Nghiên cứu biến đổi hình thái cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày 3 trước đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

NGHI N CỨU BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI CẤU TRÚC PHÔI NGƢỜI
NUÔI CẤY NGÀY 3 TRƢỚC ĐÔNG LẠNH VÀ SAU RÃ ĐÔNG
BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA
Đoàn Thị Hằng*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng*
Trịnh Thế Sơn*; Trịnh Quốc Thành*; Dương Đình Hiếu*
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá hình thái phôi trước đông và sau rã đông bằng phương pháp thủy tinh
hóa, đánh giá khả năng phát triển của phôi rã đông sau nuôi cấy 24 giờ. Đối tượng và phương
pháp: nghiên cứu mô tả tiến cứu trên 250 phôi ngày 3 đông lạnh và rã đông bằng phương pháp
thủy tinh hóa (Vitrification) của 79 bệnh nhân tại Trung tâm Công nghệ Phôi. Kết quả và kết
luận: so với phác đồ đông lạnh chậm trước đây, đông lạnh phôi bằng phương pháp thủy tinh
hóa là một kỹ thuật tiết kiệm thời gian và kinh tế, hiệu quả cho tỷ lệ phôi sống sau rã đông
95,2%, tỷ lệ phôi phân chia tiếp sau rã đông 68,4%, không thấy biến đổi đáng kể hình thái phôi
sau rã đông.
* Từ khóa: Phôi người đông lạnh; Hình thái cấu trúc phôi; ỹ thuật thủy tinh hóa.

Transformation of Morphological Structure of Day-Three Human

Embryos before Freezing and After Thawing by Vitrification Technique
Summary
Objectives: To assess embryological morphology before freezing and after thawing by
vitrification technique and development of embryos after 24 hours cultivation. Subject and
methods: The prospective descriptive study was performed in 250 cryopreserved embryos in
day 3 by vitrification of 79 patients in the Centre of Advanced Technological Embryology.
Results and conclusion: Vitrification technique is far more efficient than the programmed slow
freeze protocols, time saving and economical. The survival rates was 95.2%, and the
developing rates was 68.4%, without the considerable changes after thawing in morphology.
* Keywords: Frozen embryo human; Morphological structure; Vitrification technique.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông lạnh phôi bằng kỹ thuật thuỷ tinh
hoá (Vitrification) đã được thử nghiệm thành

công trên phôi động vật từ năm 1985 8 .
Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, quá trình
làm lạnh mẫu với thời gian rất nhanh,

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Đoàn Thị Hằng ()
Ngày nhận bài: 26/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/05/2018
Ngày bài báo được đăng: 21/05/2018

43


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
không xảy ra hình thành tinh thể nước đá
- yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng
sống và phát triển của phôi. Trong suốt
quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật
chất bên trong và bên ngoài tế bào (TB)
chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt.
Đông lạnh phôi bằng kỹ thuật thủy tinh
hóa đang được các Trung tâm Hỗ trợ
Sinh sản lớn trong khu vực và trên thế
giới thử nghiệm đưa vào ứng dụng trong
lâm sàng.

ống nghiệm, các phôi có TB đồng đều, tỷ

lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) < 20%
(phôi độ 3, độ 4).

Tại Việt Nam, phương pháp này được
thực hiện đầu tiên tại Bệnh viện Phụ sản
Từ Dũ từ tháng 5 - 2006, bước đầu thu
được kết quả tốt 1 . Trung tâm Công
nghệ Phôi bắt đầu thực hiện đông phôi
bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá từ tháng 9 2006.

Tất cả phôi đông lạnh ngày 3 được rã
đông để chuyển cho BN. Đông lạnh phôi
chỉ định cho các trường hợp: có phôi dư
thừa sau chuyển phôi tươi; có hiện tượng
quá kích buồng trứng mức độ vừa, nặng;
không chuyển phôi được do không qua
được cổ tử cung; niêm mạc tử cung chưa
tốt cho việc chuyển phôi tươi; những
trường hợp cho - nhận noãn mà chuẩn bị
niêm mạc tử cung chưa tốt.

Để ứng dụng kỹ thuật này đạt hiệu quả
cao, an toàn và góp phần hoàn thiện phác
đồ đông lạnh phôi, đặc biệt là phác đồ đông
lạnh phôi bằng kỹ thuật thủy tinh hóa,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục
tiêu: Đánh giá hình thái cấu trúc của phôi
trước đông, sau rã đông bằng kỹ thuật
thủy tinh hóa và khả n ng phát triển của
phôi rã đông nuôi cấy sau 24 giờ

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHI N CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
250 phôi của 79 bệnh nhân (BN) có
phôi đông lạnh ở ngày 3 bằng kỹ thuật
thủy tinh hóa đã rã đông tại Trung tâm
Đào tạo Nghiên cứu Công nghệ Phôi,
Học viện Quân y.
* Tiêu chuẩn lựa chọn phôi để trữ lạnh:
Phôi nuôi cấy đến ngày thứ 3 trong
môi trường nuôi cấy của thụ tinh trong
44

* Tiêu chuẩn loại trừ: phôi giai đoạn
sớm độ 1, độ 2: TB không đồng đều, tỷ lệ
mảnh vỡ bào tương ≥ 20%.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt
ngang, tiến cứu.
* Chọn mẫu nghiên cứu:

* Chuẩn bị niêm mạc t cung:
- Thuốc sử dụng: estrogen (provames
2 mg, progynova 2 mg), progesteron
(utrogestan 100 mg).
- Cho BN uống provames 4 mg/ngày
từ ngày thứ 2 của chu kỳ kinh.
- Siêu âm đo niêm mạc tử cung vào
ngày thứ 10 của chu kỳ kinh, chỉnh liều
provames.

- Ngày 12 - 14: siêu âm đo niêm mạc
tử cung: nếu niêm mạc tử cung ≥ 8 mm,
bổ sung utrogestan 400 mg/ngày (đặt âm
đạo).
- Ngày 16 - 18 chuyển phôi.
* Đánh giá hình thái phôi ngày 3:
Quan sát hình thái cấu trúc phôi bằng
kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70,
độ phóng đại 200 lần:


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Theo cách phân loại hình thái phôi của
Andres Salumet 4 dựa theo số phôi bào,
bào tương phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào
tương trong phôi: có 4 loại:

dựa vào phần trăm thoái hoá TB theo
tiêu chuẩn hình thái học của Brian Dale
và Kay Elder(1997) [11]:
+ Thoái hóa độ 1: thoái hoá < 25%.

- Phôi độ 4: phôi có 6 - 8 TB đồng đều,
không có mảnh vỡ bào tương.

+ Thoái hóa độ 2: thoái hoá 25 - 50%.

- Phôi độ 3: phôi có 6 - 8 TB đồng đều,
mảnh vỡ bào tương chiếm < 20% thể tích
phôi.

+ Thoái hóa độ 4: thoái hoá hoàn toàn.

- Phôi độ 2: phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào
tương chiếm 20 - 50% thể tích phôi.
- Phôi độ 1: phôi có tỷ lệ mảnh vỡ bào
tương chiếm > 50% thể tích phôi.
* Đánh giá hình thái phôi sau rã đông:
- Phôi ngày 3 sau rã đông: phôi ngày 3
được đánh giá là phôi sống khi có > 50%
phôi bào sống sau rã đông. Nếu phôi còn
nguyên vẹn, chia thành 4 độ như phôi
trước đông, đánh giá các phôi thoái hoá

+ Thoái hóa độ 3: thoái hoá > 50%.
- Đánh giá hiệu quả trữ phôi theo
Ashwood-Smith MJ (1986) [10]:
+ hả năng sống của phôi sau khi rã
đông: phôi được đánh giá về hình dạng
1 giờ sau khi rã đông. Chỉ số sống
(survival index) tính bằng tỷ lệ TB còn
sống/tổng số TB.
+ hả năng phát triển của phôi trong
môi trường nuôi cấy: đánh giá phôi sau
24 giờ, biểu hiện bằng tỷ lệ sống (survival
rate) tính bằng tỷ lệ phôi sống/tổng số
phôi được rã đông.

KẾT QUẢ NGHI N CỨU
1. Th y đổi về độ dày màng trong suốt, đƣờng kính phôi và số ƣợng phôi bào

trƣớc đông ạnh và s u rã đông.

2

1

2

A

B

1

Hình 1: Phôi ngày 3.
(A: Phôi tươi ngày thứ 3; B: Phôi ngày 3 sống nguyên vẹn sau rã đông)
(Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 với độ phóng đại 200 lần
thấy có 7 phôi bào; : Màng trong suốt; 2: Phôi bào)
45


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Các phôi nuôi cấy đến ngày 3 là phôi ở giai đoạn phôi phân chia, mỗi phôi có
khoảng 5 - 8 phôi bào có thể quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược (hình 1A).

1

2

Hình 2: Phôi ngày 3 sống nuôi cấy 1 ngày sau rã đông.

(Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 với độ phóng đại 200 lần
thấy có 0 phôi bào; : Màng trong suốt; 2: Phôi bào)
Sau khi rã đông, những phôi bào còn sống có bào tương sáng màu, tròn đều (hình
1B), những phôi sống tiếp tục nuôi cấy qua đêm, đếm số TB thấy tăng lên rõ rệt (hình
2), phôi bào thoái hóa có bào tương co dúm, sẫm màu (hình 3).

1
3
2

Hình 3: Phôi ngày 3 thoái hóa sau rã đông.
(Quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 với độ phóng đại 200 lần
thấy có 5 phôi bào, 3 phôi bào bị thoái hóa; : Màng trong suốt; 2: Phôi bào sống;
3: Phôi bào thoái hóa)
Sau khi rã đông 250 phôi nuôi cấy ngày thứ 3, chúng tôi chụp ảnh phôi, sau đó đo
độ dày màng trong suốt và đường kính phôi, đếm số lượng TB trên ảnh để đảm bảo
không để phôi bị phơi nhiễm lâu ở ngoài tủ cấy. Thực hiện kỹ thuật đo trên phần mềm
Axio 4.8 (Hãng Carl Zeiss).
46


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Bảng : Độ dày màng trong suốt của phôi ngày 3 trước đông lạnh, sau rã đông và
sau nuôi cấy thêm 1 ngày.
Thời điểm

Độ dày màng trong suốt trung bình (µm)
(tối thiểu - tối đ )

p

14,70 ± 1,13 (10,70 - 21,30)

p1-2 = 0,306

Phôi trước đông lạnh (1)
Phôi sau rã đông (2)

14,80 ± 1,20 (11,3 - 20,7)

Phôi rã đông sau nuôi cấy (3)

p2-3 = 0,308

14,90 ± 1,08 (10,50 - 20,30)

Độ dày màng trong suốt của phôi ngày thứ 3 ở các thời điểm trước đông lạnh,
sau rã đông và sau nuôi cấy không khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Bảng 2: Đường kính phôi của phôi ngày 3 trước đông lạnh, sau rã đông, sau nuôi cấy.
Đƣờng kính phôi trung bình
(tối thiểu - tối đ , µm)

p

Trước đông lạnh (1)

147,20 ± 7,82 (132,40 - 165,30)

p1-2 = 0,246

Sau rã đông (2)

147,50 ± 8,14 (135,50 - 158,70)

Sau nuôi cấy (3)

149,50 ± 6,30 (135,40 - 167,90)

Thời điểm

p2-3 = 0,001

Độ dày màng trong suốt trung bình của phôi ngày 3 trước đông lạnh và sau rã đông
khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, sau khi nuôi cấy thêm 1 ngày, đường
kính trung bình của phôi lớn hơn so với phôi sau rã đông, sự khác biệt này có ý nghĩa
thống kê với p = 0,001.
Bảng 3: Số phôi bào của phôi ngày 3 trước đông lạnh, sau rã đông.
Chỉ tiêu
Số phôi bào trung bình

Trƣớc đông

S u rã đông

p

6,75 ± 1,04
(5 - 10)

6,62 ± 1,66

(0 - 10)

0,065

1.711

1.624

-

Số phôi bào sống

Sau rã đông, số phôi bào trung bình không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với
trước đông lạnh (p = 0,065), số phôi bào sống sau rã đông là 1.624.
2. Hình thái phôi ngày 3 trƣớc đông ạnh, s u rã đông và s u khi nuôi cấy 24
giờ qu n sát dƣới kính hiển vi soi nổi.
Bảng 4: Thay đổi hình thái phôi ngày 3 trước đông lạnh và sau rã đông 1 giờ.
Phân độ
phôi

Trƣớc đông ạnh

S u rã đông 1 giờ

Tỷ lệ phôi nguyên
vẹn (%)

n

Tỷ lệ (%)

n

Tỷ lệ (%)

Độ 4

99

39,6

99

39,6

100

Độ 3

151

60,4

122

48,8

80,8

Độ 2

-

-

-

-

-

Độ 1

-

-

-

-

-

47


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Thoái hóa 1

-

-

10

4

-

Thoái hóa 2

-

-

7

2,8

-

Thoái hóa 3

-

-

7

2,8

-

Thoái hóa 4

-

-

5

2

-

250

100

250

100

-

Tổng

ết quả bảng 4 cho thấy phôi được lựa chọn để đông lạnh là phôi độ 3, độ 4. Trước
khi đông lạnh phôi, số phôi độ 4 là 99 phôi (39,6%), số phôi độ 3 là 151 (64,2%). Sau
rã đông, hình thái phôi được phân độ phôi giống như phôi trước đông, kết quả cho

thấy số phôi độ 4 còn nguyên vẹn 99 phôi, số phôi độ 3 chỉ còn 122 phôi, còn lại là
phôi thoái hóa độ 1 (10 phôi), thoái hóa độ 2 có 7 phôi, thoái hóa độ 3: 7 phôi và thoái
hóa độ 4 (thoái hóa hoàn toàn) 5 phôi.
Như vậy, sau rã đông, số phôi độ 4 còn nguyên vẹn 100%, trong khi số phôi độ 3
nguyên vẹn chỉ 80,8%.
Bảng 5: Thay đổi hình thái phôi sau rã đông 1 giờ và sau khi nuôi cấy 24 giờ.
Phân độ
phôi

S u rã đông 1 giờ

Sau nuôi cấy 24 giờ

n

Tỷ lệ (%)

n

Tỷ lệ (%)

Độ 4

99

39,6

113

45,2

Độ 3

122

48,8

58

23,2

Độ 2

-

-

62

24,8

Độ 1

-

-

17

6,8

Thoái hóa 1

10

4

-

-

Thoái hóa 2

7

2,8

-

-

Thoái hóa 3

7

2,8

-

-

Thoái hóa 4

5

2

-

-

Tổng

250

100

250

100

Phôi sau khi rã đông tiếp tục nuôi cấy
24 giờ, đánh giá hình thái sau nuôi cấy
phôi chia thành 4 độ dựa vào phân chia
tiếp của phôi. Số phôi độ 4 sau khi nuôi
cấy thêm một ngày là 113 phôi, tăng lên
so với phôi trước đông là 24 phôi, do một
số phôi độ 3 sau khi nuôi cấy có ít nhất
1 TB phân chia sẽ được đánh giá là phôi
độ 4. Số phôi độ 3 giảm do một số phát

triển thành phôi độ 4, một số không phân
chia nữa trở thành phôi độ 2, một số phôi
thoái hóa < 50% sau khi nuôi cấy tiếp tục
48

phân chia tạo thành phôi độ 3. Số phôi
độ 2 là do những phôi độ 3, độ 4 không
tiếp tục phát triển sau nuôi cấy tạo thành.
Có 17 phôi độ 1, là những phôi thoái hóa
độ 3, độ 4 và phôi có mảnh vỡ bào tương
> 50%. Như vậy, sau khi nuôi cấy qua
đêm, phôi độ 4, độ 3, độ 2 và độ 1 có tỷ lệ
tương ứng là 45,2%; 23,2%; 24,8% và
6,8%. Trong đó, những phôi độ 2, 3, 4
được sử dụng để chuyển phôi, phôi độ 1
là phôi xấu không sử dụng để chuyển
phôi.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Bảng 6: Tỷ lệ phôi rã đông phân chia tiếp sau nuôi cấy 24 giờ.
Chỉ tiêu

n

Tỷ lệ (%)

Phôi rã đông

250

-

Phôi sống

238

95,2 (238/250)

Phôi tiếp tục phân chia

171

68,4 (171/250)

Phôi độ 4 rã đông phân chia tiếp

83

83,8 (83/99)

Phôi độ 3 rã đông phân chia tiếp

70

57,4 (70/122)

Số phôi sống sau rã đông là 238 phôi (95,2%), số phôi tiếp tục phân chia 171 phôi
(68,4%), trong đó phôi độ 4 phân chia tiếp sau rã đông là 83 phôi (83,8%), tỷ lệ phôi
tiếp tục phát triển ở phôi độ 3 là 57,4%, thấp hơn so với phôi độ 4 có ý nghĩa thống kê

(p < 0,05).
BÀN LUẬN
- ết quả nghiên cứu của chúng tôi
cho thấy hình thái của phôi về độ dày
màng trong suốt và đường kính phôi
trung bình trước đông lạnh và sau rã
đông không có sự khác biệt. Nghiên cứu
của Yi-Fan Gu (2015), Sifer C (2013)
cũng cho kết quả tương tự. Tỷ lệ phôi
sống sau rã đông đạt 95,2%, kết quả này
phù hợp với báo cáo của Bệnh viện Phụ
sản Từ Dũ 1 và một số tác giả nước
ngoài như H. Tomari và CS 5 , Tetsunori
ukaida và CS (2012) 6 . Tỷ lệ phôi sống
cao sau rã đông rất có ý nghĩa đối với BN
bị quá kích buồng trứng nặng, niêm mạc
tử cung không tốt để chuyển phôi tươi.
BN hoàn toàn yên tâm cộng tác điều trị
khi chuyển phôi đông lạnh.
So với các nghiên cứu về đông lạnh
phôi theo phương pháp đông lạnh chậm,
tỷ lệ phôi sống sau rã đông chỉ đạt
khoảng 60 - 80% 2, 3 , phương pháp
thủy tinh hóa cho tỷ lệ phôi sống rất cao,
có thể do trong quá trình làm lạnh,
phương pháp thủy tinh hóa không gây
hình thành tinh thể nước đá, do đó không

làm ảnh hưởng đến phôi. Phương pháp
thủy tinh hóa mất ít thời gian hơn, đồng

thời tiết kiệm được một lượng lớn ni tơ,
đem lại hiệu quả kinh tế hơn so với
phương pháp đông lạnh chậm
- Về khả năng phát triển của phôi sau
nuôi cấy: kết quả nghiên cứu cho thấy
các phôi sau rã đông được nuôi cấy thêm
đều phát triển rất tốt, tỷ lệ phôi phân chia
tiếp đạt 68,4%. ết quả này tương tự như
H. Tomari và CS (Nhật) 5 . Nuôi cấy phôi
qua đêm cho phép lựa chọn được phôi có
khả năng phát triển làm tổ, cho phép giảm
số lượng phôi chuyển, giảm tỷ lệ đa thai,
đồng thời giúp tiết kiệm phôi cho một chu
kỳ rã đông.
KẾT LUẬN
Sau rã đông 250 phôi bằng phương
pháp thủy tinh hóa cho thấy:
- hông thấy sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê về hình thái cấu trúc phôi trước
và sau rã đông, tỷ lệ phôi sống sau rã
đông 95,2%.
- Nuôi cấy phôi sau 24 giờ, tỷ lệ phôi
tiếp tục phát triển 68,4%.
49


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ. Đông lạnh
phôi và trứng kỹ thuật thủy tinh hóa. 2006.

2 Đỗ Quang Minh Nguyên tắc và kỹ thuật
trữ lạnh phôi người. Y học TP. HCM. 2002,
tr.120-125.
3 Đặng Quang inh và CS Trữ lạnh phôi
và trứng người trong hỗ trợ sinh sản. Sức
khỏe và Sinh sản. 2005.
4. Andres Salmets, Christel Hyden Granskog, Anne - Maria Suikkaro, Aila
Tiitinen, Timo Tauro. Human Reproduction.
2001, 16 (10), pp.2177-2181.
5. H. Tomari, Y. Nagata, K. Hongo, K.
Takhara, K. Kunitaka. Optiming a vitrification
protocol for human embryo cryopreservation
on day 2; assessing the quality of embryo
confirmed with early cleavage and morphological

50

grading. Fertility and Sterility. 2010, September
Vol 86, Suppl 2.
6. Mukaida T, Takahashi K. Vitrification of
blastocysts using the cryoloop technique.
Vitrification in Assisted Reproduction. 2012,
pp.219-238.
7. Medicult. Vitrification. 2006.
8. Rall W.F, Fahy G.M. Ice-free cryopreservation
o
of mouse embryos at -196 C by vitrification.
Nature. 1985, 313, pp.573-575.
9. Trounson A, Mohr L. Human pregnancy
following cryopreservation, thawing and

transfer of an eight-cell embryo. Nature. 1983,
305, pp.707-709.
10. Ashwood-Smith M.J. The cryopreservation
of human embryos. Hum Reprod. 1986, 5,
pp.319-332.