Nghiên cứu ứng dụng quy trình phát hiện SNP RS9263726 để sàng lọc alen HLA-B58 01 bằng phương pháp PCR RFLP

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN SNP
RS9263726 ĐỂ SÀNG LỌC ALEN HLA-B*58:01 BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP
Ngô Trường Giang*; Trần Văn Khoa*
Nguyễn Minh Tâm*; Trần Thị Thu Huyền*
TÓM TẮT
Mục tiêu: ứng dụng quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng
phương pháp PCR-RFLP. Đối tượng và phương pháp: 36 mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại
alen HLA-B được tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng PCR-RFLP xác định kiểu gen của
SNP rs9263726, điện di sản phẩm trên gel agarose 2% và phân tích kết quả để kết luận kiểu
gen, giải trình tự gen PSORS1C1 10% số mẫu để kiểm chứng quy trình. Kết quả: trong 36 mẫu
AND, sàng lọc được 5 mẫu dương tính với HLA-B*58:01. Kết luận: đã ứng dụng được quy trình
phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP.
* Từ khóa: HLA-B*58:01; rs9263726; PCR-RFLP.

Applying a Protocol to Detect SNP RS926726 for Screening HLAB*58:01 Allele Using PCR-RFLP Technique
Summary
Objectives: Applying a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene
using PCR-RFLP technique. Subjects and methods: 36 blind blood samples with unknown
HLA-B allelic types, total DNA was extracted, SNP rs9263726 was detected using PCR-RFLP
technique, electrophoresis PCR products in 2% agarose gel and analysis, sequencing 10%
samples. Result: We were able to detect HLA-B*58:01 in 5 of 36 samples. Conclusion: We
have applied a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using
PCR-RFLP technique.
* Key words: HLA-B*58:01; PCR-RFLP; rs9263726.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản
ứng thuốc thể nặng ngày càng giảm nhờ

nguyên tắc dùng thuốc được hoàn thiện
theo hướng cá thể hoá. Tuy nhiên, số
lượng các dược chất được đưa vào điều
trị lâm sàng ngày càng tăng. Khi phản

ứng thuốc nặng xảy ra, tỷ lệ bệnh nhân
(BN) tử vong khá cao (30%). Do đó, dự
phòng phản ứng thuốc thể nặng vẫn còn
là một vấn đề rất đáng quan tâm. Hiện
nay, một số kháng nguyên bạch cầu
người (HLA) được sử dụng như marker
để phát hiện phản ứng thuốc nặng như:

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Ngô Trường Giang ()
Ngày nhận bài: 14/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/05/2018
Ngày bài báo được đăng: 09/06/2018

37


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
hội chứng Stevens Johnson hay nhiễm
độc hoại tử. Trong các HLA này, HLAB*58:01 là một marker di truyền có liên
quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể
nặng khi dùng thuốc allopurinol, đặc biệt
ở cộng đồng người châu
3 . Do đó,
cần sàng lọc HLA-B*58:01 trước khi dùng
allopurinol để dự phòng phản ứng thuốc

thể nặng do thuốc. Tuy nhiên, việc phát
hiện trực tiếp HLA-B*58:01 đòi hỏi máy
móc hiện đại, tiêu tốn nhiều thời gian và
tiền bạc. Gần đây, các nghiên cứu đã
phát hiện một số SNP liên kết khá chặt
với HLA-B*58:01 [2]. Trong số đó, SNP
rs9263726 (110G>A) trên gen PSORS1C1
liên kết hoàn toàn với HLA-B*58:01. Do
đó, có thể phát hiện HLA-B*58:01 thông
qua SNP này. PCR-RFLP là một kỹ thuật
đơn giản, dễ triển khai, thời gian cho kết
quả nhanh, giá thành rẻ và khá hiệu quả
để phát hiện SNPs.
Trước thực tiễn đó, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu này với mục tiêu: Ứng
dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801
thông qua marker SNP rs9263726
(110G>A) bằng kỹ thuật PCR-RFLP để
dự phòng phản ứng thuốc thể nặng trên
BN s dụng allopurinol.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
36 mẫu máu chưa biết loại alen HLAB, chống đông bằng EDTA thu thập tại
Học viện Quân y. 2 mẫu ADN đã biết
trước kiểu gen của SNP rs9263726 bằng
phương pháp giải trình tự Sanger sử
dụng làm chứng âm (GG) và chứng
dương (GA).
38

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Tách chiết ADN tổng số từ 36 mẫu
máu thu thập được: tách chiết bằng kít
tách chiết ADN từ máu toàn phần của
Qiagen.
* PCR-RFLP phát hiện gen HLAB*58:01:
- Khuếch đại gen PSORS1C1: trình tự
các cặp mồi tham khảo theo Kaiko và CS
(2012) [5].
Thành phần phản ứng PCR nhân gen:
master mix: 12,5 μl; primers (10 pmol/μl):
0,25 μl; nước deion: 7 μl; mẫu: 5 μl, tổng
thể tích 25 μl.
Chu trình nhiệt phản ứng PCR:
trong 5 phút; tiếp theo 30 chu kỳ:
trong 30 giây, 600C trong 60 giây,
trong 30 giây. Cuối cùng 720C
5 phút.

940C
940C
720C
trong

Sản phẩm PCR được điện di trên gel
agarose 2%, phân tích kết quả.
* X lý enzym giới hạn:
- Các mẫu có kết quả nhân gen
PSORS1C1 được xử lý cùng enzym

Fok1.
- Thành phần hỗn hợp xử lý enzym:
sản phẩm nhân gen: 5 μl; enzym Fok1:
0,4 ui.
- Chu trình nhiệt xử lý enzym: ủ hỗn
hợp ở 37oC trong 2 giờ, bất hoạt enzym ở
65oC trong 20 phút.
Sản phẩm thu được điện di trên gel
agarose 2%, phân tích kết quả.
* Giải trình tự Sanger: sản phẩm nhân
gen PSORS1C1 được tinh sạch, giải trình
tự Sanger.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả nhân gen PSORS1C1.
Sản phẩm nhân gen được điện di trên gel agarose 2% trong 30 phút:

Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm nhân gen PSORS1C1.
(-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp;
các dải còn lại: B ng gen PSORS C có kích thước 260 bp)
Kết quả cho thấy băng xuất hiện khi điện di sản phẩm nhân gen đều rõ ràng, đúng
kích thước thiết kế và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, điều kiện cho phản ứng
nhân gen được tối ưu.
Sản phẩm nhân gen xử lý cùng enzym cắt giới hạn.
2. Kết quả xử lý enzym cắt giới hạn để phát hiện SNP rs9263726.
Sản phẩm nhân gen PSORS1C1 được xử lý cùng enzym cắt giới hạn Fok1.
Sản phẩm xử lý enzym điện di trên gel agarose 2%.

Hình 2: Kết quả xử lý enzym sản phẩm nhân gen PSORS1C1.
(-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp; các dải còn lại: Sản phẩm x
lý enzym mẫu nhân gen PSORS1C1)
39


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Dựa vào số vạch thu được trên điện di
sản phẩm xử lý enzym Fok1, có thể kết
luận được kiểu gen:
- Những mẫu chỉ xuất hiện 1 băng tại
vị trí 260 bp có kiểu gen SNP rs9263726
dạng đồng hợp tử GG, do đó không mang
gen HLA-B*58:01.
- Những mẫu xuất hiện cả 3 băng 260
bp; 141 bp và 119 bp có kiểu gen SNP
rs9263726 dạng dị hợp tử GA, do đó
mang gen HLA-B*58:01 ở dạng dị hợp tử.
- Những mẫu chỉ xuất hiện 2 băng 141 bp
và 119 bp có kiểu gen SNP rs9263726
dạng đồng hợp tử AA, do đó mang gen
HLA-B*58:01 ở dạng đồng hợp tử.
Như vậy, trong 36 mẫu nghiên cứu,
chúng tôi phát hiện được 5 mẫu: 53; 57;
59; 70; 82 xuất hiện 3 băng. Đây là

những mẫu mang kiểu gen HLA-B*58:01
ở dạng dị hợp tử.
Bằng kỹ thuật này, bước đầu đã xác
định được 5/36 mẫu (13,9%) nghiên cứu

có kiểu alen HLA-B*58:01.
3. Kết quả giải trình tự Sanger.
Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện
trên 36 mẫu máu chưa biết kiểu gen SNP
rs9263726. Để kiểm chứng quy trình, tiến
hành chọn 10% trong tổng số 36 mẫu
nghiên cứu tương ứng với 4 mẫu để giải
trình tự Sanger. Trong 4 mẫu, chọn 2
mẫu âm tính với SNP rs9263726
(110G>A) có kiểu gen GG và 2 mẫu dị
hợp tử SNP rs9263726 (110G>A) có kiểu
gen GA được xác định bằng phương
pháp PCR-RFLP ở trên.

Hình 3: Kết quả giải trình tự sản phẩm nhân gen PSORS1C1 của 4 mẫu 45; 52; 70 và 82.
Tại vị trí 119 bp của hai mẫu 45, 52 chỉ xuất hiện 1 đỉnh G màu đen. Do đó, kiểu gen
SNP rs9263726 của mẫu 45, 52 là GG.
Tại vị trí 119 bp của hai mẫu 70, 82 xuất hiện 2 đỉnh: 1 đỉnh G màu đen, 1 đỉnh A
màu xanh lá cây. Do đó, kiểu gen SNP rs9263726 của mẫu 70, 82 là GA.
40


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
BÀN LUẬN
HLA-B*58:01 là một marker khá quan
trọng trong tiên lượng phản ứng thuốc thể
nặng khi dùng thuốc allopurinol. Hung và
CS (2005) báo cáo mối liên hệ rất chặt
chẽ giữa HLA-B*58:01 và dị ứng thể nặng
khi dùng thuốc allopurinol trên người Hán

- Trung Hoa với độ nhạy 100%, độ đặc
hiệu 85% chỉ số OR:580,3 [3]. Các nghiên
cứu tiếp theo trên cộng đồng người Thái,
Hàn Quốc [9, 10] càng chỉ rõ điều này. Do
đó, việc sàng lọc gen này trước khi chỉ
định allopurinol cho BN rất cần thiết. Hiện
nay, có thể trực tiếp sàng lọc HLA-B*5801
bằng các kỹ thuật như giải trình tự gen [2]
hay đếm dòng chảy tế bào [8]. Tuy nhiên,
các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị máy
móc khá phức tạp, kỹ thật viên có trình độ
cao dẫn tới giá thành xét nghiệm khá cao
nên khó triển khai rộng rãi.
Một số nghiên cứu 2 đã chỉ ra HLAB*58:01 liên kết với một số SNP. Trong
đó, SNP rs9263726 trên gen PSORS1C1
cách gen HLA-B 215 kb, liên kết hoàn
toàn với gen HLA-B*58:01 (r2 = 1; D’ = 1)
5 . Do đó, có thể gián tiếp sàng lọc HLAB*58:01 thông qua SNP này.
Hiện nay, có thể sử dụng kít TaqMan
SNP Genotype Assays để sàng lọc SNP
rs9263726. Mặc dù sàng lọc khá hiệu
quả, kít có giá thành khá cao, đòi hỏi
trang thiết bị hiện đại nên khó triển khai
trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi đã hoàn thiện một quy trình
sàng lọc gián tiếp gen HLA-B*58:01 thông
qua SNP rs9263726 bằng phương pháp
PCR-RFLP với nhiều ưu điểm như: không
đòi hỏi máy móc quá hiện đại, đơn giản,
dễ thực hiện, giá thành thấp, từ đó có thể

triển khai rộng rãi.

Trong quá trình chọn mẫu làm chứng
âm và chứng dương cho PCR-RFLP
bằng phương pháp giải trình tự Sanger,
chúng tôi chỉ phát hiện 2 kiểu gen SNP
rs9263726 là GG và GA. Kiểu gen đồng
hợp tử AA rất hiếm trong cộng đồng,
chưa phát hiện thấy trong 36 mẫu nghiên
cứu, 0/27 mẫu trong nghiên cứu của
Kaiko [5] hay 3/200 mẫu trong nghiên cứu
của Hung 3 . Do đó, trong số các mẫu
dương tính, chỉ có mẫu mang kiểu gen
GA để giải trình tự đối chiếu.
Khi so sánh kết quả nghiên cứu với
các tác giả khác, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ
mang gen là 13,9%, thấp hơn so với
nghiên cứu của Hung và CS trên người
Hán - Trung Hoa (19,5%) 3 , điều này có
thể lý giải do cỡ mẫu của chúng tôi khá
nhỏ, chưa đại diện cho cộng đồng.
Khi kiểm chứng quy trình bằng giải
trình tự Sanger ngẫu nhiên 10% số mẫu
của nghiên cứu, chúng tôi thu được kết
quả hoàn toàn đồng nhất giữa phương
pháp PCR-RFLP và sequencing. Điều đó
chứng tỏ nhân gen PSORS1C1 và hoạt
động cắt của enzym Fok1 hoàn toàn theo
thiết kế.
KẾT LUẬN

Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy
trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng
lọc alen HLA-B*58:01 bằng kỹ thuật PCRRFLP, phát hiện được 5/36 mẫu nghiên
cứu mang kiểu alen HLA-B*58:01.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T.
Human leukocyte antigens and drug
hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin
Immunol. 2007, 7, pp.317-323.

41


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
2. Tohkin M, Kaniwa N et al. A wholegenome
association
study
of
major
determinants for allopurinol-relates StevensJohnson syndrome and toxic epidermal
necrolysis
in
Japanese
patients.
Pharmacogenomics in Press. 2011.
3. Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T et al.
HLA-B*5801 allele as a genetic marker for
severe cutaneous adverse reactions caused
by allopurinol. Proc Natl Acad Sci. USA. 2005,
102, pp.4134-4139.

4. Kang H.R, Jee Y.K et al. Positive and
negative associations of HLA class 1 alleles
with allopurinol-induce SCARs in Korean.
Pharmacogenets Genomic. 2011, pp.303-307.
5. Kaiko M, Jun N et al. Developed of a
rapid and inexpensive assay for detecting a
surrogate genetic polymorphism of HLAB*5801. Pharmacogenet. 2012, pp.447-450.
6 Bunce M, O’Neill C M, Barnardo M C et
al. Phototyping: comprehensive DNA typing
for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5

42

& DQB1 by PCR with 144 primer mixes
utilizing sequence-specific primers (PCRSSP). Tissue Antigens. 1995, 46, pp.355-367.
7. Robinson J, Mistry K, McWilliam H,
Lopez R, Parham P, Marsh S.G. The
IMGT/HLA database. Nucleic Acids Res.
2011, 39, pp.D1171-1176.
1

8. Kostenko L , Kjer-Nielsen L, Nicholson
I, Hudson F et al. Rapid screening for the
detection of HLA-B57 and HLA-B58 in
prevention of drug hypersensitivity. Tissue
Antigens. 2011, 78, pp.11-20.
1

9. Tassaneeyakul W , Jantararoungtong
T, Chen P, Lin P.Y et al. Strong association

between HLA-B*5801 and allopurinol-induced
Stevens-Johnson
syndrome
and
toxic
epidermal necrolysis in a Thai population.
Pharmacogenet/ 2009, pp.704-709.
1

10. Kang H.R , Jee Y.K, Kim Y.S, Lee
C.H, Jung J.W et al. Positive and negative
associations of HLA class I alleles with
allopurinol-induced SCARs in Koreans.
Pharmacogenet. 2011, pp.303-307.