ml, bảo quản -70oC cho đến khi làm phản ứng.

Xác định hiệu giá TCID50 của hỗn dịch
virus(8)
Dựa vào hiện tượng CPE xác định TCID50
theo công thức Karber Log TCID50 = L - d(S-0,5),
với L: log của độ pha loãng thấp nhất dung
trong thử nghiệm, d: tỷ lệ khác biệt giữa các độ
pha loãng, S: tổng tỷ lệ các giếng dương tính
trên các giếng gây nhiễm ở từng nồng độ virus.
Kỹ thuật nhuộm tế bào bằng xanh methylen
được thực hiện theo qui trình đã công bố(4).

Chuẩn bị dịch thử
Các cao chiết toàn phần và các phân đoạn
chiết Hạ khô thảo được pha trong môi trường
CMRL cho dung dịch mẹ có nồng độ 20 mg ml-1;
acyclovir được pha trong môi trường CMRL cho
dung dịch mẹ có nồng độ 2 mg/ml. Từ các dung
dịch mẹ, pha loãng trong môi trường CMRL
thành nhiều nồng độ để khảo sát.

Xác định tính độc tế bào của chất thử đối

với tế bào Vero(1,4)
Cho vô mỗi giếng 100 µl các nồng độ của
chất thử, mỗi nồng độ lặp lại ba lần trên phiến

Chuyên Đề Dược Khoa

Nghiên cứu Y học

96 giếng có tế bào Vero đã phủ kín thành một
lớp, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 48 giờ, đổ bỏ chất
không hấp phụ, nhuộm màu bằng xanh
methylen và đo mật độ quang ở 620 nm. Tính
nồng độ gây độc (CC) theo công thức CC = (A –
B)/A x 100. Trong đó A là giá trị OD của chứng
tế bào (tế bào không tiếp xúc với chất thử), B là
giá trị OD của tế bào đã được tiếp xúc với chất
thử. Xác định nồng độ chất thử gây độc 50% tế
bào (CC50) từ phương trình tuyến tính biểu diễn
phần trăm gây độc tế bào CC theo nồng độ chất
thử.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng
virus
Cho chất thử tiếp xúc với virus, sau đó cho
xâm nhiễm vào tế bào(2). Nồng độ virus sử dụng
để
khảo
sát
HSV-1
và

HSV-2 dựa vào hiệu giá TCID50. Tính phần trăm
ức chế virus của dịch thử theo công thức IC = (C
– D)/(A – D) x 100. Trong đó C là giá trị OD của
tế bào tiếp xúc với virus và cao chiết, D là giá trị
OD của tế bào chỉ tiếp xúc với virus (chứng
virus), A là giá trị OD của tế bào không tiếp xúc
với virus và dịch thử (chứng tế bào). Xác định
nồng độ dược liệu ức chế 50% (IC50) sự xâm
nhiễm của virus từ phương trình tuyến tính biểu
diễn IC ở nồng độ virus đáp ứng tốt nhất với
chất thử. Chỉ số chọn lọc SI (hay Hệ số trị liệu)
được tính theo công thức SI = CC50/ IC50(1).

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đặc tính dược liệu
Bột dược liệu có độ ẩm 11,47 ± 0,04, đạt tiêu
chuẩn theo qui định về độ ẩm DĐVN III (không
quá 13%). Độ ẩm của cao toàn phần là 10,83 ±
0,03, trong khi quy định DĐVN III áp dụng cho
cao đặc là không quá 20%; độ tro toàn phần là
10,12 ± 0,05 và độ tro không tan trong acid là
1,18 ± 0,009.
Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực
vật bột Hạ khô thảo có tinh dầu, carotenoid,
triterpenoid,
anthraquinon,
polyphenol,
saponin, acid hữu cơ, chất khử và polyuronic,
điều này cũng phù hợp với nghiên cứu trước

315


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

dây của Namba, 1994(3). Từ 100 g bột dược liệu
thu được 32,43 g cao toàn phần. Cao toàn phần
Hạ khô thảo có rất nhiều polyphenol,
triterpenoid và chất khử, nhiều tinh dầu, acid
hữu cơ và polyuronic, có carotenoid,
anthraquinon và saponin. Từ 10 g cao toàn phần
thu được 0,50 g cao phân đoạn ethyl acetat, 1,61
g cao phân đoạn n-butanol và 7,82 g cao phân
đoạn nước.

Xác định hiệu giá virus theo TCID50
Kết quả xác định hiệu giá TCID50 đối với
HSV-1 và HSV-2 theo bảng 1. Như vậy có thể
tiến hành khảo sát khả năng ức chế virus của
chất thử với nồng độ virus HSV-1 từ 103,6, 104,6 và
105,6; HSV-2 từ 103,7, 104,7 và 105,7.
Bảng 1. Kết quả hiệu giá của chủng virus HSV-1 và
HSV-2 dùng thử nghiệm.
TCID50= log [ L- d(S- 0,5)]
HSV-1 (S6)
HSV-2(S8)
-4,8
10 /0,1ml

10-4,2/0,1ml

Virus
TCID50

L: Log của độ pha loãng thấp nhất dùng trong thử nghiệm;
d: Sự khác nhau giữa các độ pha loãng; S: [Tổng tỷ lệ các
giếng hình thành đám hoại tử] x [tổng số giếng tiếp xúc]-1.

Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế
bào Vero
Các cao Hạ khô thảo bao gồm cao toàn phần,
phân đoạn ethyl acetat và phân đoạn nước có
chỉ số SI đối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong
khoảng từ 16,29 đến 28,08; riêng phân đoạn nbutanol có chỉ số SI < 10. Như vậy, cao Hạ khô
thảo có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 rất tốt,
đặc biệt là phân đoạn nước tuy vẫn còn kém hơn

so với acyclovir (Bảng 2). Kết quả này phù hợp
với công bố của Hong-Xi và cộng sự (1999) là
polysaccharid kiềm tách từ dịch chiết bằng nước
nóng của Hạ khô thảo có khả năng ức chế HSV1 và HSV-2(3). Công bố của Zhang và cộng sự
còn cho thấy phức hợp lignin–carbohydrat từ
dịch chiết nước của cụm hoa (spike) có khả năng
kháng mạnh HSV-1 và HSV-2 theo tác động ức
chế quá trình bám đính và truyền vào tế bào của
virus, kể cả chủng HSV-1 đề kháng acyclovir(9).
Tuy nhiên phân đoạn ethyl acetat với thành
phần polyphenol chiếm ứu thế cũng có chỉ số SI
đối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong khoảng từ

17,76 đến 19,46 tương đương với SI của cao toàn
phần. Điều này cho thấy ngoài nhóm hợp chất
polysaccharid thể hiện tác dụng ưu thế kháng
HSV-1 và HSV-2 còn có nhóm hợp chất khác ở
phân đoạn ethyl acetat cũng có tác dụng này.
Nhóm hợp chất này có thể là nhóm polyphenol
như đã phân tích và cũng được đề cập đến theo
công bố của Nolkemper và cộng sự (2006)(6) với
hai hợp chất chính là acid rosmarinic và acid
caffeic. Nhưng nhóm chất này dường như
không có sự hiệp lực với nhóm hợp chất
polysaccharid và làm cho khả năng ức chế HSV1 và HSV-2 của cao toàn phần thấp hơn so với
phân đoạn nước mà thành phần chủ yếu là
nhóm polysaccharid. Đây là vấn đề chưa được
đề cập trước đây và cần có sự nghiên cứu sâu
hơn để làm sáng tỏ.

Bảng 2. Kết quả khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2.
Hạ khô thảo

CC50 (μg/ml)

Cao toàn phần
Cao ethyl acetat
Cao n-butanol
Cao nước
Acyclovir

170,48
191,31

81,08
307,03
1531,03

HSV-1
IC50
10,47
10,77
29,06
11,31
6,82

KẾT LUẬN
Cao toàn phần Hạ khô thảo, phân đoạn
ethyl acetat và phân đoạn nước đã được chứng

316

HSV-2
SI
16,29
17,76
2,79
27,15
224,51

IC50
8,22
9,83
30,74

10,49
5,49

SI
20,74
19,46
2,64
28,08
279,07

minh có tác dụng ức chế HSV-1 và HSV-2 và
có thể được lựa chọn hợp lý trong việc làm
thuốc kháng herpes.
Cảm ơn: Đề tài được thực hiện với kinh phí do Bộ Y tế hỗ trợ.

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.
3.

4.

5.

Dargan D.J. (1998), Investigation of the anti-HSV activity of

candidate antiviral agents, Methods in Molecular Medrone,
Vol 10 Herpes simplex virus Protocols, 387-405.
Freshney R. I. (2005), Culture of animal cells: A manual of
basic technique, Fith Edition, John Wiley & Sons, Inc, 199-216.
Hong-Xi X., Spencer H.S. L., Song F. L., Robert L. W.,
Jonathan B. (1999). Isolation and characterization of an antiHSV polysaccharide from Prunella vulgaris. Antiviral Res., 44,
43-54.
Hứa Thị Như Cẩm, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Kim Loan,
Trần Thu Hoa (2010). Nghiên cứu tác dụng kháng virus
herpes simplex (HSV) của các diterpen lacton từ Xuyên tâm
liên. Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, 14, 142-146.
Liu S., Jiang S., Wu Z., Lin L., Zhang J., Zhu Z., Wu S. (2002).
Identification of inhibitors of the HIV-1 gp41 six-helix bundle

Chuyên Đề Dược Khoa

6.

7.
8.
9.

Nghiên cứu Y học

formation from extracts of Chinese medicinal herbs Prunella
vulgaris and Rhizoma cibotte. Life Sciences, 71, 1779–1791.
Nolkemper S., Reichling J., Stintzing F.C., Carle R., Schnitzler
P. (2006). Antiviral effect of aquueous extracts from species of
the Lamiaceae family against Herpes simplex type 1 and type 2
in vitro. Planta med., 72, 1378-1382.

Võ Văn Chi (1999). Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất
bản Y Học, Hà Nội.
World Health Organization (2004). Polio laboratory manual,
immunization, vaccines and biologicals, 4th Edit., 76-78.
Zhang Y., But P.P.H., Ooi V.E.C., Xu H.X., Delaney G.D., Lee
S.S.H, Lee S.F. (2007). Chemical properties, mode of action,
and in vivo anti-herpes activities of a lignin–carbohydrate
complex from Prunella vulgaris. Antiviral Research 75, 242–
249.

317