Phát hiện nhiễm sắc thể philadelphia trên bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt bằng kỹ thuật PCR

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010

Nghiên cứu Y học

PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN
UNG THƯ BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT BẰNG KỸ THUẬT
PCR
Phan Đình Điền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thái Sơn**

TÓM TẮT
Đặt vấn ñề và Mục tiêu nghiên cứu: Nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện trong máu ngoại biên
và tủy xương của bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia-CML)
với tỷ lệ lớn hơn 95%, ñây là sản phẩm của sự chuyển ñoạn t(9;22), trong ñó ABL proto-oncogene từ
nhiễm sắc thể số 9 ñến gắn vào vị trí 5’ của gene BCR trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11).
Với kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), ở ñây là RT-PCR chúng ta có thể phát hiện ñược
gene tổ hợp BCR-ABL của nhiễm sắc thể Philadelphia. Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát hiện và tiến
hành phân tích gene tổ hợp BCR-ABL bao gồm BCR-ABL b2a2 và BCR-ABL b3a2 ñể xác ñịnh sự
hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML.
Đối tượng nghiên cứu: 60 bệnh nhân ñược xác ñịnh chẩn ñoán là CML với tủy ñồ dương tính và
ñang ñược ñiều trị ngoại trú tại Khoa Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009.
Phương pháp và mẫu nghiệm nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt
ngang, mô tả. 04 ml máu ngoại biên của bệnh nhân sẽ ñược lấy và cho vào tube có chất chống ñông
bằng EDTA. Máu toàn phần sẽ ñược trích ly RNA, khuếch ñại 2 types của gene tổ hợp BCR-ABL là
b2a2 và b3a2 bằng kỹ thuật RT-PCR, tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng
ñộ chuẩn của gene β-glucuronidase (GUS) S1:100.000 copies/ml, S2: 10.000 copies/ml và S3:1.000
copies/ml, ñược phát hiện real time cùng với mẫu nghiệm. Phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5
Real-Time PCR System Software.
Kết quả: Phát hiện ñược gene tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML với tỷ
lệ 98.33% (59/60 BN) trong ñó BCR-ABL b2a2: 32.20 %, BCR-ABL b3a2: 44.07 % và dạng kết hợp
BCR-ABL b2a2 + b3a2 chiếm tỷ lệ 23.73 %.
Kết luận: Những kết quả trên cho thấy có thể dùng kỹ thuật PCR ñể phát hiện nhiễm sắc thể

Philadelphia. Việc so sánh ñối chiếu kết quả này với các tác giả khác trong và ngoài nước cũng ñược
bàn luận ñể khẳng ñịnh giá trị của kỹ thuật.
Từ khóa: Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, Gene tổ hợp BCR-ABL, Hoạt tính Tyrosine
Kinase, Protein P210, Xét nghiệm RT-PCR.

ABSTRACT
DETECTION AND QUANTITATIVE THE PHILADELPHIA CHROMOSOME BY PCR
TECHNIQUE IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA PATIENTS
Phan Dinh Dien, Pham Hung Van, Nguyen Thai Son
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 - 2010: 565 - 569
Background: The BCR-ABL fusion gene, formed by rearrangement of the breakpoint cluster
region (bcr) on chromosome 22 with the abl proto-oncogene on chromosome 9, is present in virtually
all Chronic Myeloid Leukemia (CML) patients. The t(9;22) (q34;q11) translocation associated with
BCR-ABL leads to a cytogenesis aberration known as Philadelphia chromosome, and it could be
detected by PCR technique.
Objective: To detect and quantitative analysis for fusion genes BCR-ABL including BCR-ABL
b2a2 and BCR-ABL b3a2 transcripts to confirm the presentation of Philadelphia chromosome in
CML patients.
*Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Chợ Rẫy ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên hệ: TS Phạm Hùng Vân, ĐT: 0903698920, Email:

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010

565


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010

Nghiên cứu Y học

Subjects: 60 cases of CML patients in chronic phase (CP) were confirmed by positive bone
marrow smears that were undergoing treated in out patient department of Cho Ray hospital.
Method and specimens: 04ml peripheral blood in an EDTA tube was collected, in this
quantitative assay; extracted RNA is subject to Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR) to amplify 02 types of BCR-ABL fusion transcripts: b2a2 and b3a2. An additional
amplification of the GUS gene (β-glucuronidase) is performed as a control for sample RNA quality
and as a reference for relative quantification.
Results: Results show that the BCR-ABL fusion gene was found in 59 (98.33%) of these 60 blood
samples. In these 59 positive cases, BCR-ABL b3a2 type has the highest rate of 44.07%, followed by
BCR-ABL b2a2 type with 32.2%, and BCR-ABL b2a2 + b3a2 combinative type with 23,73%.
Conclusion: These results indicate that PCR technique can be used to detect Philadelphia
chromosome. We also compare our results with other local and foreign researchers to confirm the
accuracy of this technique.
Keywords: Chronic Myeloid Leukemia, BCR-ABL, Tyrosine kinase, Protein P210, RT-PCR.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) là một bệnh ác
tính của hệ tạo máu với ñặc ñiểm chính là sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt. Trong bệnh CML có một sự
biến ñổi nhiễm sắc thể ñặc trưng ñó là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph)(4), ñây là sản phẩm của sự
chuyển ñoạn giữa nhiễm sắc thể số 9 và nhiễm sắc thể số 22 ký hiệu t(9;22)(5). Theo khảo sát của các
nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới, nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện ở máu ngoại biên và tuỷ
xương của bệnh nhân CML là lớn hơn 95%(3,1).
Nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy bản chất gene của nhiễm sắc thể Philadelphia là
gene tổ hợp BCR-ABL(6) ñược tạo thành do sự chuyển ñoạn của ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc
thể số 9 ñến gắn vào vị trí 5’ của BCR gene trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11). Trong bệnh
CML, gen tổ hợp BCR-ABL chủ yếu sẽ tạo ra một loại protein có hoạt tính Tyrosine Kinase ñó là
protein P210 (protein có trọng lượng phân tử 210 KD) và protein này chính là nguyên nhân chủ yếu
gây ra bệnh CML(7). Tùy theo vị trí sắp xếp các ñiểm gãy (breakpoints) khác nhau trên BCR-gene và
ABL-gene ta có các sản phẩm BCR-ABL khác nhau: BCR-ABL b2a2 nếu vị trí sắp xếp các ñiểm gãy
nằm giữa exon 13 và 14, hay ñó sẽ là BCR-ABL b3a2 nếu vị trí sắp xếp các ñiểm gãy nằm ở giữa

exon 14 và 15(6). Phát hiện ñược gene tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML
ñồng nghĩa với phát hiện ñược nhiễm sắc thể Philadelphia. Do vậy việc tiến hành xây dựng một kỹ
thuật mới ñể phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh
nhân CML là một ñiều hết sức cần thiết trong chẩn ñoán và ñiều trị.

Hình 1. Sự tạo thành gen BCR-ABL (Salesse et al 2002)

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010

566


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010

Nghiên cứu Y học

ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
60 bệnh nhân (bao gồm 32 nữ, chiếm tỉ lệ 53.33% và 28 nam, chiếm tỉ lệ 46.67 %) với ñộ tuổi
nhỏ nhất là 20 ñến lớn nhất là 74 tuổi, ñược chẩn ñoán ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic
Myeloid Leukemia, CML) với tủy ñồ dương tính và ñang ñược ñiều trị bằng các loại thuốc Hydrea
(Không sử dụng các loại thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase như Imatinib, Dasatinib hay
Nilotinib…) tại phòng khám huyết học của Bệnh Viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009.

Phương pháp
Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy 04ml máu tĩnh mạch ngoại biên, cho vào ống nghiệm có chất chống ñông EDTA (Ethylene
Diamine Tetra Acetic acid), lắc nhẹ ñể trộn ñều máu với chất chống ñông, bảo quản ở nhiệt ñộ 4-8oC
trong vòng 08 giờ phải chuyển ñến phòng thí nghiệm ñể xử lý mẫu.
Kỹ thuật xét nghiệm

Máu toàn phần sẽ ñược trích ly RNA với bộ thuốc thử ñã ñược chuẩn hoá của Chomczynski (2).
Khuếch ñại 2 types của gene tổ hợp BCR-ABL là b2a2 và b3a2 bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction) sau ñó tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR
nhờ 03 nồng ñộ chuẩn của gene β-glucuronidase (GUS) S1: 100.000 bản sao/ml, S2: 10.000 bản
sao/ml và S3:1.000 bản sao/ml, ñược phát hiện real time cùng với mẫu nghiệm.
Phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software.

KẾT QUẢ
Tương quan giữa ñộ tuổi và bệnh CML (Chronic Myeloid Leukemia)
Bảng 1. Mối tương quan giữa ñộ tuổi và bệnh CML
Độ tuổi
< 30
30 – 40
41 – 50
51 – 60
61 – 74

Số lượng
12 / 60
11 / 60
12 / 60
17 / 60
08 / 60

Tỷ lệ %
20.00
18.33
20.00
28.33
13.33

Những kết quả ghi nhận ñược cho thấy ña số bệnh nhân CML ñều ở ñộ tuổi của người ñã trưởng
thành, ñặc biệt tỷ lệ này khá cao ở tuổi trung niên (41 – 60) # 48.33%.

Kết quả phân tích mẫu gene BCR-ABL từ 60 bệnh nhân CML
Qua phân tích mẫu máu ngoại biên của 60 bệnh nhân CML ñã ñược xác ñịnh chẩn ñoán với tủy
ñồ dương tính và ñang ñiều trị ngoại trú tại Bệnh Viện Chợ Rẫy TP.Hồ Chí Minh, thuốc ñiều trị chủ
yếu là Hydroxyure (Hydrea). Chưa có bệnh nhân nào ñược ñiều trị trị với các loại thuốc ức chế hoạt
tính Tyrosine Kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib... Chúng tôi ñã phát hiện ñược 59/60
trường hợp (98,33%) mẫu máu ñược ñem phân tích có sự hiện diện gene BCR-ABL.
Tần suất xuất hiện các dạng chuyển ñoạn của nhiễm sắc thể Philadelphia
Bảng 2. Tần suất xuất hiện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong bệnh nhân CML
Vị trí chuyển ñoạn
Của nhiễm sắc thể
Philadelphia

BCR-ABL b2a2
BCR-ABL b3a2
BCR-ABL b2a2 + b3a2

Mẫu nghiệm dương tính với
BCR-ABL
(n = 59)
Số lượng phát
Tỷ lệ %
hiện
19
32.20
26
44.07

14
23.73

Bằng kỹ thuật RT-PCR, gene tổ hợp BCR-ABL ñã xuất hiện trong máu ngoại biên của 59/60

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010

567


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010

Nghiên cứu Y học

bệnh nhân: 19 người mang BCR-ABL b2a2 (32.20 %); 26 người mang BCR-ABL b3a2 (44.07 %) và
14 người mang dạng kết hợp b2a2 + b3a2 (23.73 %).
Hình ảnh mẫu gene bình thường khi khảo sát bằng RT-PCR

STANDARD
1,2,3
GUS

Hình 2. Mẫu gene của người bình thường
(không có nhiễm sắc thể Philadelphia)
Ở hình này chúng ta thấy sự hiện diện của 3 ñường chuẩn: S1, S2, và S3. Sự xuất hiện của GUS
(gene bạch cầu của chính bệnh nhân) nói lên quá trình phiên mã ngược và khuếch ñại các bản sao từ
phản ứng RT-PCR ñã ñược thực hiện thành công. Không phát hiện sự hiện diện các bản sao của gene
BCR-ABL.
Hình ảnh mẫu gene có chuyển ñoạn dạng b2a2
BN.số 58. b2a2 = 291.000 copies/ml

STANDARD
1,2,3

GUS
b2a2

Hình 3. Mẫu có phát hiện nhiễm sắc thể
Philadelphia với sự chuyển ñoạn ở vị trí b2a2
Ở hình 3 ngoài sự hiện diện của 03 ñường chuẩn S1, S2, S3 và GUS còn phát hiện ñuợc sự hiện
diện của nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển ñoạn ở vị trí b2a2 chứng tỏ ñây là mẫu máu của
bệnh nhân ñang mang bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (CML).
Hình ảnh mẫu gene có chuyển ñoạn dạng b3a2
BN.số:51. b3a2 = 367 copies/ml
STANDARD
1,2,3

GUS
b3a2

Hình 4. Mẫu có phát hiện nhiễm sắc thể

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010

568


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010

Nghiên cứu Y học

Philadelphia với sự chuyển ñoạn ở vị trí b3a2
Tương tự như trên chúng tôi phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia có sự chuyển
ñoạn ở vị trí b3a2 ở Hình 4.
Hình ảnh mẫu gene có chuyển ñoạn dạng kết hợp b2a2+b3a2
BN.số: 60. b2a2 = 552 copies/ml
b3a2 = 195.600 copies/ml
STANDARD
1,2,3
GUS
b3a2
b2a2

Hình 5. Mẫu có phát hiện sự chuyển ñoạn ở cả
hai vị trí b2a2 và b3a2
Trong một số bệnh nhân, qua phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System
Software, chúng tôi thấy có sự hiện diện sự chuyển ñoạn ở cả 02 vị trí b2a2 và b3a2 trên nhiễm sắc
thể Philadelphia.

BÀN LUẬN
60 bệnh nhân CML ñã ñược xác ñịnh chẩn ñoán với tủy ñồ dương tính từ phòng thí nghiệm huyết
học bệnh viện Chợ Rẫy và ñang ñược ñiều trị ngoại trú tại phòng khám huyết học của bệnh viện.
Thuốc sử dụng ñiều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea), ñây là một loại thuốc chống chuyển hoá, tác
dụng nhanh, ít ñộc, ít gây suy tủy(8). Tuy nhiên loại thuốc này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn tác
nhân chính gây bệnh là các bản sao của gene tổ hợp BCR-ABL(8), ñiều này giải thích vì sao khi chúng
tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR có thể phát hiện sự hiện diện gen tổ hợp BCR-ABL ở 59/60 bệnh nhân
CML (98.33%). Carol D. Jone và CS (2003)(3) cũng như Susan Branford 2006(1) cho rằng tỷ lệ này là
lớn hơn 95% và như vậy là hoàn toàn tương ñồng với kết quả của chúng tôi. Cũng từ những kết quả
trên chúng ta thấy rằng bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt xuất hiện chủ yếu ở những người ñã
trưởng thành, ñặc biệt ở ñộ tuổi trung niên (41 – 60).

KẾT LUẬN
Từ kết quả trên, chúng tôi cho rằng, chúng ta có thể hoàn thiện quy trình xét nghiệm ñể sau ñó
ñem ra áp dụng ở những cơ sở khám và chữa bệnh. Điều này sẽ giúp cho thầy thuốc lâm sàng có một
phương tiện ñáng tin cậy ñể nhanh chóng xác ñịnh chẩn ñoán bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng
hạt, ñồng thời có kế hoạch ñiều trị cũng như theo dõi ñáp ứng ñiều trị bệnh CML một cách hiệu quả.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Branford S and Hughes T. (2006) Diagnosis and Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia by Qualitative and Quantitative RT-PCR.
Methods in Molecular Medicine. Vol 125:69-92.
Chomczynski P, (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal
Biochem.Apr; 162(1): 156-9.
Jones CD, Yeung C (2003). Comprehensive Validation of a Real-Time Quantitative bcr-abl Assay for Clinical Laboratory Use. Am J
Clin Pathol 120: 42-48.
Nowel, PC and Hungerford D.A (1960) Chromosome studies on normal and Leukemic human leucocytes. J Natl Cancer Inst 25: 85108.
Rowley JD (1973) A new consisten chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia ideltified by quinacrine fluorescence
and Giemsa staining.Nature 243: 290-3.
Salesse, S. and Verfaillie CM (2002). BCR/ABL: from molecular Mechanisms of Leukemia induction to treatment of chronic
myelogenous Leukemia.Oncogene 21 (56): 8547- 59.
Sawyers, C.L. (1999). Chronic myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine 340(17):1330-59.
Tybor JG (2008) Targeted drugs in Chronic Myeloid Leukemia. Current medicinal Chemistry, 15: 3036-3051

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010

569