Bước đầu áp dụng phương pháp PCR-SSO để xác định kháng nguyên bạch cầu ở người (HLA) tại Bệnh viện Chợ Rẫy

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR-SSO ĐỂ XÁC ĐỊNH
KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU Ở NGƯỜI (HLA) TẠI BỆNH VIỆN CHỢ RẪY
Nguyễn Trường Sơn*, Trần Văn Bảo**, Phạm Thị Hồng Ngọc**, Huỳnh thị Thanh Hà**,
Đỗ Thị Ngọc Thảo**, Trần Thị Mỹ Duyên**, Phạm Lê Nhật Minh**

TÓM TẮT
Mở đầu: Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định HLA, nhưng phương pháp dựa trên sinh học phân tử
là hiện đại, chính xác.
Phương pháp: Từ 9/2010 Trung tâm truyền máu Bệnh viện Chợ Rẫy triển khai kỹ thuật HLA (Human
Leucocyte Antigen) bằng phương pháp PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction – Sequence-specific
Oligonucleotide Probes).
Kết quả: Kết quả khảo sát trên 24 người, xác định có 49 kiểu hình HLA-A, 38 kiểu hình HLA-B, 45 kiểu
hình HLA –DRB1, 45 kiểu hình HLA –DQA1 và 47 kiểu hình HLA –DQB1. Chiếm tỷ lệ cao trong số các kiểu
hình HLA lần lượt như sau: HLA-A*11 với 27,27 %, HLA-A*2 với 22,72 %, HLA-A*24 với 11,36 %, HLAB*07, HLA-B*15 với 18,43%, HLA-DRB1*12 với 28,89%, HLA-DRB1*15 với 17,78%, HLA-DRB1*04 và
HLA-DRB1*14 cùng 13,34%, HLA-DQA1*01 với 46,66%, HLA-DQA1*06 với 26,67%, HLA-DQB1*03 với
51,06% và HLA-DQB1*05 với 38,30%.
Kết luận: Việc triển khai kỹ thuật xác định HLA bằng phương pháp SSO có nhiều tiện ích trong công tác
chẩn đoán trước ghép tạng, chọn lựa người cho tổ chức, đặc biệt đây là phương pháp nhanh chóng, chính xác và
đặc hiệu cho các kiểu hình HLA.

ABSTRACT
INITIAL APPLYING PCR-SSP METHOD TO IDENTIFY HUMAN LEUCOCYTE ANTIGEN (HLA) IN
CHỢ RẪY HOSPITAL
Nguyen Truong Son, Tran Van Bao, Pham Thi Hong Ngoc, Huynh Thi Thanh Ha,
Do Thi Ngoc Thao, Tran Thi My Duyen, Pham Le Nhat Minh
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 378 - 381
Background & Methods: Since September 2010, in Chợ rẫy Blood Tranfusion Center, we have performed

HLA (Human Leucocyte Antigen) phenotyping techniques by PCR-SSO (Polymerase Chain Reaction –
Sequence- specific Oligonucleotide Probes).
Results: Collected are that 49 phenotyping of HLA-A, 38 phenotyping of HLA-B, 45 phenotyping of HLA –
DRB1, 45 phenotyping of HLA –DQA1 and 47 phenotyping of HLA –DQB1 among 24 persons..The most
popular phenotype of HLA-A*11 is 27.27 %, HLA-A*2 is 22.72 %, HLA-A*24 is11.36 %, HLA-B*07, HLAB*15 are 18.43%, HLA-DRB1*12 is 28.89%, HLA-DRB1*15 is 17.78%, HLA-DRB1*04 and HLA-DRB1*14
are 13.34%, HLA-DQA1*01 is 46.66%, HLA-DQA1*06 is 26.67%, HLA-DQB1*03 is 51.06% and HLADQB1*05 are 38.30%.
Conclusion: The method helps us alots in diagnosis before organic transplantationt, choose donor for
transplantation, especially it is fastest, accurate and specific for HLA phenotyping.
* BV. Chợ Rẫy, ** Trung Tâm truyền máu BV Chợ Rẫy
Tác giả liên lạc: DS. Trần Văn Bảo
ĐT: 0903978845 Email:

378

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2011


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

Nghiên cứu Y học

ĐẶT VẤN ĐỀ

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Năm 1936 Peter Gorer khi nghiên cứu về thải
loại ghép trên các dòng chuột thuần chủng đã đi
đến sự kết luận sự thải ghép là do đáp ứng miễn
dịch đối với sự khác biệt về kháng nguyên tổ chức.
Sau đó, Jaen Dausset khi nghiên cứu về nhóm bạch

cầu ở người đã xác định được kháng nguyên bạch
cầu có liên quan đến việc thải loại ghép và đặt tên
là nhóm tổ chức mà ngày nay thống nhất là HLA
(Human Leucocyte Antigen)(2,3).

Đối tượng

Do tính đa dạng của phân tử nhóm phù hợp
mô nên việc định nhóm không phải đơn giản
như định các nhóm máu.. Ngày nay, nhiều kỹ
thuật định nhóm HLA đã được áp dụng. Với kỹ
thuật
vi
độc
tế
bào
lympho
(microlymphotoxicity), người ta dùng các kháng
thể đơn đặc hiệu với nhóm HLA và cho thyêm
vào đó bổ thể. Các tế bào có mang kháng
nguyên HLA tương ứng với kháng thể đặc hiệu
và với sự hiện diện của bổ thể, tế bào sẽ bị gây
độc và chết. Từ đó, ta có thể suy ra tế bào có
mang nhóm kháng nguyên nào. Các kỹ thuật
huyết thanh chỉ dùng tốt cho định nhóm HLA
lớp I và dưới nhóm DR của lớp II, còn khó khăn
hơn với DP và DQ(3,5).
Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử ngày
càng được áp dụng rộng rãi. Phân tích trình tự
axit nhân cuả các kỹ thuật phản ứng chuỗi đặc

hiệu kháng nguyên phù hợp mô HLA. Kỹ
thuật thông thường hiện nay là khuếch đại
vùng đặc hiệu cho phân tử HLA với kỹ thuật
phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Sản phẩm
này sau khi được lai ghép với các cặp mồi đặc
hiệu sẽ cho các biến thể allele. Các kỹ thuật
này cho phép phân ra nhiều biến thể hơn là kỹ
thuật huyết thanh(4).

Tất cả người cho cơ quan (thận, tủy…) và
người bệnh nhận cơ quan đến xét nghiệm tại
Bệnh viện Chợ Rẫy.

Phương pháp nghiên cứu
Kỹ thuật PCR-SSO, với kỹ thuật ly trích
DNA bằng QIAamp DNA Mini Kit và kỹ thuật
PCR với Micro SSO HLA ClassI và II ABDR,
DQ DNA Typing Tray của công ty One
Lambda (Mỹ)(4).
Trong kỹ thuật sinh học phân tử này, ta
khuếch đại vùng đặc hiệu cho phân tử HLA với
kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Sản
phẩm này sau khi được lai ghép với các cặp mồi
đặc hiệu sẽ giúp phát hiện kiểu gen HLA.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát trên 24 người, xác định có 49 kiểu
hình HLA-A, 38 kiểu hình HLA-B, 45 kiểu hình
HLA –DRB1, 45 kiểu hình HLA –DQA1 và 47
kiểu hình HLA –DQB1 (Bảng 1-5):

3.1 Kết quả HLA-A:

Chiếm tỷ lệ cao trong số các kiểu hình HLAA lần lượt như sau: HLA-A*11 với 27,27 %,
HLA-A*2 với 22,72 %, HLA-A*24 với 11,36 %
(Bảng 1).
Kết quả này tương tự với kết quả của tác giả
Phan Nguyễn Thanh Vân năm 2008 với phương
pháp PCR-SSP (Polymerase Chain Reaction
Sequence Specific Primers).
Bảng 1. Số lượng và tỷ lệ HLA - A

Từ tháng 9/2010 đến nay, Bệnh viện Chợ
Rẫy triển khai kỹ thuật xác định HLA bằng
phương pháp PCR-SSO (Polymerase Chain
Reaction – Sequence- specific Oligonucleotide
Probes).

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2011

Stt
1
2
3
4
5
6
7
8

HLA - A

HLA-A*01
HLA-A*02
HLA-A*11
HLA-A*24
HLA-A*29
HLA-A*30
HLA-A*31
HLA-A*33
Tổng cộng

Số lượng
3
10
12
5
4
2
4
4
44

Tỷ lệ %
6,81
22,72
27,27
11,36
9,1
4,54
9,1
9,1

100

379


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011

Nghiên cứu Y học

Với bộ kit này, chúng tôi chưa thể phân biệt
được một số trường hợp như HLA-A*0203 hay
HLA-A*3406, HLA-A*3108 vì không sử dụng
cặp mồi chuyên biệt cho những allen này.

Kết quả HLA-B
Chiếm tỷ lệ cao trong số các kiểu hình HLAB là HLA-B*07, HLA-B*15 với 18,43% và HLAB*38 và HLA-B*51 với 10,53 % (Bảng 2)
Kết quả này tương tự với kết quả của tác giả
Phan Nguyễn Thanh Vân năm 2008 ở kiểu hình
HLA-B*15, nhưng có sự khác biệt ở các kiểu
hình HLA-B*07, HLA-B*38 và HLA-B*51(1). Các
kiểu hình không có sự khác biệt vượt trội có thể
do số lượng mẫu chưa đủ lớn.
Bảng 2. Số lượng và tỷ lệ HLA - B
Stt
1
2
3
4
5
6

7
8
9
10
11
12

HLA -B
HLA-B*07
HLA-B*13
HLA-B*15
HLA-B*35
HLA-B*38
HLA-B*40
HLA-B*46
HLA-B*51
HLA-B*54
HLA-B*55
HLA-B*56
HLA-B*57
Tổng cộng

Số lượng
7
3
7
2
4
3
2

4
1
1
2
2
38

Bảng 3. Số lượng và tỷ lệ HLA - DR
Stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

HLA-DRB1*
HLA-DRB1*03
HLA-DRB1*04
HLA-DRB1*07
HLA-DRB1*08
HLA-DRB1*09
HLA-DRB1*10
HLA-DRB1*11

HLA-DRB1*12
HLA-DRB1*13
HLA-DRB1*14
HLA-DRB1*15
HLA-DRB1*16
Tổng cộng

Số lượng
2
6
2
1
1
1
3
13
1
6
8
1
45

Tỷ lệ %
4,44
13,34
4,44
2,22
2,22
2,22
6,67

28,89
2,22
13,34
17,78
2,22
100

Kết quả HLA- DQ
Chiếm tỷ lệ cao trong số các kiểu hình HLADQA1 lần lượt là HLA-DQA1*01 với 46,66 % và
HLA-DQA1*06 với 26,67 % (Bảng 4).

Tỷ lệ %
18,43
7,89
18,43
5,26
10,53
7,89
5,26
10,53
2,63
2,63
5,26
5,26
100

Bảng 4 Số lượng và tỷ lệ HLA - DQ A1
Stt

HLA-DQ

Số lượng

Tỷ lệ %

1

HLA-DQA1*01

21

46,66

2

HLA-DQA1*02

3

6,67

3

HLA-DQA1*03

3

6,67

4

HLA-DQA1*04

1

2,22

5

HLA-DQA1*05

5

11,11

6

HLA-DQA1*06

12

26,67

45

100

Tổng cộng

Tương tự như HLA – A, chúng tôi chưa xác

định được một số trường hợp như HLA –
B*5102 vì không sử dụng cặp mồi chuyên biệt
cho allen này, cũng như nhiều mẫu chưa xác
định được.

Kết quả HLA- DR

Đối với HLA-DQB1 là HLA-DQB1*03 với
51,06% và HLA-DQB1*05 với 38,30 %. (Bảng 5)
Bảng 5. Số lượng và tỷ lệ HLA - DQ B1
Stt
1
2
3
4

HLA-DQ
HLA-DQB1*02
HLA-DQB1*03
HLA-DQB1*05
HLA-DQB1*06
Tổng cộng

Số lượng
4
24
18
1
47

Tỷ lệ %
8,51
51,06
38,30
2,13
100

Chiếm tỷ lệ cao trong số các kiểu hình HLADRB1* lần lượt là HLA-DRB1*12 với 28,89%,
HLA-DRB1*15 với 17,78%, HLA-DRB1*04 và
HLA-DRB1*14 cùng 13,34%. Các kết quả này có
sự khác biệt với tác giả Phan Nguyễn Thanh
Vân với phương pháp PCR-SSP(1).

Ưu điểm của kỹ thuật này là phát hiện được
cả HLA-DQA1 và HLA-DQB1 mà kỹ thuật vi
độc tế bào không phát hiện được(1).

Đối với các kiểu hình HLA-DRB3, HLADRB4, HLA-DRB5 BỘ Kit này chưa đủ khả năng
phân biệt các subtype..

Phân tử nhóm phù hợp tổ chức chính, ở
người là nhóm HLA, là sản phẩm của một
phức hợp gen gần giống nhau và rất đa dạng
do chúng có rất nhiều allen. Bởi vậy tính đặc

380

KẾT LUẬN

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
hiệu kháng nguyên của các phân tử này giữa
các thể là rất khác nhau nếu không có quan hệ
huyết thống.
Việc triển khai kỹ thuật xác định HLA bằng
phương pháp SSO có nhiều tiện ích trong công
tác chẩn đoán trước ghép, chọn lựa người cho tổ
chức, đặc biệt đây là phương pháp nhanh
chóng, chính xác, đặc hiệu cho các kiểu hình
HLA. Trong hướng phát triển sắp tới sẽ tiến
hành thực hiện bằng các cặp mồi chuyên biệt

Nghiên cứu Y học

cho từng kiểu hình HLA thiếu, nhằm đem lại
chẩn đoán HLA chính xác và toàn diện nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.
3.

Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Chợ Rẫy 2011

Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2008), “Kỹ thuật xác
định HLA bằng phương pháp PCR-SSP tại Bệnh viện Truyền
máu- Huyết học”,Y học Việt nam (344), tr815-820.

Trần văn Bé (1999), Huyết học lâm sàng, NXB Y học – T.P Hồ
Chí Minh:.
Vũ Triệu An, Nguyễn Ngọc Lanh, Phạm Mạnh Hùng, Phan
thị Phi Phi (1997), Miễn dịch học, Nxb Y học-Hà nội.tr.306-320.2

381