Khảo sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của cao chiết trà xanh (camellia sinensis) trên chuột nhắt

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CẢI THIỆN SỰ SUY GIẢM TRÍ NHỚ
CỦA CAO CHIẾT TRÀ XANH (CAMELLIA SINENSIS)
TRÊN CHUỘT NHẮT
Nguyễn Hải Hà*, Dương Phước An*, Trần Lê Tuyết Châu*, Trần Phi Hoàng Yến*

TÓMTẮT
Đặt vấn đề: EGCG, một trong những hoạt chất polyphenol chính của Trà xanh (TX), đã được chứng
minh có khả năng bảo vệ tế bào não chống lại bệnh Alzheimer. Đề tài này được thực hiện nhằm góp phần
khẳng định khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết TX bằng mô hình gây suy giảm trí nhớ sử
dụng trimethyltin, một tác nhân gây tổn thương tế bào vùng hải mã não chuột và làm rối loạn chức năng
nhận thức và nhớ.
Mục tiêu: Đánh giá tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà
xanh (TX) trên chuột nhắt.
Phương pháp: Áp dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng trimethyltin (TMT) để đánh giá khả năng
cải thiện sự suy giảm trí nhớ của Cao chiết búp non lá trà xanh sử dụng mô hình Mê cung bơi (Morris
Water Maze - MWM) và thông qua việc xác định các chỉ số sinh hóa (Acetylcholine và Acetylcholinesterase).
Kết quả: Hai liều cao chiết toàn phần từ TX (30 mg/kg, và 60 mg/kg, p.o x 14 ngày) đều thể hiện khả
năng chống lại tác dụng suy giảm học hỏi và ghi nhớ do TMT liều duy nhất (2,4 mg/kg, i.p) thông qua 3 thử
nghiệm của mô hình MWM: Thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm
TMT với TX60 + TMT); thử nghiệm thăm dò (Probe Test, p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT và TX30 + TMT
hoặc nhóm TX60 + TMT); và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (Working Memory Test, p < 0,05 khi so giữa
nhóm TMT với TX30 + TMT; p < 0,01 khi so giữa nhóm TMT với nhóm TX60 + TMT). Kết quả định lượng
acetylcholine (Ach) và Acetylcholinesterase (AchE) trong vùng hải mã cũng tương ứng với kết quả đạt được
từ các thử nghiệm hành vi. Cả hai liều thử nghiệm Cao chiết TX đều thể hiện khả năng phục hồi sự giảm
nồng độ Ach (p < 0,01) và sự gia tăng AchE (p < 0,01) do TMT gây ra.
Kết luận: Cao chiết toàn phần từ búp non lá trà xanh thể hiện khả năng cải thiện sự suy giảm học hỏi
và ghi nhớ qua mô hình MWM và hiệu quả này có liên quan đến hệ cholinergic, làm tăng Ach và giảm hoạt

tính AchE trong vùng hải mã não chuột.
Từ khóa: Trimethyltin, suy giảm khả năng học hỏi và ghi nhớ, acetylcholine, Trà xanh.

ABSTRACT
STUDY ON AMELIORATE OF MEMORY IMPAIRMENTS
BY TRA XANH EXTRACT (CAMELLIA SINENSIS) IN MICE
Nguyen Hai Ha, Duong Phuoc An, Tran Le Tuyet Chau, Tran Phi Hoang Yen
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 118 -123
Background: EGCG, one of polyphenol compound of Green tea (Camellia sinensis) (TX), was
demonstrated to neuroprotective effect in Alzheimer’ Disease. This study is carried out to assert amelioration
of memory impairment of extracts from fresh bud of TX applying memory impairments model by
trimethyltin, a reagent caused degeneration of hippocampus in brain and memory and cognition dysfunction.
*

Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Trần Phi Hoàng Yến ĐT: 0937878365

118

Email:

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

Objective: Evaluate effect of extract from fresh bud of Green tea leaf in memory impairments caused by
trimethyltin in mice.

Methods: Applying trimethyltin (TMT) model for memory impairments to evaluate the effect of TX
extract using Morris Water Maze (MWM) protocol and biochemical detection (acetylcholine and
acetylcholinesterase).
Results: Two doses of TX (30 mg/kg, và 60 mg/kg, p.o x 14 days) show the protective role in
impairments of learning and memory caused by TMT one dose exposure (2.4 mg/kg, i.p) by evaluation of
MWM: Hidden Platform Test (p < 0.01 as compared between TMT and TX60 + TMT group); Probe Test (p
< 0.01 as compared between TMT and TX30 + TMT or TX60 + TMT group); and Working Memory Test (p
< 0.05 as compared between TMT and TX30 + TMT; p < 0.01 as compared between TMT and TX60 + TMT).
Results in acetylcholine (Ach) content and Acetylcholinesterase (AchE) activity in hippocampus are
correlated to results in behavior study. Two doses of TX ameliorate the decreases in Ach content (p < 0.01)
and increases in AchE (p < 0.01) caused by TMT.
Conclusion: Extracts from fresh bud of TX leaf ameliorate memory impairments using MWM test and
this result correlates to cholinergic response, by increases in Ach content and decreases in AchE activity in
hippocampus of mice.
Keywords: Trimethyltin, memory impairments, acetylcholine, Green tea.

ĐẶTVẤN ĐỀ
Trimethyltin (TMT)(1) là hợp chất hữu cơ

VẬTLIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Cao chiết toàn phần trà xanh

Độc tính của TMT chủ yếu trên hệ thần kinh

Cao chiết ethanol toàn phần từ búp non lá
trà xanh đã chuẩn hóa do ThS. Trần Lê Tuyết
Châu* cung cấp (Hàm lượng EGCG đạt 65,3%).

trung ương, tác động chủ yếu trên vùng

Chuột thử nghiệm

Hippocampus của não chuột nhắt, làm suy

Chuột nhắt trắng (đực) giống Swiss albino,
trọng lượng 22 - 24 gam (khoảng 5 - 6 tuần
tuổi), do Viện Vắc Xin và Sinh phẩm Y Tế Nha
Trang cung cấp.

của thiếc, thường dùng TMT như là chất ổn
định plastic, diệt nấm mốc trong nông nghiệp.

giảm chức năng nhận thức và trí nhớ, gây ra
các triệu chứng ngộ độc: khiếm thính, bồn
chồn, dễ kích động, mất điều hòa, lú lẫn, mất
định hướng, rối loạn trí nhớ ngắn hạn và dài

Nguyên liệu, hóa chất khảo sát

chống suy giảm trí nhớ. Do vậy, TMT đã được

Trimethyltin
hydrochlorid
(Sigma),
Reminyl (Hoạt chất là galantamin, Janssen);
Memantine (Sigma); Coomassie [Bradford]
(Thermo fisher Scientific); Amplex® Red
Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit
(A12217-InvitrogenTM/ Molecular Probe).

ứng dụng trong nghiên cứu này nhằm khảo

Máy đo phổ hấp thu UV

sát khả năng cải thiện sự suy giảm trí nhớ của

U-1900 UV/VIS Spectrophotometer 200V
(HITACHI), máy Elisa (Thermo Electron) và
máy nghiền đồng thể SONICATOR 3080
(USA).

hạn. Hiện nay, TMT được ứng dụng như một
mô hình vừa gây tổn thương tế bào thần kinh
vừa gây suy giảm trí nhớ, nhằm khảo sát các
thuốc có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh,

Cao chiết TX, và mối liên hệ với acetylcholine,
chất trung gian hóa học của hệ cholinergic, có
vai trò quan trọng trong việc học và nhớ.

Chuyên Đề Dược Khoa

119


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

Thử nghiệm Morris Water Maze

Là thử nghiệm dùng để đánh giá trí nhớ
dài hạn trên chuột nhắt trắng. Hồ bơi có kích
thước 1500 x 80 (cm) (đường kính x chiều cao),
chân đế kích thước 10 x 25 (cm) (đường kính x
chiều cao). Hồ bơi được đặt ở một nơi có màn

che kín, trên tấm màn che này có đặt những
hình vẽ với hình thù bất kỳ tại 4 góc hồ bơi.
Nhiệt độ của hồ bơi phải nằm trong khoảng 27
± 2 0C trong suốt thử nghiệm(3). Thử nghiệm
mê cung bơi gồm 8 ngày thử nghiệm như sau:

14 ngày uống cao

TX 30 mg/ kg, TX 60 mg/ kg, (p.o)

MEM 2,0 mg/ kg, i.p
Gal. 10 mg/ kg, i.p

Ngày 1

TMT 2,4 mg/ kg, ip

Ngày 4

Ngày 9

Bắt đầu các thử
nghiệm hành vi

Ngày 7

Ngày 14
Khảo sát Ach và AchE

Hình 1. Sơ đồ bố trí thử nghiệm mô hình Morris Water Maze
choline oxidase xúc tác các phản ứng. Ach sẽ bị
- Chuột được chia làm 6 nhóm, mỗi nhóm
chuyển thành choline dưới xúc tác của enzyme
từ 8-10 con, thể tích tiêm hoặc uống thuốc là 0,1
AchE,
sau đó nó bị choline oxidase oxy hóa
µl/ 1 gam chuột):
thành betain và H2O2. Dưới sự xúc tác của
+ Nhóm 1: Nước muối sinh lý (Sal.; n = 8)
horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng
+ Nhóm 2: TMT (2,4 mg/kg, i.p liều duy
với 10 – acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine
nhất; n = 10)
(Amplex Red reagent) tạo chất có màu hồng.
+ Nhóm 3: TX (30mg/kg, p.o x 14 ngày; n =
Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nm. Cường độ
10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p)
huỳnh quang của Amplex Red™ tỷ lệ thuận với
+ Nhóm 4: TX (60mg/kg, p.o x 14 ngày; n =
nồng độ Ach và AchE. Kết quả được biểu diễn
10) + TMT(2,4 mg/kg, i.p)
là số nmol Ach/ mg protein và số mU AchE
hoạt động/ mg protein.
+ Nhóm 5: Memantine (MEM 2 mg/kg, i.p

x 10 ngày; n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p)
+ Nhóm 6: Galantamin (Gal. 10 mg/ kg x 10
ngày, n = 10) + TMT (2,4 mg/kg, i.p)

Định lượng Ach và AchE
Nguyên tắc
Sử dụng kit Amplex Red™ để định lượng
Ach và AchE thông qua trung gian enzyme

120

Xử lý và phân tích số liệu
Số liệu được biểu diễn dưới dạng Mean ±
SEM. Sử dụng phương pháp phân tích
ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s PLST test.
Ý nghĩa thống kê được xác định khi p < 0,05.

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

KẾTQUẢ
Thử nghiệm ẩn chân đế

Thời gian chuột tìm thấy chân đế (giây)

60

Sal
TMT
MEM

50

TX 30
TX 60

40

a

30

b

20

b

10
0
Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Hình 2. Sự thay đổi thời gian chuột tìm thấy chân đế giữa các nhóm chứng (Sal. n = 8), TMT (TMT 2,4
mg/kg i.p chờ 7 ngày, n = 8), MEM (MEM 2,0 mg/ kg, i.p x 10 ngày, bắt đầu 3 ngày trước khi tiêm TMT, n
= 8), các nhóm uống Cao TX (TX30 và TX60 tương ứng với 2 liều 30 và 60 mg/kg/ ngày x 14 ngày, bắt đầu
trước khi tiêm TMT 7 ngày, n = 8) trong thử nghiệm ẩn chân đế (Hidden Platform Test) của mô hình
MWM. ap<0,001 khi so với nhóm chứng, bp<0,01 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích
phương sai 2 yếu tố với Fisher’s PLST test).
B. Thử nghiệm trí nhớ hoạt động

Số lần chuột bơi qua chân đế

3

bb

2

bb

b

2

a

1
1
0
Sal

TMT

MEM

TX 30

TX 60

Thời gian tìm thấy chân đế (giây)

A. Thử nghiệm thăm dò
45

a

40

b

35
30

bb

bb

25
20
15

10
5
0
Sal

TMT

MEM

TX 30

TX 60

Hình 3. Sự thay đổi số lần chuột bơi qua chân đế (Hình 3A) và thời gian chuột tìm thấy chân đế (Hình 3B)
giữa các nhóm chứng (Sal. n = 8), TMT (Nhóm gây suy giảm trí nhớ bằng TMT 2,4 mg/ kg i.p chờ 7 ngày,
n = 8), MEM (MEM 2,0 mg/ kg i.p x 10 ngày, bắt đầu 3 ngày trước khi tiêm TMT, n = 8), các nhóm uống
Cao TX (TX 30 và 60 mg/kg/ngày x 14 ngày, bắt đầu trước khi tiêm TMT 7 ngày, n = 8) trong thử nghiệm
thăm dò (Probe Test) và thử nghiệm trí nhớ hoạt động (Working Memory Test) của mô hình MWM. ap <
0,01 khi so với nhóm chứng, bp < 0,05, bbp < 0,01 khi so với nhóm TMT (Sử dụng phương pháp phân tích
phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test).

Chuyên Đề Dược Khoa

121


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học
Nhận xét

Sử dụng mô hình MWM để đánh giá tác
dụng của Cao chiết TX đối với sự suy giảm việc
học hỏi và ghi nhớ do TMT gây ra, một số kết
quả đã được ghi nhận:
Khi so với nhóm Sal., nhóm TMT làm suy
giảm khả năng học và nhớ của chuột thông qua
sự gia tăng thời gian tìm thấy chân đế trong thử
nghiệm ẩn chân đế, thử nghiệm thăm dò và thử
nghiệm trí nhớ hoạt động.
Đối với thử nghiệm ẩn chân đế, chỉ liều TX
60 mg/kg làm giảm thời gian tìm thấy platform
so với nhóm TMT. Cả hai liều 30 mg/kg và 60
mg/kg Cao chiết TX đều thể hiện khả năng làm

tăng số lần bơi qua chân đế (Thử nghiệm thăm
dò) và làm giảm thời gian chuột tìm thấy chân
đế (Thử nghiệm trí nhớ hoạt động). Điều này
chứng tỏ liều thấp TX chỉ thể hiện tác dụng bảo
vệ sự tổn thương khả năng học hỏi và ghi nhớ ở
giai đoạn sau (trong thử nghiệm thăm dò và
thử nghiệm trí nhớ hoạt động), trong khi liều
cao hơn (60 mg/kg) thể hiện khả hiệu quả ở giai
đoạn sớm của quá trình học tập thông tin mới.
Hiệu quả của các nhóm Cao TX kém hơn
nhóm đối chứng dương MEM, một chất đã
được sử dụng trong điều trị bệnh alzheimer từ
mức độ nhẹ tới nặng.

B. Acetylcholinesterase

A. Acetylcholine

b

25

3.5

b,cc

3.0

b,cc

2.5
2.0

a

1.5
1.0
0.5
0.0

S al.

TMT

Gal.

HNT1
HNT2
TX30 TX60

Hoạt tính AchE (mU/mg protein)

Nồng độ Ach (nmol/mg protein)

4.0

a
20
15
10

b,c

b,c

b

5
0

Sal.

TMT

Gal.

TX30 TX60

Hình 4. Ảnh hưởng của Cao chiết TX trên sự thay đổi nồng độ Ach (hình 4A) và nồng độ AchE (hình 4B),
sử dụng mô hình TMT. ap<0,001 khi so với nhóm chứng. bp < 0,001 khi so với nhóm TMT, cp < 0,05, ccp <
0,01 khi so với nhóm Gal. (Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố với Fisher’s PLST test).

Nhận xét
Nồng độ Ach giảm và AchE tăng (trong
vùng hippocampus) ở thời điểm 2 ngày sau khi
tiêm TMT 2,4 mg/ kg.
Điều trị bằng chất đối chứng dương Gal.,
chất ức chế cholinesterase, hoặc Cao TX 30 và
60 mg/ kg/ ngàyx 14 ngày đều thể hiện tác
dụng làm tăng Ach và giảm AchE so với
nhóm chỉ tiêm TMT. Điều này chứng tỏ Gal.,
Cao TX đều có khả năng bảo vệ sự tổn thương
hệ cholinergic do TMT trong vùng hải mã
não chuột.

122

Khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ
cholinergic (làm tăng nồng độ Ach và giảm
AchE) của nhóm điều trị bằng Gal. tốt hơn so
với các nhóm điều trị với Cao TX với 2 liều
thử nghiệm, sự khác biệt này có ý nghĩa
thống kê.

BÀN LUẬN

Cao chiết búp non lá trà xanh (60 mg/kg,
p.o x 14 ngày) đã thể hiện vai trò cải thiện sự
suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ do TMT gây
ra trên chuột thực nghiệm qua mô hình đánh
giá hoạt động học và nhớ vị trí không gian

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Morris Water Maze (MWM), kết quả này phù
hợp với khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ
cholinergic thông qua việc xác định nồng độ
Ach và hoạt tính enzyme AchE. Điều này
chứng tỏ khả năng cải thiện hoạt động nhận
thức và nhớ của Cao TX có liên quan đến việc
cải thiện sự tổn thương hệ cholinergic, kết quả
này giúp định hướng cho những nghiên cứu
tiếp theo về khả năng bảo vệ tế bào não chống
lại sự thoái hóa tế bào thần kinh dẫn đến các
bệnh liên quan đến thoái hóa thần kinh như:
Alzheimer, Parkinson, Hungtinton…

Cảm ơn: Đề tài này được tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu
khoa học của Sở Khoa Học và Công Nghệ TP.HCM (Năm
2010)

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

KẾTLUẬN
Cao chiết từ búp non lá trà xanh có vai trò
cải thiện sự suy giảm việc học hỏi và ghi nhớ áp
dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng
trimethyltin. Tác dụng này có liên quan đến
khả năng bảo vệ sự tổn thương hệ cholinergic.

Chuyên Đề Dược Khoa

Nghiên cứu Y học

4.

Balaban C.D.(1998), “Trimethyltin-induced neuronal
damage in the rat brain: Comparative studies using silver
degeneration
stains,
immunocytochemistry
and
immunoassay for neuronotypic and gliotypic proteins”,
Neuroscience, 26: 337-361.
Kavon R.Z. et al (2005), “Green Tea Epigallocatechin-3Gallate (EGCG) Modulates Amyloid Precursor Protein
Cleavage and Reduces Cerebral Amyloidosis in Alzheimer
Transgenic Mice”, The Journal of Neuroscience, 25(38), 8807–
8814.
Vorhees V.C. & Williams T.M. (2006). Morris water maze:

procedures for assessing spatial and related forms of
learning and memory. Nature Protocols 1, - 848 – 858.
Yan X. (2009), “Green tea polyphenols inhibit cognitive
impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion
via modulating oxidative stress”, The Journal of Nutritional
Biochemistry, 21(8), 741-748.

123