Biến đổi hình thái noãn và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của noãn sau đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018

BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI NOÃN VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA NOÃN SAU ĐÔNG LẠNH
BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA
Lê Thanh Huyền*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* và CS
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá biến đổi hình thái noãn và khả năng phát triển của noãn sau rã đông
(tỷ lệ sống, khả năng thụ tinh, chất lượng phôi trước chuyển phôi, tỷ lệ có thai, tỷ lệ làm tổ)
bằng phương pháp thuỷ tinh hoá. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 211 noãn trưởng
thành được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đã rã đông (tương ứng với 34 chu kỳ
có noãn đông lạnh và 34 chu kỳ rã đông - chuyển phôi) tại Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội,
Học viện Quân y. Kết quả: hình thái noãn về đường kính bào tương và độ dày màng trong
suốt sau rã đông không thay đổi so với trước đông lạnh. Thoi vô sắc quan sát thấy ở 100%
noãn rã đông sau 3 giờ nuôi cấy. Tỷ lệ noãn sống sau rã đông 89,09%, tỷ lệ thụ tinh 71,28%, tỷ lệ
phôi tốt ngày 3 là 38,71%, tỷ lệ có thai lâm sàng 29,41%, tỷ lệ làm tổ 12,94%. Kết luận: đông lạnh
thủy tinh hóa giúp bảo quản tốt noãn người, noãn sau rã đông có tiềm năng phát triển cao.
* Từ khóa: Thụ tinh trong ống nghiệm; Đông lạnh thủy tinh hóa.

Morphological Changes and Outcomes of IVF of Human Oocytes
Cryopreserved by Vitrification
Summary
Objectives: To evaluate morphological changes and developmental competence of oocyte
after vitrification (i.e. survival rate, fertilization ability, embryo quality, clinical pregnancy rate,
implantation rate) by using vitrification method. Subjects and methods: 211 mature oocytes had
vitrified and thawed in Military Morphological Institute of Vietnam Military Medical University.
Results: Vitrified oocyte did not change in terms of morphology, repolymerization of the meiotic
spindle occurs in 100% of the oocytes surviving cryopreservation after 3 hours. Observed
survival rate was 89.09%, fertilization rate of vitrified oocyte was 71.28%, good quality embryo
on day 3 was 38.71%, clinical pregnancy rate was 29.41% and implantation rate was 12.94%.
Conclusion: Vitrification is an efficient method for human oocyte cryopreservation, vitrified - thawed

oocytes have good quality and highly developmental competence.
* Keywords: In vitro vitrification; Fertification.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, trữ lạnh được xem là kỹ thuật
không thể thiếu trong điều trị vô sinh bằng

tụ tinh trong ống nghiệm (TTTON). Trong khi
trữ lạnh phôi giúp tăng tính an toàn và hiệu
quả của một chu kỳ kích thích buồng trứng
làm TTTON thì trữ lạnh giao tử có vai trò

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Huyền ()
Ngày nhận bài: 26/04/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/06/2018
Ngày bài báo được đăng: 21/06/2018

30


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
quan trọng trong vấn đề bảo tồn khả năng
sinh sản của con người cũng như có
nhiều tiềm năng ứng dụng rộng rãi khác.
Trữ lạnh noãn được xem là giải pháp hữu
hiệu để bảo tồn khả năng sinh sản cho
phụ nữ độc thân hoặc phụ nữ mắc các
bệnh lý ác tính, là cơ sở để thành lập
ngân hàng noãn của người cho. Trong
một số trường hợp đặc biệt, khi người

chồng không lấy được tinh trùng hoặc
mẫu tinh trùng không đạt tiêu chuẩn sau
khi noãn đã được chọc hút, đông lạnh
noãn là lựa chọn duy nhất để không bỏ
noãn. Ngoài ra, trữ lạnh noãn còn giúp
giảm tình trạng số lượng phôi dư thừa
ngày càng gia tăng [2, 8]. Trên thế giới,
trường hợp mang thai thành công đầu
tiên từ noãn người trữ lạnh được Chen C
và CS công bố năm 1986 [5], chỉ sau
thành công của trữ lạnh phôi người một
thời gian ngắn. Tuy nhiên, cho đến nay,
so với đông lạnh phôi, hiệu quả của đông
lạnh noãn vẫn còn gây nhiều tranh cãi.
Việc trữ lạnh và rã đông noãn gặp nhiều
khó khăn hơn so với tinh trùng và phôi.
Đặc điểm cấu trúc khác biệt của noãn
như kích thước tế bào và thể tích nước
trong tế bào lớn, tốc độ khử nước chậm
là những nguyên nhân chính khiến cho
noãn rất dễ bị tổn thương trong quá trình
làm lạnh và rã đông. Các tổn thương này
sẽ ảnh hưởng đến khả năng sống, khả
năng thụ tinh và năng lực phát triển của
phôi được tạo thành. Vì vậy, chúng tôi
thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu:
Mô tả biến đổi hình thái cấu trúc noãn
người sau đông lạnh và đánh giá kết quả
TTTON của noãn sau rã đông bằng phương
pháp thủy tinh hóa.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu.
211 noãn trưởng thành được đông lạnh
bằng phương pháp thủy tinh hóa đã rã
đông (tương ứng với 34 chu kỳ có noãn
đông lạnh và 34 chu kỳ rã đông - chuyển
phôi của bệnh nhân (BN)) tại Viện Mô phôi
Lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y,
thời gian từ tháng 8 - 2015 đến 12 - 2017.
- Tiêu chuẩn lựa chọn:
+ Noãn được lấy vào thời điểm 34 36 giờ sau tiêm hCG.
+ Noãn ở giai đoạn MII có hình thái
bình thường (theo Đồng thuận đánh giá
và phân loại noãn, phôi VINAGOFPA,
2012) [1].
- Tiêu chuẩn loại trừ: noãn ở các giai
đoạn GV, MI và noãn bất thường.
* Vật liệu, hóa chất:
Sử dụng bộ môi trường đông lạnh và
rã đông noãn/phôi (Hãng Kitazato, Nhật Bản).
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Đông lạnh và rã đông noãn:
Áp dụng quy trình đông lạnh thủy tinh
hóa theo phương pháp Cryotop của
Masashige Kuwayama (2005):
+ Trước khi đông lạnh, tất cả noãn đều
được xử lý bằng enzym hyaluronidase
(Hyase, Vitrolife) để loại bỏ hết tế bào

nang bao xung quanh.
+ Sau khi rã đông, nuôi cấy noãn trong
môi trường IVF trong thời gian 3 giờ trước
khi tiến hành kỹ thuật ICSI.
31


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
* Xác định noãn sống:
Sau khi rã đông, các noãn sống có màng
trong suốt, màng tế bào còn nguyên vẹn,
bào tương sáng màu, về hình thái không
thấy có thay đổi so với trước khi đông lạnh.
* Phân tích thoi vô sắc:
Áp dụng theo phương pháp của Markus
Montag (2006), sử dụng hệ thống Module
polaraide - octax laser system của kính
hiển vi Nikon TE2000: sau khi rã đông, tất
cả noãn được theo dõi đánh giá xuất hiện
thoi vô sắc trong bào tương noãn tại các
thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ sau
rã đông.
* Phương pháp đánh giá hình thái phôi:
Quan sát hình thái phôi bằng kính hiển
vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng
đại 200 lần. Phôi ngày 3 (ngày chuyển phôi)
được phân loại theo tiêu chuẩn Đồng
thuận ALPHA (2011) và Đồng thuận đánh
giá và phân loại noãn, phôi VINAGOFPA
(2012) [1], chia phôi thành 3 loại dựa vào

đặc điểm số lượng phôi bào, độ đồng đều
giữa các phôi bào và tỷ lệ mảnh vỡ bào
tương so với thể tích toàn bộ phôi:
- Phôi tốt: phôi có 7 - 8 phôi bào, kích
thước phôi bào đồng đều (lệch nhau ≤ 20%),
tỷ lệ mảnh vỡ bào tương < 10% thể tích
phôi, không có phôi bào đa nhân.
- Phôi trung bình: phôi có < 8 phôi bào,
đa số phôi bào có kích thước đồng đều,
tỷ lệ mảnh vỡ bào tương 10 - 25% thể
tích của phôi, không có phôi bào đa nhân.
- Phôi xấu: các phôi bào có kích thước
không đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào
tương > 25% thể tích phôi, có phôi bào
đa nhân.
32

* Xác định tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm
tổ ở các chu kỳ chuyển phôi từ noãn
đông lạnh:
BN sau khi chuyển phôi 14 ngày được
hẹn đến Viện để thử lượng ß-hCG trong
máu:
+ Có thai sinh hoá: sau chuyển phôi
14 ngày có nồng độ ß-hCG > 25 ng/ml.
+ Có thai lâm sàng: sau 4 - 5 tuần
chuyển phôi, siêu âm thấy túi ối trong buồng
tử cung.
+ Tỷ lệ làm tổ của phôi được tính bằng
tổng số phôi làm tổ trên tổng số phôi chuyển

vào tử cung.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Một số đặc điểm của các chu kỳ
rã đông noãn (n = 34).
Tuổi trung bình của BN 34,1 ± 5,9,
nhiều nhất 47 tuổi, ít nhất 25 tuổi. Số năm
vô sinh trung bình 5,9 ± 2,8, thời gian vô
sinh ngắn nhất 2 năm, dài nhất 14 năm.
Số noãn được rã đông trung bình tính
trên mỗi BN là 6,2 ± 2,2, người có noãn
được rã đông ít nhất là 4, trường hợp
nhiều nhất là 14 noãn. Thời gian đông lạnh
từ 3 - 15 tháng, trung bình 6,6 ± 3,5 tháng.
2. Tỷ lệ sống của noãn sau rã đông.
Tổng số 211 noãn được rã đông, sau
rã đông 188 noãn (89,09%) không thấy
thay đổi hình thái so với trước khi đông
lạnh; 23 noãn còn lại (10,91%) bị thoái
hóa, bào tương có màu sẫm, có nhiều hạt
thô, màng tế bào bị ly giải, không định rõ
được ranh giới màng bào tương bên trong
màng trong suốt.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018

Ảnh 1: Noãn bào II của người
trước khi đông lạnh.

Ảnh 2: Noãn bào II của người

sau khi rã đông còn sống.

3. So sánh thay đổi hình thái noãn trước và sau rã đông.
Bảng 1:
Thời điểm nghiên cứu
Chỉ tiêu

Trước đông
(n = 188)

Sau rã đông
(n = 188)

p

Độ dày màng trong suốt trung bình (µm)

18,14 ± 3,06

18,20 ± 2,66

> 0,05

Đường kính noãn trung bình (µm)

116,58 ± 4,95

116,18 ± 5,36

> 0,05

Tất cả noãn đều được chụp ảnh trước khi đông lạnh và sau rã đông, sau đó đo độ
dày màng trong suốt, đo đường kính bào tương noãn của 188 noãn sống sau rã đông.
Kết quả cho thấy đường kính bào tương noãn và độ dày màng trong suốt của noãn
trước đông lạnh và sau rã đông thay đổi không có ý nghĩa thống kê. Hình thái noãn
hầu như không biến đổi sau khi đông lạnh.
Trong số 211 noãn nghiên cứu, 182 noãn (86,2%) quan sát thấy thoi vô sắc trước
đông lạnh; 29 noãn còn lại không quan sát thấy thoi vô sắc tại thời điểm đông lạnh.
Sau rã đông, toàn bộ số noãn có thoi vô sắc (182 noãn), chỉ 6/29 noãn không có thoi
vô sắc còn sống sau rã đông.
4. Sự xuất hiện thoi vô sắc của noãn còn sống sau rã đông (n = 188).
Bảng 2:
Nhóm nghiên cứu

Noãn nhìn thấy thoi vô sắc

Noãn không nhìn thấy thoi vô sắc

Sau rã đông 0 giờ

0/182 (0%)

188

Sau rã đông 1 giờ

45/182 (24.7%)

143

Sau rã đông 2 giờ

164/182 (90,1%)

24

Sau rã đông 3 giờ

182/182 (100%)

6

Thời gian

Tại thời điểm ngay sau rã đông, không quan sát thấy thoi vô sắc ở tất cả các noãn
còn sống.
33


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
5. So sánh vị trí thoi vô sắc của noãn trước đông lạnh và noãn sau rã đông.
Bảng 3:
Thời điểm nghiên cứu
Góc giữa thể cực và thoi vô sắc
0 - 30

Trước đông lạnh (n = 182)

Sau rã đông (n = 182)

138/182 (75,8%)

130/182 (71,4%)

28/182 (15,3%)

33/182 (18,1%)

12/182 (6,6%)

15/182 (8,2%)

4/182 (2,3%)

4/182 (2,3%)

0
0

30 - 60

60 - 120
> 120

0

0

Phân tích vị trí giữa thể cực và thoi vô sắc của noãn sau rã đông so với trước đông
lạnh cho thấy một tỷ lệ nhỏ noãn có thay đổi vị trí thể cực. Trước đông lạnh, 138 noãn

có thoi vô sắc nằm ngay dưới và sát thể cực 1, 28 noãn có thoi vô sắc lệch so với thể
cực 1 từ 30 - 600; 12 noãn có thoi vô sắc ở vị trí 60 - 1200 so với thể cực 1, 4 noãn có
thoi vô sắc ở vị trí 120 - 1800. Tuy nhiên, sau rã đông, chỉ 130 noãn có thoi vô sắc ở
vị trí 0 - 300. Tỷ lệ thoi ở vị trí 30 - 1200 tăng từ 21,9% lên 26,3%.
6. Kết quả thực hiện TTTON của noãn sau rã đông.
Noãn thụ tinh bình thường: 134/188 (71,28%); noãn thụ tinh bất thường: 3/188 (1,6%);
số phôi phân chia: 124/134 (92,5%); số phôi tốt ngày 3: 48/124 (38,71%); số phôi
chuyển trung bình: 2,5, ít nhất 1 phôi, nhiều nhất 3 phôi; trong 34 kỳ chuyển phôi,
12 chu kỳ có thai sinh hóa 35,29%, 10 chu kỳ có thai lâm sàng (29,41%), trong đó
9 trường hợp một thai, 1 trường hợp hai thai và 1 trường hợp sảy thai (8,3%) ở tuần
thứ 12; tỷ lệ làm tổ: 11/85 (12,94%).
BÀN LUẬN
Hiện nay, việc bảo quản lạnh noãn
người chủ yếu thực hiện theo hai phương
pháp đông lạnh hạ nhiệt độ chậm và thủy
tinh hóa. Với phương pháp đông lạnh hạ
nhiệt độ chậm, cố gắng giảm thiểu những
tác động bất lợi đến tế bào bằng cách
kiểm soát đặc tính lý sinh của quá trình
đông lạnh như tốc độ làm lạnh và làm ấm,
kết hợp với sử dụng chất bảo vệ đông
lạnh thích hợp. Với quy trình đông lạnh
hạ nhiệt độ chậm, tế bào bị khử nước
thông qua quá trình cân bằng thẩm thấu
khi hình thành đá ngoại bào. Trong khi đó,
thủy tinh hóa được coi là “phương pháp
34

đông lạnh không cân bằng”, phương pháp
này sử dụng các chất bảo vệ đông lạnh

có nồng độ rất cao, kết hợp với tốc độ
làm lạnh cực nhanh khiến dung dịch có
thể rắn hóa mà không trải qua hình thành
tinh thể đá, giảm thiểu tổn thương đông
lạnh cho tế bào. Một số báo cáo gần đây
cho thấy tỷ lệ sống của noãn người đông
lạnh ngày càng được nâng cao khi sử dụng
phương pháp thủy tinh hóa. Bo và CS (2015)
thủy tinh hóa 466 noãn người cho tỷ lệ
sống sau rã đông đạt 86,69% [4]. Đặc biệt,
Antinori M và CS (2007) công bố tỷ lệ
sống lên đến 99,4% khi nghiên cứu trên
330 noãn đông lạnh bằng phương pháp


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
thủy tinh hóa [3]. Nghiên cứu của chúng tôi,
tỷ lệ noãn sống là 89,09%, tương đương
nhiều nghiên cứu trên thế giới.
Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình
đông lạnh (đặc biệt là quá trình khử
nước) đến hình thái noãn, chúng tôi tiến
hành đo đường kính bào tương noãn và
độ dày màng trong suốt các noãn còn
sống sau rã đông, so sánh với trước khi
đông lạnh. Kết quả cho thấy, sau rã đông,
kích thước và hình dạng noãn khôi phục
lại hoàn toàn so với trước đông lạnh
(bảng 1). Tương tự kết quả của chúng tôi,
Martínez-Burgos M (2011) [7] nghiên cứu

trên 53 noãn được thủy tinh hóa nhận
thấy, sau rã đông, tỷ lệ noãn khôi phục lại
hoàn toàn thể tích ban đầu là 97,5%;
trong khi ở nhóm noãn đông lạnh chậm,
tỷ lệ khôi phục lại thể tích hoàn toàn 85,7%.
Tác giả cho rằng, khả năng khôi phục lại
thể tích nhanh hơn có thể là dấu hiệu
cho thấy màng tế bào và bào tương noãn
“khỏe mạnh” hơn.
Thay đổi nhiệt độ trong quá trình trữ
lạnh - rã đông có thể dẫn tới những thay
đổi trong cấu trúc của thoi vô sắc noãn.
Thoi vô sắc đóng vai trò quan trọng trong
quá trình thụ tinh, bao gồm hoàn tất giảm
phân, đẩy ra thể cực thứ hai, di chuyển tiền
nhân và phân chia tiếp theo của hợp tử.
Khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp, các phân
tử tubulin sẽ giải trùng hợp, làm biến mất
cấu trúc vi ống. Do đó, việc tái trùng hợp
lại chính xác các vi ống sẽ đảm bảo cho
quá trình thụ tinh diễn ra bình thường,
giảm nguy cơ hình thành phôi lệch bội.
Việc sử dụng kính hiển vi tăng cường ánh
sáng phân cực, các nhà nghiên cứu có thể
quan sát hình ảnh thoi vô sắc trong bào
tương noãn. Nhiều nghiên cứu cho thấy,

khi được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu ở
nhiệt độ 370C, hình ảnh thoi vô sắc quan
sát thấy sau khoảng từ vài chục phút đến

vài giờ sau rã đông [6]. Kết quả nghiên
cứu của chúng tôi cho thấy, sau 3 giờ
nuôi cấy, thoi vô sắc đã phục hồi ở 100%
noãn sau rã đông (bảng 2). Việc xác định
được thời điểm tái trùng hợp hoàn toàn
của thoi vô sắc để lựa chọn thời gian thụ
tinh thích hợp có vai trò quyết định trong
nâng cao tỷ lệ thụ tinh của noãn sau rã
đông cũng như hạn chế các phôi lệch bội
sau này.
Căn cứ vào kết quả nghiên cứu cũng
như các công bố khác trên thế giới,
chúng tôi lựa chọn thời điểm 3 giờ sau rã
đông để thực hiện kỹ thuật ICSI đối với
noãn đông lạnh, kết quả: tỷ lệ thụ tinh là
71,28%; tỷ lệ thai lâm sàng đạt 29,41%
và tỷ lệ phôi làm tổ đạt 12,94%. Kết quả
của chúng tôi cũng tương đồng với nhiều
nghiên cứu khác trên thế giới. Antinori M
(2007) [6] thực hiện ICSI trên 328 noãn
đông lạnh và 726 noãn “tươi”, trong đó
nhóm noãn thủy tinh hóa có tỷ lệ thụ tinh
93%, tỷ lệ thai lâm sàng 32,5%, tỷ lệ làm
tổ 13,2%, khác biệt không có ý nghĩa thống
kê so với nhóm noãn tươi không đông lạnh.
Từ kết quả thụ tinh của noãn rã đông, đặc
biệt kết quả trên lâm sàng cho phép nhận
định rằng, tuy vẫn còn nhiều tranh cãi liên
quan đến tác động của quy trình đông
lạnh đến cấu trúc nội bào có thể ảnh

hưởng đến tiềm năng phát triển của noãn
sau rã đông, nhưng với những nỗ lực cải
tiến về thành phần chất bảo quản cũng như
dụng cụ chứa mẫu, hiệu quả của quy trình
đông lạnh thủy tinh hóa noãn đã được
nâng cao rõ rệt.
35


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu 211 noãn đông lạnh
rã đông và 34 chu kỳ rã đông noãn chuyển phôi cho thấy:
- Hình thái noãn về kích thước bào
tương và độ dày màng trong suốt sau rã
đông không thay đổi có ý nghĩa thống kê
so với trước đông lạnh.
- Thoi vô sắc noãn sau rã đông phục
hồi hoàn toàn sau 3 giờ nuôi cấy.
- Tỷ lệ noãn sống sau rã đông 89,09%,
tỷ lệ phôi tốt ngày 3 là 38,71%, tỷ lệ thụ
tinh 71,28%, tỷ lệ thai lâm sàng 29,41%,
tỷ lệ làm tổ 12,94%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Viết Tiến, Nguyễn Thị Ngọc
Phượng và CS. Đồng thuận đánh giá và phân
loại noãn, phôi trong hỗ trợ sinh sản. Hội Phụ
sản khoa và Sinh đẻ có kế hoạch Việt Nam
(VINAGOFPA), Chi hội Y học sinh sản Việt Nam
(VSRM). 2012.

36

2. Đặng Quang Vinh và CS. Trữ lạnh phôi
và trứng trong hỗ trợ sinh sản. Vô sinh và hỗ
trợ sinh sản. Hosrem. 2007.
3. Antinori M, Licata E, Dani G et al.
Cryotop vitrification of human oocytes results
in high survival rate and healthy deliveries.
Reprod Biomed Online. 2007, 14 (1), pp.72-79.
4. Bo Xu, Xian-hong Tong et al. Cryotop
vitrification affects oocyte quality and embryo
developmental potential. EC Gynaecology.
2015, 1 (2), pp.46-52.
5. Chen C. Pregnancy after human oocyte
cryopreservation. Lancet. 1986, 2, pp.884-886.
6. Ciotti P.M, Porcu E, Notarangelo L et al.
Meiotic spindle recovery is faster in vitrification
of human oocytes compared to slow freezing.
Fertil Steril. 2009, 91 (6), pp.2399-2407.
7. Martínez-Burgos M, Herrero L, Megías
D et al. Vitrification versus slow freezing of
oocytes: Effects on morphologic appearance,
meiotic spindle configuration and DNA damage.
Fertil Steril. 2011, 95 (1), pp.374-377.
8. Oktay K, Cil A.P, Bang H. Efficiency of
oocyte cryopreservation: A meta-analysis.
Fertil Steril. 2006, 86, pp.70-80.