Biến thế Ebnai ở bệnh nhân ung thư vòm múi họng Việt Nam, Trung Quốc và ở người Việt Nam bình thường docx

TCNCYH 25 (5) - 2003
Biến thể ebnai ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng
Việt Nam, Trung Quốc và ở ngời Việt Nam bình thờng

Nguyễn Văn Đô
1
, Trần Thị Chính
1
, Phan Thị Phi Phi
1
,
Ingemar Ernberg
2
, Li Fu Hu
2
1
Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh trởng đại học Y Hà Nội
2
MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển

EBNA (EBV - nuclear antigen1) là một protein duy nhất đợc biểu lộ ở tất cả các tế bào bị
nhiễm virut Epstein - Barr. Biến thể của EBNA1 đã đợc định nghĩa dựa vào acid amin ở vị trí thuộc
mã bộ ba 487 của DNA và bao gồm các dới nhóm là P (prototype): P- ala (B95 -8) và P- thr; V
(variant): V - val, V - leu và V - pro.
Chúng tôi đã phân tích trình tự DNA ở đầu cacboxy của EBNA1 từ sản phẩm PCR. Các mẫu
DNA cho kỹ thuật PCR đợc chiết tách từ khối u vòm họng và máu ngoại vi của bệnh nhân ung th
vòm họng ngời Việt Nam và Trung Quốc, thể biểu mô không biệt hoá; máu ngoại vi của ngời cho
máu Việt Nam.
Kết quả cho thấy EBNA1 ở ngời bình thờng và bệnh nhân ung th vòm mũi họng có các đột
biến điểm dẫn đến thay đổi các acid amin và các biến thể này thuộc dới nhóm của V - val: V - val
- v1 (9/10 cặp mẫu và 5 ngời bình thờng) và V - val - v2 (1/10 cặp mẫu). Trong số 15 cặp mẫu

của bệnh nhân ung th vòm họng ngời Trung Quốc, ở khối u có dới nhóm là V - val - v1 (15/15),
còn máu ngoại vi chỉ có 2 mẫu (2/15) là P - ala và một mẫu nghi ngờ có cả P - ala và V- val - 1.

I. Đặt vấn đề
Virút Epstein - Barr (EBV), một virut thuộc
nhóm herpes, đợc lây nhiễm ở hầu hết các
quần thể dân c trên thế giới. Sự tồn tại của
virut trong cơ thể bị nhiễm có hai dạng là thể
dung giải và thể tiềm ẩn. Khởi đầu của chu kỳ
dung giải là sự xâm nhập của các virut vào liên
bào lympho B ở vòm họng nhờ các rêxepơ
thích hợp. Virut đợc nhân lên trong tế bào và
tạo ra các hạt virut. Các hạt virut này lại đợc
giải phóng ra và lây nhiễm sang các tế bào
lành khác hoặc các cơ thể khác qua con đờng
nớc bọt. Thể nhiễm tiềm ẩn xuất hiện sau khi
nhiễm dung giải ở các cơ thể bị nhiễm. Thể này
gồm các hình thái I, II, III và sự biểu lộ gen của
EBV khác nhau tuỳ theo hình thái nhiễm, ở các
bệnh khác nhau. ở thể nhiễm tiềm ẩn I chỉ có
EBER và EBNA1, hình thái II có thêm các gen
khác biểu lộ nh LMP1, LMP2 và hình thái III
tất cả các gen của hình thái I và II và thêm
EBNA2 - 6 biểu lộ. EBV là nguyên nhân gây ra
bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và
là virut có liên quan đến một số bệnh lý ác tính
ở ngời nh u lympho Burkitt (BL) [1], ung th
vòm mũi họng (UTVMH) [2,3].
EBNA1 là một protein của EBV đợc biểu lộ
ở tất cả các thể nhiễm tiềm ẩn trong tế bào

nhiễm EBV. Nó có vai trò rất quan trọng là yếu
tố hệ thống các gen khởi động của EBV giúp
cho quá trình sao chép ADN và phân chia của
EBV để duy trì sự tồn tại của EBV trong tế bào,
đồng thời điều hoà sự biểu lộ của chính EBNA1
và các gen khác của thể nhiễm tiềm ẩn nh
EBNA 2 - 6, LMP1,2.
Trình tự gen của EBV thuộc dòng tế bào
B95 -8 đã đợc phân tích hoàn chỉnh và cấu
trúc của gen EBNA1 liên quan đến các chức
năng của nó đã đợc nghiên cứu và làm sáng
tỏ. Một số tác giả đã phát hiện thấy các đột
biến điểm của gen EBNA1 dẫn đến sự thay đổi

23
TCNCYH 25 (5) - 2003
các acid amin trong chuỗi protein ở các chủng
EBV từ các vùng địa lý khác nhau trên thế giới
và từ những bệnh lý khác nhau có liên quan.
Các công trình nghiên cứu đều cho thấy các
đột biến thờng xảy ra ở vùng có chức năng
gắn DNA thuộc đầu cocboxy của EBNA1 [4,5].
Bhatia và cộng sự 1996 cũng đã phân tích trình
tự gen EBNA1 của EBV thuộc dòng B95 - 8 so
sánh với một số chủng EBV khác và đã phân
loại EBNA1 thành 5 dới nhóm khác nhau, đó
là P - ala, P - thr, V - pro, V - leu và V - val (P
là prototype thuộc chủng B95 - 8, còn V là
variant).
ở Việt Nam cha có công trình nào nghiên

cứu về phân tích trình tự gen và phát hiện đột
biến gen EBNA1 của EBV.
Mục tiêu của công trình này là:
1. Phân tích trình tự gen EBNA1 ở đầu tận
cacboxy của DNA, tách chiết từ mô sinh thiết
ung th vòm mũi họng (UTVMH) và máu ngoại
vi ngời khỏe mạnh.
2. So sánh trình tự gen EBNA1 của bệnh
nhân UTVMH Việt Nam với trình tự gen này ở
bệnh nhân UTVMH Trung Quốc với gen EBNA
của chủng B95 - 8 châu Âu và của máu của
ngời khoẻ mạnh Việt Nam.
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
1. Đối tợng
1.1. Bệnh nhân ung th vòm mũi họng
DNA đợc chiết tách từ 10 cặp mẫu gồm
sinh thiết khối u vòm họng đợc chẩn đoán xác
định bằng giải phẫu bệnh lý là ung th biểu mô
không biệt hoá và máu của mỗi bệnh nhân
tơng ứng. Các bệnh nhân này đợc chẩn
đoán và điều trị tại bệnh viện K Hà Nội. 15 cặp
mẫu bệnh nhân ung th vòm họng thể biểu mô
không biệt hoá đợc lấy từ Quảng Đông, Trung
Quốc.
1.2. Ngời bình thờng
DNA đợc chiết tách từ 5 mẫu máu lấy từ
ngời cho máu tại Viện Huyết học và Truyền
máu Trung ơng.
2. Phơng pháp nghiên cứu

2.1. Chiết tách DNA
2.1.1. Chiết tách DNA từ máu toàn phần
5ml máu đợc chống đông bằng EDTA bảo
quản trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 4
0
C. Cho
10ml dung dịch phá hồng cầu (1mM NH
4
HCO
3

115mM NH
4
Cl) vào falcon 15ml đã đựng sẵn
máu chống đông, lắc đều và ly tâm 1200g x 10
phút. Loại bỏ dịch và giữ lại phần cặn. Làm tan
cặn và cho 10ml dung dịch phá hồng cầu lần 2,
ly tâm lấy cặn nh trên. Cho 1,8ml dung dịch
phá bạch cầu (100mM tris - C1, pH 7,6; 40mM
EDTA, pH 8.0; 50mM NaCl; 0,2% SDS; 0,05%
sodium azide) vào cặn bạch cầu thu đợc và
lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm để làm
tan hết các bạch cầu, dung dịch trở nên đặc và
nhầy. Cho 10àl proteinase K nồng độ
20mg/mL vào bạch cầu đã đợc làm tan và ủ ở
50
0
C, 2 giờ có lắc theo chu kỳ. Thêm 600àl
NaCl 6M, lắc 10 phút và ly tâm 1200 vòng/
phút x 5 phút, loại bỏ nớc nổi. Cho 5ml cồn

70
0
vào cặn DNA, ly tâm 1200 vòng/ phút x 5
phút. Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng và hoà
tan trong 400àl - 500àl TE.
2.1.2. Chiết tách DNA từ mô sinh thiết tơi
Cho 560àl dung dịch phá huỷ tế bào (0,6%
SDS; 10mM EDTA; 10mM Tris, pH 7,5;
200àg/ml RNaseA) vào cối nghiền thủy tinh vô
trùng đựng sẵn mẫu sinh thiết tơi. Nghiền cho
đến khi mẫu sinh thiết tan hoàn toàn sau đó ủ
60
0
C x 1 giờ. Cho 15àl proteinase K (20mg/ml),
tiếp tục ủ 60
0
C từ 1 - 1,5 giờ. Thêm 640àl dung
dịch phenol bão hoà và lắc nhẹ 10'. Ly tâm
5000 vòng/ phút x 10'. Hút lấy nớc nổi chuyền
sang tube mới, cho 660àl phenol/ CHISAM
(1:1) lắc đều 5', ly tâm loại bỏ cặn. Cho 660àl
CHISAM (clorofom/ isoamyl alchohol: 24:1) lắc
đều 5', ly tâm và hút lấy phần nớc nổi. Thêm
40àl NaOAc, pH 5,2, cồn tuyệt đối gấp 2 lần
thể tích dung dịch thu đợc và lắc nhẹ nhàng.
Tủa DNA hình thành, ly tâm lấy tủa, rửa tủa
bằng cồn tuyệt đối và cồn 70
0
. Hoà tan DNA
trong TE hoặc nớc cất. Kiểm tra chất lợng

DNA bằng điện di trên thạch agarose 0,8% có
ethidium bromide. Đọc kết quả bằng đèn UV.

24
TCNCYH 25 (5) - 2003
Nồng độ và độ tinh khiết của DNA đợc đo
bằng quang phổ kế. Các mẫu DNA đều đạt độ
tinh khiết tiêu chuẩn (OD 260/280) lớn hơn 1,7.
2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction)
2.2.1. Xác định gen EBNA1 từ khối u
Cặp mồi sử dụng cho kỹ thuật khuyếch đại
1 đoạn gen EBNA1 từ mô sinh thiết là: mồi
xuôi, 5' - tgg gttt gga aag cat cgt ggt c - 3'
(109339nt - 109360nt) và mỗi ngợc, 5' - gtt
gtg ggc cgg gtc cag gg - 3' (109600nt -
109581nt). Thể tích của phản ứng là 25àl trong
đó 2,5àl mỗi mồi xuôi và ngợc nồng độ 2àl, 1
đơn vị Taq polymerase (Perkin - Elmer), 2àl
dNPTs nồng độ 2.5àM và 200ng DNA và
H
2
O. Trình tự các phản ứng gồm có biến tính
DNA tiền phản ứng là 95
0
C x 2', 35 chu kỳ
nhiệt là 95
0
C x 15'', 52
0

C30'', 72
0
C30'' thời gian
hoàn thành phản ứng là 5' ở 72
0
C. Sản phẩm
PCR có chiều dài 246bp. Điện di sản phẩm
PCR trong thạch agarose 2%. Đọc kết quả và
chụp ảnh bởi hệ thống GelDoc 2000.
2.2.3. Xác định gen EBNA1 từ máu ngoại vi
Để khuyếch đại gen EBNA1 từ máu ngoại
vi, chúng tôi phải dùng 2 lần phản ứng PCR
(PCR1 và PCR2).
PCR1: Trình tự nucleotid của cặp mồi thứ
nhất giống với cặp mồi dùng cho phản ứng
PCR đối với DNA từ khối u vòm họng. 25àl hỗn
hợp phản ứng chứa 2,5àl mỗi loại mồi xuôi và
ngợc nồng độ 2àl, 1 đơn vị AmpliTaq DNA
polymerase (Perkin Elmer), 2.0àl dNTPs
2.5mM và 200ng DNA. Biến tính DNA tiền
phản ứng ở 95
0
C x 2', 35 chu kỳ nhiệt là: 94
0
C
x 15'', 52
0
C x 30'' và 72
0
C x 30'', giai đoạn

hoàn thành việc kéo dài là 72
0
C x 5' . Kích
thớc của sản phẩm là 246bp.
PCR2: Kỹ thuật PCR lồng (nested - PCR)
với cặp mồi là: mồi xuôi 5' - tgg gtt gga aag cat
cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt) và mồi
ngợc: 5' - gcc att cca aag aga cg - 3'
(109580nt - 109561nt). Nhiệt độ gắn mồi tăng
lên 59
0
C và số chu kỳ nhiệt giảm xuống còn
27. Sản phẩm PCR có kích thớc là 146bp.
2.3. Kỹ thuật phân tích trình tự nucleotid
Các sản phẩm PCR (DNA từ mô sinh thiết)
và nested - PCR (DNA từ máu ngoại vi) là
nguyên liệu dùng để phân tích trình tự. Chuẩn
bị mẫu để phân tích trình tự bằng một phản ứng
PCR có một mồi xuôi, 5' - Thủ tớng gttt gga
aag cat cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt). Bộ
kit sử dụng là "BigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit". Kết quả đợc
phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
III. Kết quả
1. Đột biến thay thế nucleotid đầu
cacboxy của EBNA1 ở mô sinh thiết bệnh
nhân ung th vòm mũi họng và máu ngoại
vi
Phân tích trình tự 1 đoạn gen mã hoá cho
các acid amin nằm ở những vị trí có các acid

amin từ 487 đến 533, chúng tôi nhận thấy rằng
sự đột biến thay thế nucleotid dẫn đến thay đổi
acid amin xuất hiện ở các vị trí 487, 499, 502,
524 và 533 so với EBNA1 của chủng B95 - 8.
Các vị trí thay thế acid amin này giống với dới
nhóm V - val theo phân loại dới nhóm của
Bhatia 1996 và Sandvej 2000 [4,6]. Nhng
trong nghiên cứu của chúng tôi, vị trí các acid
amin là V - val - v1 và Va - val - v2, dới nhóm
của V - val (bảng 1).
Dựa vào acid amin số 487, chuỗi EBNA1
đợc xếp thành 2 loại: P (prototype) - ala (hoặc
thr) và V (viriant) - val (hoặc - leu). P - ala là
EBNA1 thuộc dòng B95 -8. P - ala - v1, v2, v3
là các dới nhóm của P -ala. V- val - v1 và V -
val - v2 là các dới nhóm của V - val. Các
nucleotide có đột biến thay thế đợc đánh dấu
bằng gạch chân. Các ô trống là các nucleotide
có trình tự giống với P -ala của B95 - 8.

25
TCNCYH 25 (5) - 2003
Bảng 1: Các dới nhóm EBNA1 trong nghiên cứu của chúng tôi so với EBNA1 của B95 - 8 và
các dới nhóm khác
471 475 476 487 492 499 500 502 520 524 525 528 533
P-ala CAA
Gln
AAC
Agn
CCG

Pro
GCT
Ala
AGT
Ser
GAC
Asp
GAA
Glu
ACT
Thr
CTA
Leu
ACT
Thr
GCC
Ala
ATT
Ile
CTT
Leu
P-ala-v1 GAA
Glu
ATT
Ile

P-ala-v2 GAA
Glu
GTT
val

P-ala-v3 GAA
Glu
GTT
Val
GTT
Val
P-thr CAG
Gln
ACT
Thr
TGT
Cys
GAT
Asp
CT
C
Leu
A
TT
Ile

P-thr-v CAG
Gln
ACT
Thr
TGT
Cys
GAG
Glu

CT
C
Leu
A
TT
Ile

V-leu GAA
Glu
AGC
Ser
CAG
Gln
CTT
Leu
TGT
Cys
GAG
Glu
GA
T
Asp
A
AT
Agn
CTC
Leu
A
TT
Ile

GGC
Gly

V-val GTT
Val
GAG
Glu
A
AT
Agn
CTC
Leu
A
TT
Ile
ATT
Ile
V-val-v1 GTT
Val
GAG
Glu
A
AT
Agn
CTC
Leu
A
TT
Ile
GTT

Val
ATT
Ile
V-val-v1 GTT
Val
GAG
Glu
A
AT
Agn
CTC
Leu
A
TT
Ile
CTT
Leu
ATT
Ile

2. Tỷ lệ các dới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân UTVMH Việt Nam, Trung Quốc và ngời
bình thờng
Bảng 2: Sự phân bổ các dới nhóm EBNA1 ở máu ngoại vi ngời bình thờng, máu và
khối u của các bệnh nhân ung th vòm Trung Quốc và Việt Nam
Số mẫu P - ala P - ala +
Va-val-v1
Va-val-v1 Va-val-v2 Ghi chú
T: 10 0 0 9 1
UTVMH Việt Nam
L: 10 0 0 9 1

Cặp mẫu
T: 15 0 0 15 0 UTVMH Quảng Đông 1

L: 15 2 1? 12 0
Ngời cho máu Việt Nam L: 5 0 0 5 0
T: Khối u; L : máu ngoại vi; cặp mẫu:
gồm sinh thiết và máu ngoại vi của cùng
một bệnh nhân.
Trong tổng số 10 cặp mẫu của bệnh
nhân UTVMH Việt Nam có 9 cặp mẫu có
dới nhóm là V - val - v1 và 1 cặp mẫu có V
- val - v2. Đối với các bệnh nhân UTVMH
của Trung Quốc dới nhóm V-val-v1 cũng
có mặt ở hầu hết các cặp mẫu và không
thấy một trờng hợp nào có dới nhóm V-
val-v2. Trong khi đó ở máu ngoại của một
số bệnh nhân UTVMH lại có P-ala hoặc nghi
ngờ có cả P-ala và V-val-v1. Sự có mặt của
cả 2 dới nhóm P-ala và V-val trong máu
ngoại vi cũng đã đợc thông báo [7]. Một
điều đáng chú ý là trong 5 mẫu DNA từ máu

26
TCNCYH 25 (5) - 2003
ngoại vi của ngời cho máu Việt Nam cũng
chỉ có một dới nhóm là V-val-vq
Kết quả này cũng phù hợp với nhận xét
của Sandvej 2000 khi nghiên cứu trên các
đối tợng bệnh nhân ung th vòm họng của
ngời Trung Quốc và chỉ đặc trng cho biến

thể EBNA1 ở Châu á, nơi có tỷ lệ mắc bệnh
ung th vòm họng cao nh Trung Quốc. Tuy
nhiên, việc nghiên cứu chức năng của đoạn
protein EBNA1 có đột biến thay thế acid
amin cũng cần đợc tiến hành để xem các
đột biến này có ảnh hởng đến chức năng
của nó hay không.
IV. Kết luận
Dới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân ung
th vòm họng và ngời bình thờng Việt
Nam chủ yếu là V-val-v1. Kết quả này cũng
tơng tự ở các mẫu nghiên cứu lấy từ bệnh
nhân ung th vòm họng ở Trung Quốc.
Tài liệu tham khảo
1. Frank, D. et al, (1995):
Postransplantation lymphoproliferative
disorders frequently contain type A and not
type B Epstein - Barr virus. Blood, 85 (5): p.
1396 - 403.
2. Zur Hausen H., et al., (1970), EBV
DNA in biopsies of Burkitt tumours and
anaplastic carcinomas of the nasopharynx.
Nature, 228 (276): p.1056 - 8.
3. Chang, Y.S., et al., (1990),
Detection of Epstein - Barr virus DNA
sequences in nasopharygeal carcinoma
cells by enzymatic DNA amplification. J Clin
Microbiol, 28 (11): p.2398 - 402.
4. Bhatia, K., et al. (1996), Variation in
the sequence of Epstein Barr virus nuclear

antigen 1 in normal peripheral blood
lymphocytes and in burkitt's lymphomas.
Oncogene, 13(1): p. 177 - 81
5. Bhatia, K. and I. Magrath, EBNA - 1
sequences iin endemic and sporadic
Burkitt's lymphoma. J. Virol, 1999, 73 (8):
p.7096 - 7
6. Sandvej K., X.G. Zhou and
S.Hamilton - Dutoit, EBNA - 1 sequence
variation in Danish and Chinese EBV -
associated tumours: evidence for
geographical polymorphism butnot for
tumour - specific subtype restriction. J.
Pathol, 2000, 191 (2): p.127 - 31.
Gutierrez, M.I., et al. (1997), Sequence
variations in EBNA - 1 may dictaterestriction
of tissue distribution of Epstein - Barr virus
in normal and tumour cells. J. Gen Virol, 78
(pt 7): p.1663 70.


Variation of EBNA1 in Vietnamese, chinese NPC and
healthy blood donors
EBNA1 (Epstein Barr virus nuclear antigen-1) is the only viral protein expressed consistently
in all virus-infected cells. Its sequence variations were defined based on amino acid signature at
codon 487. Those are prototype containing P-ala (identical to prototype B95-8 strain) and (P)-thr
and variant that has V-val, V-leu and V-pro.
We analyzed DNA sequence in C-terminus of EBNA1 from PCR products. DNA samples for
PCR were isolated from tumours and periferal blood of Vietnamese nasopharyngeal carcinoma and
from peripheral blood of healthy blood donors.

The results show that there are two EBNA1 sub-subtypes in Vietnamese NPC (nasopharyngeal
carcinoma), V-val-v1 (9/10 DNA matches samples and 5 DNA samples from healthy blood donors
and V-val-v2 (1/10 matched samples). Among 15 Chinese matched samples, 15/15 samples from
tumors contained V-val-1, only 2/15 (blood samples) contained P-ala and 1/15 (blood sample) may
be mixed P-ala and V-val-1.


27