Biệt hóa tế bào gốc trung mô tuỷ xương thỏ thành dạng tạo cốt bào trong môi trường Dexamethasone và Ascorbic

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TUỶ XƢƠNG THỎ
THÀNH DẠNG TẠO CỐT BÀO TRONG MÔI TRƢỜNG
DEXAMETHASONE VÀ ASCORBIC
Lê Thị Hồng Nhung*; Ngô Duy Thìn*; Nguyễn Khang Sơn*
TÓM TẮT
15 mẫu tế bào đơn nhân tủy xương thỏ nuôi cấy tăng sinh 14 ngày. Sau khi định danh bằng
kỹ thuật hoá mô miễn dịch với các marker CD44, CD90, CD34, CD14 xác định là tế bào gốc
trung mô (TBGTM), được đưa vào môi trường cảm ứng tạo xương có dexamethasone 1 µM và
ascorbic 50 µg/ml trong thời gian 3 tuần. Kết quả: tất cả các mẫu tế bào nhuộm hóa mô đều có
hiện tượng tạo canxi trong chất nền (dương tính khi nhuộm alirazin red). Quan sát các mẫu
dưới kính hiển vi điện tử quét thấy xuất hiện tinh thể khoáng. Mẫu tế bào nhuộm hóa mô miễn
dịch dương tính với marker osteocalcin. Kết luận: đ biệt hoá thành công TBGTM tủy xương
thỏ thành tế bào dạng tạo cốt bào trong môi trường có dexamethasone và ascorbic.
* Từ khóa: Tế bào trung mô; Tạo cốt bào; Biệt hóa; Dexamethasone; Ascorbic.

Diffrentiation of Bone Marrow Mensenchymal Stem Cell into Osteoblast
in Dexamethasone and Ascorbic Culture
Summary
15 samples rabbit bone marrow mononuclear after culture for 14 days. Those were isolated
by flow cytometry and immunocytochemistry staining with marker CD44, CD90, CD14, CD34.
These analyses indicated that culture cells were MSCs. To induce osteoblast differentiation
of the MSCs, the cultures were maintained in osteogenic media supplement with 1 µM
dexamethasone, 50 µg/mL ascorbic acid for up to three weeks. Results: All samples after
differentiation demonstrated that therre were actual calcium deposits in matrix by alizarin red
staining. Under SEM appearance white crystals of MSC differentiation into osteogenic line. The
cells were immunocytochemistry stained positive for osteocalcin. Conclusions: The bone marrow
MSC tendency differentiation into osteoblast in dexamethasone and ascorbic acid.
* Keywords: Mesenchymal stem cell;; Osteoblast; Differentiation; Dexamethasone; Ascorbic.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tạo cốt bào là một trong 4 tế bào của
mô xương có vai trò tạo xương mới trong
giai đoạn phát triển của cơ thể hoặc khi
mô xương bị tổn thương. Trong cơ thể,
các tế bào gốc trước khi trở thành tạo cốt

bào (osteoblast), chúng phải trải qua giai
đoạn biệt hóa để tạo thành tiền tạo cốt
bào (pre-osteoblast). Ngày nay với công
nghệ, giai đoạn này có thể thực hiện trong
điều kiện in vitro nhằm tạo ra dòng tế bào
có khả năng ứng dụng trên lâm sàng để

* Trường Đại học Y Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Hồng Nhung ()
Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017

173


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
điều trị các bệnh lý xương khớp, đặc biệt
là các bệnh không thể điều trị bằng phương
pháp thông thường [1].

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Hình dạng tế bào sau biệt hóa.

Kỹ thuật và môi trường biệt hóa TBGTM
tủy xương thành tạo cốt bào đ được
nhiều tác giả nghiên cứu. Trong phạm vi
bài này, chúng tôi xin giới thiệu kết quả biệt
hóa TBGTM tủy xương thỏ trong môi trường
có dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic, đây là
những chất kích thích cảm ứng tạo xương.
Mục tiêu của nghiên cứu: Nuôi cấy,
biệt hóa thành công TBGTM tủy xương
thỏ thành tạo cốt bào trong môi trường có
dexamethasone và ascorbic.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
15 mẫu tế bào trung mô tủy xương thỏ.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Các tế bào đơn nhân được phân lập từ
tủy xương thỏ sau khi nuôi cấy tăng sinh
14 ngày, định danh bằng kỹ thuật hóa mô
miễn dịch để khẳng định chắc chắn chúng
là TBGTM.
Đưa vào môi trường biệt hóa cảm ứng
tạo xương để biệt hóa thành tạo cốt bào,
gồm: 89% DMEM, 10% FBS, 1% kháng sinh,
1 µM dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic,
100 mM β - glycerolphosphatase. Thời gian
biệt hóa 3 tuần, thay môi trường 3 ngày/lần.
Định danh sau biệt hóa bằng kỹ thuật
alizarin để đánh giá khả năng lắng đọng
canxi chất nền của tế bào. Đánh giá sự hình

thành tinh thể khoáng bằng kỹ thuật hiển
vi điện tử quét. Xác định marker osteocalcin
của tế bào sau biệt hóa bằng phương pháp
nhuộm hóa mô miễn dịch. Mỗi phương
pháp lấy ngẫu nhiên 5 mẫu trong 15 mẫu
đ biệt hóa.
174

Hình 1: TBGTM sau biệt hóa theo hướng
tạo cốt bào 14 ngày (x500).
Quan sát tất cả các mẫu chúng tôi nhận
thấy có sự biến đổi rõ rệt về hình dạng tế
bào theo thời gian. Càng về sau, các tế
bào có xu hướng phình to đoạn giữa giống
hình hạt đậu. Đây có thể là hình ảnh đặc
trưng của tế bào tạo xương.
2. Kết quả định danh tế bào sau biệt
hóa.
* Định danh bằng kỹ thuật nhuộm
alizarin red:

Hình 2: Tế bào sau biệt hóa 21 ngày nhuộm
alizarin red (x200).


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Trên tất cả các mẫu tế bào khi nhuộm với alizarin red đều cho kết quả đặc hiệu:
tế bào và chất nền bắt màu đỏ cam, đây là phức hợp của thuốc nhuộm với ion canxi
hiện diện trong tế bào hay chất nền ngoại bào, chứng tỏ tế bào được biệt hóa đ chuyển
sang dạng tế bào tạo xương với lắng tụ canxi trong tế bào và chất nền ngoại bào.

* Định danh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch:

Hình 3: Các tế bào sau biệt hóa 15 ngày nhuộm hóa mô miễn dịch với
marker osteocalcin (x200).
Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin cho thấy tất cả các mẫu
đều dương tính với osteocalcin. Osteocalcin là protein được tổng hợp nhiều trong tế
bào tạo xương và được xem là marker của tế bào tạo xương.
* Định danh bằng quan sát hình thành tinh thể khoáng dưới kính hiển vi điện từ quét:

Hình 4: Tế bào gốc sau biệt hóa 30 ngày dưới hiển vi điện tử quét.
(Các tinh thể muối khoáng lắng đọng trên bề mặt và xung quanh tế bào)
175


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Sau 3 tuần biệt hóa, trên tất cả các
mẫu tế bào nuôi cấy quan sát dưới kính
hiển vi điện tử quét, đều thấy xuất hiện
tinh thể khoáng rõ rệt. Lắng đọng tinh thể
khoáng trong mô nền quanh tế bào đang
biệt hoá có xu hướng tăng dần về số
lượng. Các tinh thể khoáng này có dạng
hình kim, hoặc hình bông tuyết, tập hợp
thành đám, lớn dần theo thời gian. Nghiên
cứu của chúng tôi cũng thấy, hình ảnh
lắng đọng tinh thể khoáng không xuất
hiện trên các mẫu chứng là tế bào trung
mô được nuôi cấy trong môi trường thông
thường, không có yếu tố gây biệt hoá.

của tạo cốt bào. Osteocalcin là marker
xương, đặc biệt xuất hiện muộn tăng cao
sau biệt hóa 28 ngày [3].

Chúng tôi cho rằng đây là minh chứng
rõ nét nhất cho thấy tế bào trung mô trong
môi trường nuôi cấy, đặc biệt đ biệt hoá
thành tạo cốt bào. Chính những tạo cốt
bào này đ sinh ra mô nền tiền cốt. Mô nền
tiền cốt này với đặc tính đặc biệt, đ tạo
lắng đọng muối khoáng (chủ yếu là canxi
và phospho), để tạo ra chất căn bản xương
sau đó.

hình, hình thái vẫn giống nguyên bào sợi.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng
phù hợp với Nadri S (2007). TBGTM sau
khi tách chiết từ tủy xương biệt hóa thành
tế bào tạo xương sau 3 tuần với biểu hiện
hình thành nốt khoáng hóa bắt màu đỏ
khi nhuộm alazarin red và phân tích marker
biểu hiện xương bằng kỹ thuật RT-PCR
cho thấy biểu hiện dương tích osteocalcin,
osteopontin [2].
Tsai M.T (2012) sau nuôi cấy biệt hóa
TBGTM thành tạo cốt bào cũng định danh
bằng các marker Runx2, ALP, osteocalcin.
Runx2 biểu hiện tăng ở ngày thứ 3 sau
biệt hóa, ALP là marker biểu hiện sớm

176

Quiroz F.G (2008) nghiên cứu biệt hóa
hMSC thành tạo cốt bào trong môi trường
chuyên biệt tạo xương, đánh giá sự tạo
xương bằng khoáng hóa trong chất nền
và marker biểu hiện ở tạo cốt bào tại các
thời điểm 14 và 20 ngày và so sánh với
nhóm chứng. Sau 2 ngày biệt hóa, hình
thái tế bào đ thay đổi, sau 5 ngày biệt
hóa, tế bào có hình đa diện, nhóm tế bào
ở nhóm chứng không có thay đổi kiểu
Sau 14 ngày biệt hóa, khoáng hóa trong
chất nền chưa r , mặc dù hình thái tế bào
đ

thay đổi, sau 20 ngày thấy có lắng

đọng canxi hình thành trong chất nền khá
điển hình. Tế bào MSC không nuôi cấy
trong môi trường biệt hóa (nhóm chứng),
hình thái tế bào không có thay đổi, không
có khoáng hóa. Mức độ biểu hiện gen
collagen týp I (col1), osteonectin (ON),
bone sialoprotein (BSP) so với nhóm chứng
thấy mức độ biểu hiện gen col1 và ON
không có sự khác biệt ở thời điểm 14 và
20 ngày. Biểu hiện BSP có sự khác biệt ở
thời điểm 14 và 20 ngày sau biệt hóa.
Tiềm năng biệt hóa xương của MSC

được xác định bằng khoáng hóa trong
chất nền, là điều kiện duy trì trong quá
trình biệt hóa xương. Quan sát sự khoáng
hóa sau 20 ngày biệt hóa từ MSC có
kiểu hình tương tự tế bào tiền thân tạo
xương [4].


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Nhiều nghiên cứu đ

công bố về vai

trò của tế bào gốc đối với sự hồi phục
g y xương không tự hàn gắn. Vì vậy, việc
nghiên cứu biệt hóa MSC thành tế bào
gốc mô xương được quan tâm nhiều. Khả
năng biệt hóa MSC thành dạng tạo cốt
bào gợi mở ứng dụng liệu pháp tế bào gốc
trong tái tạo mô xương. Hướng nghiên
cứu có ý nghĩa quan trọng giúp cung cấp
các bằng chứng khoa học, vai trò định
hướng dòng trong điều trị tái tạo xương.
Dexamethasone là một glucocorticoid
steroid, có tác dụng kích thích biệt hóa
thành xương của MSC, phụ thuộc vào
liều của nó, liều cao thì kích thích tạo mỡ,
liều thấp thì kích thích tạo xương. Liều
dùng trong nghiên cứu này phù hợp cho
biệt hóa tạo xương. Các yếu tố khác như

ascorbic là yếu tố có tác dụng tham gia
hình thành xương như biển đổi tiền
collagen thành collagen, glycerolphosphatase
có vai trò thúc đẩy hình thành chất nền
khoáng hóa. Chính vì vậy, sau một thời
gian tiếp xúc với môi trường biệt hóa, các
tế bào MSC thay đổi hình thái giống tạo
cốt bào.
Hợp dòng và biệt hóa MSC tạo dòng
xương được điều hòa bởi nhiều yếu tố.
MSC biệt hóa tạo tiền tạo cốt bào. Tiền tạo
cốt bào có hình elip, nhân nằm dọc theo
tế bào và giai đoạn đầu của biệt hóa
tế bào vẫn có tiềm năng tăng sinh. Chúng
biểu hiện Runx2, DLx5, MSx2 và một vài
marker của tạo cốt bào như ALP, collagen
týp I và osteopontin (OPN), nhưng biểu
hiện các marker yếu hơn ở tạo cốt bào

trưởng thành. ALP là một trong những
protein biểu hiện sớm và điều hòa khoáng
hóa.
β-catenin, Runx2 và Osx biệt hóa
thành tiền tạo cốt bào đến tạo cốt bào
trưởng thành. Những tế bào này phẳng
có hình con suốt. Chúng biểu hiện protein
chất nền xương, BSP và OPN.
Giai đoạn sau, Runx2 bị ức chế khi tạo
cốt bào trưởng thành. Osx có ở giai đoạn
cuối của tạo cốt bào trưởng thành và cảm

ứng biểu hiện osteocalcin. Khi tế bào
hoàn tất quá trình biệt hóa có dạng hình
khối và sản phẩm khoáng hóa vào chất
nền vô cơ. Trong bào tương có bộ Golgi
và lưới nội bào có hạt rất phát triển ở tạo
cốt bào, kết quả là tăng các sản phẩm
protein. Biểu hiện của OPN là giảm ở tạo
cốt bào trưởng thành, trong khi biểu hiện
các protein như P2X5, alkaline phosphatase,
collagen týp I và osteocalcin ngày càng
tăng [5].
KẾT LUẬN
Sau khi được biệt hóa 3 tuần trong môi
trường có các chất cảm ứng tạo xương
gồm dexamethasone và ascorbic, TBGTM
tủy xương thỏ đ có dấu hiệu đặc trưng
của tạo cốt bào.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài cấp
Bộ Y tế: “Nghiên cứu quy trình nuôi cấy
tế bào gốc mô xương và khả năng ứng
dụng trong ghép tự thân trên động vật
thực nghiệm”. Nhóm nghiên cứu xin gửi
lời cảm ơn tới Bộ Y tế đ tài trợ cho
nghiên cứu.
177


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Kim S.J, Jang J.D, Lee S.K. Treatment
of long tubular bone defect of rabbit using
autologous cultured osteoblasts mixed with
fibrin. Cytotechnology. 2007, 54, pp.115-120.
2. Nadri S, Soleimani M, Hosseni R.H et al.
An efficient method for isolation of murine
bone marrow mesenchymal stem cells. Int J
Dev Biol. 2007, 51 (8), pp.723-729.
3. Tsai M.T, Lin D.J, Huang S et al.
Osteogenic differentiation is synergistically
influenced by osteoinductive treatment and

178

direct cell-cell contact between murine
osteoblasts and mesenchymal stem cells. Int
Orthop. 2012, 36 (1), pp.199-205.
4. Quiroz F.G, Olga M, Estefan P et al.
Isolation of human bone marrow mesenchymal
stem cells and evaluation of their osteogenic
potential. Revista Ingenierisa Biomesdica. 2008,
pp.48-55
5. Zhang Y, Khan D, Delling J et al.
Mechanisms underlying the osteo- and adipodifferentiation of human mesenchymal stem
cells. The Scientific World Journal. 2012.
doi:10.1100/2012/793823.