Phát hiện đột biến gen p53 ở bệnh nhân ung thư vú qua nhuộm hoá mô miễn dịch và giải trình tự gen

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011

Nghiên cứu Y học

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ
QUA NHUỘM HOÁ MÔ MIỄN DỊCH VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN
Đỗ Thị Thanh Thủy*, Hoàng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung*

TÓM TẮT
Mở đầu: Ung thư vú đứng hàng thứ ba trong các loại ung thư trên thế giới. Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ tử vong
thay đổi tùy từng quốc gia. Ung thư vú liên quan đến nhiều loại biến đổi di truyền khác nhau ở tế bào sinh
dưỡng, như đột biến ở gen sinh khối u và gen ức chế khối u. Ngoài ra, yếu tố môi trường cũng tác động lên bệnh
căn của ung thư vú. Ngày nay, trong ung thư vú, các đột biến gen được nghiên cứu nhiều, nhất là ở gen ức chế
khối u p53 với tỉ lệ gặp khoảng 30%. Một số nghiên cứu đánh giá vai trò của đột biến gen p53 trong tiên lượng
bệnh ung thư vú đã gây nhiều tranh cãi. Nhiều nghiên cứu cũng đã cố gắng nhận diện giai đoạn phát sinh ung
thư vú mà tại đó đột biến p53 ở các tế bào sinh dưỡng xảy ra. Phối hợp phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
protein P53 và xác định đột biến gen p53 bằng phương pháp giải trình tự có thể giúp đánh giá được được mối
tương quan giữa đột biến gen p53 với kiểu biểu hiện của protein P53, tiên lượng sống cũng như đưa ra phương
pháp trị liệu thích hợp cho bệnh nhân.
Mục tiêu: Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 (exon 5-8) ở bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú bằng phương pháp
giải trình tự gen và sự biểu hiện protein p53 bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC).

Phương pháp: Nghiên cứu cắt ngang trên 100 bệnh nhân được chẩn đoán carcinôm tuyến vú tại Bộ Môn
Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y Dược trong thời gian từ tháng 06/2008 đến tháng 6/2010. Sử dụng kỹ thuật hóa mô
miễn dịch để xem xét sự tích tụ protein p53 trong nhân tế bào và kỹ thuật giải trình tự gen để xác định tình trạng
đột biến gen p53. Phân tích mối tương quan giữa tình trạng đột biến gen p53 và tình trạng tích tụ protein p53
trong nhân tế bào.
Kết quả: Trong các mẫu mô của bệnh nhân được chẩn đoán carcinoma tuyến vú, tỷ lệ biểu hiện tích tụ
protein P53 trong nhân tế bào là 57%. Gen p53 (exon 5 - exon 8) được phân tích bằng phương pháp giải trình tự,
tỉ lệ đột biến là 28%, đột biến xảy ở exon 5 chiếm tỉ lệ cao nhất (69,4%). Đột biến nhầm nghĩa chiếm tỉ lệ 91,6%.
Đột biến xảy ra chủ yếu ở vị trí thứ 1 và thứ 2 (100%) của mã di truyền. 33% đột biến xảy ra trong vùng trình

tự bảo tồn của gen và 25% đột biến xảy ra trong vùng CpG. Đột biến xảy ra ở codon 175 chiếm 5,6%. Đột biến
Tyr163Cys chiếm 14%. Đột biến xảy ra cao nhất trong vùng L2/L3 (36%) và L1/S/H2 (17%). Sự tương đồng
giữa đột biến gen p53 với sự tích tụ quá mức protein P53 trong nhân tế bào là 19%. Tỉ lệ tương đồng giữa biểu
hiện protein p53 và tình trạng đột biến gen p53 là 53%. 33 % số mẫu có XN HMMD dương tính có sự biến đổi
trình tự gen p53 và 68% số mẫu biến đổi gen p53 có XN HMMD dương tính. Liên quan của biểu hiện protein
P53 và đột biến gen p53 với các đặc điểm của carcinôm tuyến vú như nhóm tuổi, loại mô học, độ mô học, và tình
trạng hạch đều không có sự khác biệt.
Kết luận: Tỷ lệ biểu hiện tích tụ protein P53 trong nhân tế bào carcinôm tuyến vú (IHC) là 57% và tỉ lệ đột
biến gen p53 qua kỹ thuật giải trình tự là 28%. Tỷ lệ tương đồng giữa biểu hiện protein p53 và tình trạng đột
biến gen p53 là 53%. 33 % số mẫu có XN HMMD dương tính có sự biến đổi gen p53 và 68% số mẫu có biến đổi
gen p53 có XN HMMD dương tính.
Từ khóa: Đột biến gen, biểu hiện gen, P53, carcinôm tuyến vú.

* Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: Ts.BS. Đỗ Thị Thanh Thủy.

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

ĐT: 0908.487.425

Email:

99


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011

ABSTRACT

DETECTING P53 GENE MUTATIONS OF BREAST CANCER BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND
DIRECT SEQUENCING TECHNIQUES
Do Thi Thanh Thuy, Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 98 - 106
Background: Breast cancer is the third leading cancer on the world. The incidence and the mortality rates
vary depending on countries. Breast cancer is associated with types of somatic genetic alterations such as
mutations in tumor suppressor genes and oncogenes. Environmental agents have also affected to etiology of breast
cancer. Now, studies have paid attention on gene mutations, especially p53 gene mutations. Some studies
assessing the prognostic and predictive roles of p53 alterations in breast cancer have conflicting results. Many
studies try to identify the stages which breast cancer’s development and progression occur involving in mutations
of p53 gene in somatic cells. Dectecting the pattern of p53 gene mutations in breast cancer by DNA sequencing
and immunohistochemistry methods may be help to assess the correlation between p53 gene mutations and p53
protein accumulation, the prognosis the survival as well as having suitable treatment for patients.
Aims: - Identify the rate of p53 gene mutations (from exon 5 to exon 8) and p53 protein accumulation in the
tissues of breast diagnosed adenocarcinoma by immunohistochemistry and DNA sequencing. - Determine the
correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation in cell nuclei.
Method: Cross Sectional Study on 100 patients who were diagnosed adenocarcinoma of breast at University
of Medicine and PharcmacyDepartment of Pathology, HCMC from June 2008 to June 2010. Using
Immunohistochemistry and DNA sequencing methods to identify p53 protein accumulation and mutations of
p53 gene. Analysis of correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation in cell nuclei.
Results: Overexpressions of p53 protein is 57% and p53 gene mutations is 28% inwhich mutations in exon
5 has highest rate with 69,4%. Missense mutations has rate of 91,6%. Mutated sites usually occufy at number 1
and number 2 of codon. 33% mutations is in conserved region and 25% in CpG region. Mutation at codon 175 is
5,6% and mutation at codon 163 (Tyr163Cys) is 14%. Mutation at L2/L3 region is 36$ and L1/S/H2 region is
17%. The rate of the samples with both p53 gene mutated and overexpression of p53 protein is 19%. The
correlation between p53 gene mutation status and p53 protein accummulation status is 53%. 33% of samples
which have IHC (+) has p53 gene mutation and 68% of samples which have p53 gene mutation has IHC (+). The
relation between IHC (+), p53 gene mutation and the characteristics od breast cancer such as age group,types of
histology, histological grade and nodular status are not significantly diffirent.
Conclusion: Over expressions of p53 protein is 57% and p53 gene mutations is 28%. The correlation

between p53 gene mutatin and p53 protein accummulation is: 33% of samples which have IHC (+) has p53 gene
mutation and 68% of samples which have p53 gene mutation has IHC (+).
Key words: gene mutation, gene expression, p53, adenocarcinoma of breast.
điều trị tích cực chống lại tình trạng di căn hệ
ĐẶT VẤN ĐỀ
thống. Ung thư vú liên quan đến nhiều loại biến
Ung thư vú đứng hàng thứ nhất trong các
đổi di truyền khác nhau ở tế bào sinh dưỡng,
loại ung thư ở Việt Nam. Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ
như đột biến ở gen sinh khối u và gen ức chế
tử vong thay đổi tùy từng quốc gia. Mỗi năm có
khối u. Ngoài ra, yếu tố môi trường tác động lên
hơn 1.000.000 trường hợp mới mắc bệnh được
bệnh căn của ung thư vú. Ngày nay, trong ung
chẩn đoán. Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh tăng trong
thư vú, các đột biến gen được nghiên cứu nhiều
vòng 20 năm qua, nhưng tiên lượng của bệnh
nhất là ở gen ức chế khối u p53 với tỉ lệ gặp
được cải thiện nhiều vì được chẩn đoán sớm và

100

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
khoảng 30%. Một số nghiên cứu đánh giá vai trò
của đột biến gen p53 trong tiên lượng bệnh ung
thư vú đã gây nhiều tranh cãi. Nhiều nghiên
cứu cũng đã cố gắng nhận diện giai đoạn phát

sinh ung thư vú mà tại đó đột biến p53 ở các tế
bào sinh dưỡng xảy ra. Hai phương pháp phân
tích đột biến gen p53 là giải trình tự gen p53 và
hóa mô miễn dịch (IHC) xem xét sự biểu hiện
protein p53. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi
thực hiện giải trình tự gen p53 từ exon 5-8 là
vùng tập trung tỉ lệ đột biến cao nhất, đồng thời
phân tích sự biểu hiện protein p53 ở các bệnh
nhân này bằng phương pháp hóa mô miễn dịch
(IHC).

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
100 bệnh nhân được chẩn đoán carcinôm
tuyến vú tại Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y
Dược trong khoảng thời gian từ tháng 06/2008
đến tháng 6/2010 với đầy đủ hồ sơ bệnh án.

Phương pháp nghiên cứu
Kỹ thuật hoá mô miễn dịch về sự biểu hiện của
protein P53
Bệnh phẩm
Mẫu mô carcinôm tuyến vú được cố định
trong formol đệm trung tính từ 6 – 48 giờ và vùi
trong paraffin.
Kháng thể được sử dụng
thể

DO-7

của

nhà

sản

trước đó và chứng âm là không phủ kháng thể
thứ nhất.

Kỹ thuật giải trình tự phát hiện đột biến gen
P53
Tách chiết DNA từ bệnh phẩm
Thu hoạch tế bào từ mô vùi nến bệnh
phẩm carcinôm tuyến vú. Sau khi đã được
chẩn đoán giải phẫu bệnh, vùng mô ung thư
được đánh dấu trên tiêu bản HE. Đối chiếu
với tiêu bản HE, đánh dấu vùng mô ung thư
trên tiêu bản trắng và lấy vùng tế bào ung thư
vào tube ly tâm 1,5ml.
Tách chiết DNA từ mô CRC bằng QIAkit
PCR khuyếch đại đoạn gen p53 chứa exon 5-8:

Đối tượng nghiên cứu

Kháng

Nghiên cứu Y học

xuất

DakoCytomation, Đan Mạch, với độ pha loãng 1/25.

Đọc kết quả và đánh giá dưới kính hiển vi quang học
Về sự biểu hiện tích tụ quá mức protein
TP53, dựa vào tỷ lệ % nhân tế bào bắt màu và
đậm độ bắt màu: 0 (không bắt màu hoặc <10%
bắt màu); 1(+) (bắt màu nhạt > 10%); 2(+): (bắt
màu trung bình > 10%); 3(+): bắt màu đậm >
10%; Âm tính: 0; Dương tính: 1(+), 2(+), 3(+) với

Dùng
cặp
mồi
p53g5F2
5’GGTTGCAGGAGGTGCTTACA-3’ và p53g8R5’GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG-3 để khuyếch
đại đoạn DNA chứa các exon 5-8 có kích thước
1741bp từ hệ gen DNA đã li trích.
Thành phần phản ứng: 5 µl 10X PCR
buffer, 5 µl 2,5 mM dNTP, 2,5 µl p53g5F2
(10µM), 2,5 µl p53g8R (10µM), 0,3 µl Takara
Tag TM HS, 2,5 µg DNA.
Chương trình PCR : 98 oC x 1 phút, 98 oC x 10
giây, 60 oC x 30 giây, 72 oC x 2 phút (40 chu kì),
72oC x 5 phút.
Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR trên gel
agarose với thang chuẩn Ready-LoadTM 1 Kb
Plus DNA Ladder để xác định kích thước của
sản phẩm PCR.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng kit GFX của QIAgen.
PCR trước giải trình tự và kết tủa DNA bằng ethanol
Tiến hành PCR giải trình tự các sản phẩm

PCR đã tinh sạch trên bằng 1 mồi xuôi hoặc 1
mồi ngược, tạo ra một lượng lớn các đoạn DNA
chồng lắp nhau hơn kém nhau 1 nucleotid, có
nucleotide cuối cùng gắn 1 chất bắt màu đặc
hiệu sẽ phát huỳnh quang dưới đèn laser.

chứng dương là mô carcinôm tuyến vú có mức
biểu hiện protein P53 đã biết dương tính (3+)

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

101


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011

Thành phần phản ứng PCR
4 µl Big Dye terminator V.3.1, 0.3 µl mồi (10
μM), 12,7 μl đệm giải trình tự 1X, 3 μl PCR đã
tinh sạch. Các mồi dùng cho giải trình tự
P53g5F2-GGTTGCAGGAGGTGCTTACA, P53,56R -CACTGACAACCACCCTTAAC, P53seq7F
– GGCCTCCCCTGCTTGCCACA, P53g8R –
TGCTAGGAAAGAGGCAAGG. Toàn bộ sản
phẩm PCR giải trình tự này được thu lại theo
phương pháp kết tủa bằng ethanol và hòa tan
tủa DNA trong dung dich TE hay nước cất.
Giải trình tự các sản phẩm PCR
Mỗi đoạn DNA khoảng 500-600bp được giải

trình tự 2 chiều bằng mồi xuôi và mồi ngược
trên máy ABI 3100 Genetic Analyser. Kết quả
giải trình tự được đọc bằng chương trình
Sequencing Analysing v.2.5. Sau đó, dùng phần
mềm SeqCap để so với trình tự chuẩn
NC_000017.10 trên GenBank, xác định sự biến
đổi nucleotid thuộc exon nào, codon nào, là
SNP hay đột biến, là đột biến loại nào. Các dữ
liệu đột biến được tra cứu theo dữ liệu của
IARC, dữ liệu về SNP của gen p53 được tra cứu
trên hệ thống dữ liệu của NCBI.

Bảng 2. Biểu hiện của protein p53 qua kết quả
HMMD
Protein p53

Số ca

Tỉ lệ

1+

23

23,0

2+

8

8,0

3+

26

26,0

Âm tính

43

43,0

Tổng cộng

100

100,0

Tỉ lệ không tích tụ protein p53 (âm tính) là
43% và tích tụ protein TP53 trong nhân là 57%,
tỷ lệ này cao hơn so với các nghiên cứu khác.
Zellars và cộng sự đánh giá sự biểu hiện P53
trên 1530 bệnh nhân carcinôm tuyến vú cho thấy
tỷ lệ dương tính là 51%(14). Nhiều nghiên cứu
khác cho thấy tỉ lệ protein P53 (+) dao động
trong khoảng từ 18% - 51% (Bảng 3), nguyên
nhân được giải thích chủ yếu là do: sự khác biệt
về nhóm tuổi (trước và sau mãn kinh), giai đoạn

lâm sàng (có và chưa di căn hạch), và sự khác
biệt về độ nhạy của các kháng thể trong kỹ thuật
hoá-mô-miễn dịch(10).
Bảng 3. So sánh tỷ lệ p53 (+) trong carcinôm tuyến
vú với các tác giả khác
Tác giả
Cỡ mẫu Tỉ lệ protein p53 (+)%
(14)
Zellar và cộng sự
1530
51
(12)
Sjogren và cộng sự
315
20
(13)
Thor và cộng sự
994
33
Nghiên cứu này
100
57

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Khảo sát sự biến đổi trình tự của gen p53

Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu

Tỉ lệ đột biến gen p53

Bảng 4. Tỉ lệ đột biến exon 5, 6, 7, 8 ở gen p53

Tuổi
Nghiên cứu này khảo sát các bệnh nhân ung
thư vú từ 29 đến 74 tuổi, trung bình là 40,5 (±
9,9) tuổi, tập trung chủ yếu ở độ tuổi từ 30-39,
chiếm tỉ lệ 51%.
Bảng 1. Tuổi của bệnh nhân nhóm nghiên cứu
Tuổi 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 ≥ 70
Số ca
8
51
29
5
5
2
Tỉ lệ % 8%

51%

29%

5%

5%

2%

TC
100

100%

Hóa mô miễn dịch
Biểu hiện của protein P53 qua kết quả HMMD.

102

Đột biến gen p53 (exon 5-8)
Không đột biến
Có đột biến
Tổng

Số lượng
72
28
100

Tỉ lệ %
72
28
100

Bảng 5. Tỉ lệ đột biến gen p53 của các nghiên cứu
khác
Số lượng
đột biến

Tỉ lệ đột
biến

100

28

28%

2000

27

10

37%

Alsner J.

2000

315

74

25%

(9)

2009

14482

3662

25,3%

Nhóm nghiên
cứu

Năm Số mẫu

Nghiên cứu này

2010

(10)

Jin-Woo Ryu
(1)

IARC

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
Theo bảng 4, tỉ lệ gen p53 bị đột biến trên các
exon 5, 6, 7, 8 chiếm tỉ lệ 28%. Cho đến nay,
người ta nhận thấy tần xuất xuất hiện đột biến
gen p53 ở tất cả các loại ung thư là 50%(6). Còn
trong các bệnh nhân ung thư vú, tần xuất đột
biến gen p53 được ghi nhận thay đổi từ 15 đến

71%(6,7,10). Sự khác biệt về tần xuất phát hiện đột
biến ở các nghiên cứu khác nhau tùy thuộc vào
việc tầm soát các nhóm dân số nghiên cứu khác
nhau, kỹ thuật khác nhau, hay việc giải trình tự
toàn bộ gen 53 hay chỉ nhắm vào vùng exon số 5
đến exon số 8, là nơi có tần suất đột biến cao
nhất… Theo nhiều nghiên cứu, tỉ lệ đột biến gen
p53 gặp khoảng 25-40% trong ung thu vú. Tuy
vậy, có nghiên cứu chỉ tìm thấy 2,7% đột biến
gen p53. Theo tổng kết của IARC (năm 2009)(9), tỉ
lệ đột biến gen p53 gặp trong ung thư vú là
25,3% (bảng 3-5), tương đồng với nghiên cứu
của chúng tôi.

Vị trí exon bị đột biến
Bảng 6. Đột biến ở từng exon 5 – 8 gen p53
Kết quả đột biến Exon 5-8

Số lượng

Tỉ lệ %

Exon 5

25

69,4%

Exon 6

5

13,9%

Exon 7

4

11,1%

Exon 8

2

5,6%

Theo bảng 6, tỉ lệ đột biến gen p53 ở các exon
5, 6, 7, 8 lần lượt là 69%, 14%, 11% và 6%. Tỉ lệ
đột biến p53 trên exon 5 xảy ra với tỷ lệ cao nhất
(69%). Nhiều tác giả cho rằng đột biến gen p53
nằm chủ yếu ở các exon 5, 6, 7 và 8, tỷ lệ này có
thể chiếm từ 80 đến 95%. Đây là vùng có tính
bảo tồn cao, là vùng chức năng nơi các protein
điều hòa hoạt động gen bám vào và là vùng
bám DNA của protein P53. Chính vì vậy trong
nghiên cứu này, do kinh phí có hạn, chúng tôi
tập trung tìm đột biến gen p53 ở các exon 5-8
trong các mẫu mô vùi nến có kết quả giải phẫu
bệnh carcinôm tuyến vú. Tuy nhiên, theo
Osborne R.J, tỷ lệ đột biến trên exon 5 dường

như không phải cao nhất so với các exon khác
trong vùng bảo tồn hay theo Ryu J.W(10), thì tỷ lệ

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Nghiên cứu Y học

đột biến gen p53 lại gặp ở exon 7 nhiều hơn
(70%) khi nghiên cứu trên mẫu ung thư vú ở của
phụ nữ Hàn Quốc.

Về các vị trí codon bị đột biến
Vị trí acid amin đột biến thường gặp nhất là
Cys 135, Arg158, Tyr163, Asn239 với tỷ lệ lần
lượt là 11%, 14%, 14%, và 6%. Các vị trí acid
amin đột biến thường gặp (hotspots) hay nằm
trong vùng DNA dễ bị tổn thương (như vị trí
cặp nucleotide CpG) hoặc là bộ mã di truyền mã
hóa cho một acid amin chủ chốt trong vùng
thực hiện chức năng sinh học của protein, hoặc
cả hai. Phân bố đột biến ở các codon của gen p53
trong carcinôm tuyến vú tại các vị trí thường
gặp tương tự với các loại ung thư khác. Theo
Cho(5), các vị trí hotspots lần lượt là Arg175,
Gly245, Arg248, Arg249, Arg273, và Arg282
trong tất cả các dạng ung thư. Tuy nhiên, theo
Feki(7) đột biến tại codon 163 (TAC thành TGC)
chiếm khoảng 2% trong carcinôm tuyến vú,
trong khi đó đột biến ở codon này trong các ung
thư khác chỉ chiếm khoảng 1%. Ngoài ngoại lệ

này, các nghiên cứu trên toàn cầu đều cho thấy
sự khác biệt về đột biến gen p53 trong carcinôm
tuyến vú và các ung thư khác là không có ý
nghĩa. Trong nghiên cứu này, đột biến Arg 175
gặp với tỷ lệ 5,6%. Theo Hamroun(7), đột biến
Arg175 là đột biến thường gặp và 90% đột biến
này là dạng Arg175 His, còn đột biến trong
nghiên cứu của chúng tôi tuy cũng rơi vào vị trí
175, nhưng từ Arg biến đổi thành Cys (2,8%) và
Prolin (2,8%). Đột biến này có tính chọn lọc cao
trong các bệnh ung thư ở người, là do protein
P53 có chức năng cần thiết trong gấp xoắn ở
vùng liên kết DNA đồng thời có khả năng đột
biến cao của dinucleotid CpG được methyl hoá
ở codon này (CGA)(14). Ngoài ra, chúng tôi
không gặp các đột biến thường gặp khác như
các tác giả nêu trên, tuy nhiên điều lưu ý là có
đột biến 163 (Tyr (TAC) thành Cys (TGC)) chiếm

103


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011

tỷ lệ 14%, và trong 5 trường đột có đột biến Tyr
163 thì có 4 trường hợp đột biến này đi kèm với
đột biến Cys 135 Tyr. Ngoài ra, có 5 trường hợp
có đột biến tại Arg158 (tỷ lệ 14%), vậy liệu

chúng có phải là các đột biến thường gặp trong
bệnh nhân carcinôm tuyến vú tiên phát ở người
Việt Nam. Tương tự như nghiên cứu của Coles
C trên 136 bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú với
41 trường hợp có đột biến p53, nhưng tác giả
cũng nhận thấy không có đột biến nào được gọi
là đột biến thường gặp như một số tác giả khác
đã nêu. Như vậy, tỷ lệ đột biến trên các quần thể
khác nhau liệu có sự phân bố đột biến trên gen
p53 khác nhau?

Số lượng đột biến trên một mẫu bệnh phẩm
Bảng 7. Số lượng đột biến trên một mẫu bệnh phẩm
2 đột biến/1 mẫu

1 đột biến/1
mẫu
20
71%

Số mẫu
Tì lệ %

1 exon

2 exon

6 (21%)

2 (8%)

29%

Tổng
28
100%

Theo Bảng 7 số mẫu bệnh phẩm vùi nến của
một bệnh nhân carcinôm tuyến vú chỉ mang 1
đột biến chiếm tỷ lệ 71%, mang 2 đột biến chiếm
29% (trong đó 2 đột biến trên cùng một exon
chiếm 21% và 2 đột biến trên 2 exon chiếm 8%).
Andersson(2) cũng tìm thấy có 4,8% khối u có
thậm chí 2 loại đột biến khác nhau, vừa đột biến
điểm nhầm nghĩa vừa đột biến mất nucleotid
hoặc thêm nucleotid.

Các kiểu đột biến gen p53
Bảng 8. Phân loại các kiểu đột biến theo vị trí exon trên gen p53
Các dạng biến đổi
Đột biến thay thế
Nhầm nghĩa
Vô nghĩa
Đột biến dịch khung
Mất
Thêm
Đột biến điểm
Tại A
Tại T
Tại G
Tại C

Đồng hoán
A→G
G→A
C→T
T→C
Dị hoán
A→T
G→T
G→C
T→G
Khác
Vị trí Nu đột biến trong codon
1
2
Vùng CpG
Trong
Ngoài
Vùng trình tự bị đột biến
Bảo tồn

104

Exon 5
24
24
0
1
1
0
25

7
4
10
4
17
6
4
3
4
7
1
5
1
0
1
25
4
21
24
8
16

Exon 6
4
4
0
1
0
1
5

0
3
1
1
3
0
1
0
2
1
0
0
0
1
1
5
0
5
6
1
5

Exon 7
4
4
0
0
0
0
4

1
0
3
0
4
3
1
0
0
0
0
0
0
0
0
4
3
1
4
0
4

Exon 8
2
1
1
0
0
0
2

0
2
0
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
0
0
2
2
0
2
0
2

Số lượng
34/36
33/36
1/36
2/36
1/36
1/36
36/36

8/36
9/36
14/36
5/36
25/36
9
6
4
6
9/36
1
6
1
1
2/36
36/36
9/36
27/36
36/36
9/36
27/36

Tỉ lệ %
94,4
91,6
2,8
5,6
2,8
2,8
100%

22,2%
25,0%
38,9%
13,9%
69,4%
25%
16,7%
11,1%
16,7%
25%
2,8%
16,7%
2,8%
2,8%
5,6%
100.0%
25%
75%
100%
25%
75%

9

0

3

0

12/36

33,3%

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
Các dạng biến đổi
Không bảo tồn

Exon 5
16

Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến thay thế gồm đột
biến nhầm nghĩa 91,6% và đột biến vô nghĩa
chiếm 2,8% so với tỷ lệ đột biến dịch khung
5,6%. Kết quả của nghiên cứu này tương đồng
với nghiên cứu về tỷ lệ đột biến nhầm nghĩa ở
phụ nữ bị ung thư vú Nhật Bản cũng chiếm
93%. Theo dữ liệu của IARC, tỷ lệ các loại đột
biến nhầm nghĩa, vô nghĩa, dịch khung lần lượt
là 73,6%, 7,67% và 8,85%. Số liệu ở nghiên cứu
này có khác với số liệu của IARC (2009) có thể
do phạm vi nghiên cứu của đề tài chỉ giới hạn
trong vùng exon 5-8 của gen p53, ngược lại, dữ
liệu đột biến của IARC được tổng hợp trên các
nghiên cứu trên toàn bộ gen p53, cả vùng exon
và intron. Tuy vậy cũng có nhiều tác giả đề cập
nghiên cứu của họ chỉ có khoảng >60% là đột

biến nhầm nghĩa.
Trong Bảng 8, tỷ lệ đột biến điểm trên exon
5-8 gen p53 chiếm đến 100%. Theo nghiên cứu
của Catalin M.(4), trên 803 mẫu mô khối u
carcinôm tuyến vú, tỷ lệ đột biến điểm trong các
gen p53 bị đột biến là 95%. Trong nghiên cứu
của Coles C(6), tỷ lệ đột biến của gen p53 là 89%.
Nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ đột biến điểm
cao hơn các tác giả khác, có lẽ do chỉ tập trung
giải trình tự ở vùng exon 5-8. Trong các loại đột
biến điểm, tỷ lệ đột biến tại G cao nhất, chiếm
39% so với các thành phần khác. Tuy nhiên tỷ lệ
đột biến tại G và C cũng tương đồng với tỷ lệ
đột biến tại A và T. Đột biến đồng hoán chiếm
tỷ lệ chính 69,4% so với đột biến dị hoán chiếm
25%. Trong đó, tỷ lệ đột biến đồng hoán AG
là cao nhất chiếm 25%, trong khi đó ở ung thư
đại-trực tràng tỷ lệ đồng hoán G A chiếm 36%.
Trong tỷ lệ đột biến dị hoán, tỷ lệ GT cao nhất
là 16,7% so với ung thư đại –trực tràng là 10%.
Điều này khác biệt so với nhận xét của Feki A(7)
về đột biến trong carcinôm tuyến vú. Theo
nghiên cứu của Sasa(11), trong đột biến đồng
hoán, tỷ lệ GA lại chiếm đa số (53%), và
không có đột biến dị hoán GT nào trong 62
trường hợp phụ nữ Nhật bị ung thư ống tuyến
vú.

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Exon 6
5

Exon 7
1

Nghiên cứu Y học
Exon 8
2

Số lượng
24/36

Tỉ lệ %
66,7%

Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy ra ở vùng
CpG trong carcinôm tuyến vú chiếm tỷ lệ 25%,
khác biệt so với trong carcinôm tuyến đại trực
tràng, tỷ lệ đột biến ở vùng CpG là 58%.

Vị trí nucleotid bị đột biến
Cũng theo Bảng 8, tỷ lệ nucleotid bị đột biến ở
vị trí thứ 1 và thứ 2 trong codon lần lượt là 25% và
75%. Trong mã di truyền, vị trí nucleotid thứ nhất
và thứ hai có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
protein. Vì vậy, khi đột biến xảy ra ở vị trí thứ 1
hay thứ 2 của codon, có nhiều khả năng sẽ làm
thay đổi thành phần và cấu trúc của protein, phù
hợp với tỷ lệ đột biến nhầm nghĩa chiếm 94%.

Vùng trình tự bị đột biến
Trong Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy ra ở trong
vùng trình tự bảo tồn là 33% và ngoài vùng
trình tự bảo tồn là 67%. Đột biến trong vùng
trình tự bảo tồn thứ tự là vùng II (16,7%), vùng
III (8,3%) và vùng IV (8,3%). Số liệu này khác
biệt so với nghiên cứu của Coles C (6), 68% đột
biến nằm trong vùng bảo tồn, thứ tự vùng II
(8%), vùng III (12%), vùng IV (23%) và vùng V
(25%).

Sự biến đổi protein P53
Acid amin bị biến đổi
Theo Bảng 8, codon mã hóa acid amin Arg bị
đột biến nhiều nhất, chiếm tỷ lệ 22% trong tổng
số đột biến, sau đó là codon mã hóa Cys 18% và
Tyr 14%, còn các loại codon mã hóa cho các acid
amin khác có tỷ lệ đột biến không quá 9%.
Nhóm acid amin bị đột biến
Theo Bảng 8, sự thay đổi acid amin cùng
nhóm, khác nhóm và mất acid amin của protein
P53 lần lượt là 25,0%, 69,0% và 6,0%, acid amin
là thành phần cốt lõi của protein, bất kì sự thay
đổi acid amin nào trên protein cũng ảnh hưởng
đến cấu trúc và chức năng của protein.
Vùng protein chức năng bị đột biến
Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy ra ở vùng
chức năng là 53%, bao gồm vùng L1/S2-S2’ β, L2
và L3 tương ứng 17%, 28% và 8%. Đây là những

105


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011

vùng protein P53 liên kết với DNA và phân tử
Zn. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, không có
acid amin nào gắn trực tiếp với DNA hay Zn bị
đột biến.

Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 và
biểu hiện quá mức P53
Bảng 9. Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 và
biểu hiện quá mức protein P53
SEQ HMMD
Dương tính
Âm tính
Tổng

Có đột biến Không đột biến Tổng
p53
p53
19 (19%)
38 (38%)
57
9 (9%)
34 (34%)
43

28 (28%)
72 (72%)
100 (100%)

Theo Bảng 9, sự tương đồng giữa đột biến
gen p53 với sự vượt mức biểu hiện protein p53
trên bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú là 19%. Tỉ
lệ mẫu có XN HMMD (+), có đột biến gen p53 là
19% và tỉ lệ mẫu có XN HMMD (-), không có
đột biến p53 là 34%, như vậy, hai phương pháp
phát hiện biểu hiện protein p53 và biến đổi trình
tự gen p53 này có kết quả tương đồng là 53%.
Như vậy, 33 % số mẫu có XN HMMD (+) có
sự biến đổi trình tự gen p53 (19/57) và ngược lại
68% số mẫu có biến đổi gen p53 có XN HMMD
(+) (19/28). Có 2 trường hợp đột biến kiểu dịch
khung (do mất hay thêm nucleotide) đều có XN
hóa mô miễn dịch (-), tương tự nghiên cứu của
Askmalm S. M(3), và Williams C.(14).
Askmalm S. M nhận thấy 83% mẫu có đột
biến gen p53 thì XN HMMD (+), nhưng chỉ có
61% khối u có XN HMMD (+) thì có đột biến gen
p53. Điều này chứng tỏ tình trạng biểu hiện
vượt mức protein p53 trong hóa mô miễn dịch
không tương đồng cao với kiểu gen p53 đột biến.
Theo số liệu bảng 9, số mẫu được phát hiện
có mang đột biến gen p53 nhưng lại không có sự
biểu hiện vượt mức protein p53 chiếm 9,0%,
những trường hợp này có thể giải thích bằng
một trong nhiều các giả thiết như một số đột

biến gen tạo ra các protein ngắn nên không
được IHC phát hiện, hay gen p53 có đột biến
trong vùng exon 5-8 nhưng đồng thời còn có
những biến đổi ở các vùng khác làm cho protein
p53 không được biểu hiện trong tế bào…

106

Tương tự, số mẫu được phát hiện có sự biểu
hiện vượt mức protein p53 nhưng lại không có
đột biến gen p53 trong vùng exon 5-8 chiếm 36%.
Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là có
các đột biến nằm ngoài vùng exon 5-8, có sự
biến đổi của các yếu tố kiểm soát quá trình biểu
hiện protein P53….
Liên quan của biểu hiện protein P53 và đột
biến gen p53 với các đặc điểm của carcinôm
tuyến vú như nhóm tuổi, loại mô học, độ mô
học, và tình trạng hạch đều không có sự khác
biệt.

KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy
trong các mẫu mô của bệnh nhân được chẩn
đoán carcinôm tuyến vú, tỷ lệ biểu hiện tích tụ
protein P53 trong nhân tế bào carcinôm vú là
57%. Gen p53 (exon 5 - exon 8) được phân tích
bằng phương pháp giải trình tự gen phát hiện
đột biến thì tỉ lệ đột biến gen p53 là 28%, đột biến
xảy ở exon 5 chiếm tỉ lệ cao nhất (69,4%). Đột

biến nhầm nghĩa chiếm tỉ lệ 91,6%. Đột biến xảy
ra chủ yếu ở vị trí thứ 1và thứ 2 (100%) của mã
di truyền. 33% đột biến xảy ra trong vùng trình
tự bảo tồn của gen và 25% đột biến xảy ra trong
vùng CpG. Đột biến xảy ra ở codon 175 chiếm
5,6%. Đột biến Tyr163Cys chiếm 14%. Đột biến
xảy ra cao nhất trong vùng L2/L3 (36%) và
L1/S/H2 (17%).
Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 với sự
quá mức biểu hiện protein P53 trên bệnh nhân bị
carcinôm tuyến vú là 19%. Tỉ lệ tương đồng
giữa biểu hiện protein p53 và tình trạng đột biến
gen p53 là 53%. 33 % số mẫu có XN HMMD (+)
có sự biến đổi trình tự gen p53 và 68% số mẫu có
biến đổi gen p53 có XN HMMD (+).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

Alsner J., et al., (2000),"Heterogeneity in the clinical phenotype
of TP53 mutations in breast cancer patients". Clinical Cancer
Reseach, 6: p. 3923-3931.
Andersson J, Larsson L, Klaar S, Holmberg L, Nilsson J, Inganäs M,
Carlsson G, Ohd J, Rudenstam CM, Gustavsson B, Bergh J. (2005):
Worse survival for TP53 (p53)-mutated breast cancer patients receiving
adjuvant CMF. Ann Oncol. 2005 May;16(5):743-8.

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011
3.

4.

5.

6.
7.

8.

9.
10.

Askmalm M.S., et al., (2004),"Mutation and accumulation of p53
related to results of adjuvant therapy of postmenopausal breast cancer
patients". Acta Oncologica, 43-43.
Catalin M, (2009) "Large study documents how P53 mutations link to
high-grade breast cancer, poor outcomes". PHYSORG: p.
www.physorg.com/news159374125.html.
Cho Y., Gorina S., et al. (1994), “Crystal structure of a p53 tumor
suppressor-DNA
complex:
understanding
tumorigenic
mutations”, Science 265, pp. 346-355.
Coles C., Condie A., (1992), “p53 Mutations in Breast Cancer”,
Cancer Res, 52; 5291-92.

Feki A. and Irminger-Finger I., (2004),"Mutational spectrum of
p53 mutations in primary breast and ovarian tumors". Critical
Reviews in Oncology/Hematology, 52: p. 103-116.
Hamroun D. and Kato S., (2006),"The UMD TP53 Database and
Website: Update and Revisions". Human mutation, 27(1): p. 1420.
/>Ryu J.W., Lee M.C., and J. WC, (2000),"Detecting p53 gene
mutation of breast cancer and defining differences between

Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh

11.

12.

13.

14.

15.

Nghiên cứu Y học

silver staining PCR-SSCP and immunohistochemical staining.". J
Korean Medical Sciences, 15(1): p. 73-77.
Sasa M., et al., (1994),"P53 alteration correlates with negative ER,
negative PGR, and high histologic grade in breast cancer". Journal
of Surgical Oncology, 56 (1): p. 46-50.
Sjogren S., Inganas M., Lindren A., Holmberg L., Bergh J., (1998),
“Prognostic and predictive value of c-erbB-2 overexpression in
primary breast cancer, alone and in combination with other

prognostic markers”, Journal of Clinical Oncology, 16, pp. 462-469.
Thor A.D., Moore D.H., et al (1992), “Accumulation of p53
Tumor Suppressor gene protein: An independent marker of
prognosis in breast cancer”, Journal of the National Cancer
Institute, 84, pp. 845-855
Williams C., et al., (1998),"Assessment of sequence-based p53 gene
analysis in human breast cancer: messenger RNA in comparison with
genomic DNA targets", Clinical Chemistry, 44(3): p. 455-462.
Zellars R.C., Hilsenbecck S.G., and et al. (2000), “Prognostic
value of p53 for local failure in mastectomy-treated breast cancer
patients”, Journal of Clinical Oncology, 18, pp.1906-1913.

107