Nghiên cứu định lượng curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ
PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương*
Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương**
TÓM TẮT
Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và
piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm
và tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút. Giới hạn
định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các chất có
mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Phương pháp có độ chính xác cao,
độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100%. Phương pháp này được sử
dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin.
* Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng.

SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND
PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC
SUMMARY
A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements
was validated. Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase,
Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin
and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes. The quantitation limits of curcumin
and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml. The calibration curve of each analyte had a correlation
coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were
93 - 100% for both curcumin and piperine.
* Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ
vàng (Curcuma longa L.) [1]. Curcumin có

tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự
phát triển của khối u, tăng khả năng miễn
dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một

số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn,
chống viêm… Curcumin rất kém tan trong
nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt
2 - 3%. Các nghiên cứu cho thấy: piperin
làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên

* Học viện Quân y
** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn ()
Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014
Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014

7


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

20 lần [2, 3]. Hiện nay, trên thị trường Việt
Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp
curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1)
nhưng vẫn chưa có phương pháp định
lượng đồng thời 2 chất trên. Vì vậy, chúng
tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng
quy trình định lượng đồng thời curcumin
và piperin bằng phương pháp HPLC.
NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên
cứu.
* Hóa chất, nguyên liệu:
- Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%,
Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin
chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich).
- Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và
piperin.
- Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn
HPLC (Merck).
- Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4,
H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích.
* Thiết bị và dụng cụ phân tích:
- Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D,
4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có
buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc
ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).
- Cân phân tích Sartorius độ chính xác
± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH,
các dụng cụ thủy tinh, bình định mức,
pipet có độ chính xác phù hợp.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Khảo sát quy trình định lượng.
+ Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu
[5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý
mẫu như sau:

8

Cân chính xác lượng bột tương đương
với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng
40 ml MeOH, lắc đều. Chiết siêu âm trong
20 phút. Để nguội, chuyển toàn bộ dịch
chiết vào bình định mức 50 ml. Thêm
MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc lấy
dịch lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở
nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong
10 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45 µl
trước khi phân tích bằng HPLC.
+ Điều kiện sắc ký [5, 6]:
Cố định các điều kiện: cột Gemini C18
(250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA;
thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng
0,8 ml/phút. Khảo sát pha động với hệ dung
môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN.
- Thẩm định quy trình định lượng.
Thẩm định quy trình định lượng theo
hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ
tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc
ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng
độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn
định lượng, độ chính xác, độ đúng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Khảo sát quy trình định lƣợng.
Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo
sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ.
Phân tích kết quả và lựa chọn được điều

kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời
curcumin và piperin như sau: cột sắc ký:
cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),
detector PDA, ghi phổ ở 340 nm. Pha
động: hỗn hợp dung môi acetonitril và
dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (điều chỉnh
đến pH = 3,5 bằng axít phosphoric) tỷ lệ
60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể
tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích:
10 phút.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

2. Thẩm định quy trình định lƣợng.
- Tính tương thích hệ thống sắc ký:
Tiến hành sắc ký 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất curcumin và piperin
đều có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn. Kết quả về thời gian lưu và diện
tích pic được trình bày trong bảng 1.
Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
STT

tR (phút)

Spic(µV.s)

tR (phút)

Spic(µV.s)

1

8,155

523508

8,931

1374756

2

8,156

526881

8.973

1375616

3

8,149

534524

8,948

1372662

4

8,154

523406

8,961

1378233

5

8,144

521094

8,950

1375421

6

8,143

520245

8,950

1375634

X

8,150

524943

8,950

1375387

RSD (%)

0,07

0,99

0,15

0,13

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của cả 2 chất đều < 2%,
chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích 2 chất
trên trong các mẫu.
- Độ chọn lọc - đặc hiệu:
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của curcumin, piperin đều có nồng độ 10 µg/ml,
mẫu trắng và mẫu thử.

(a)

PI

CUR

(b)

(c)
CUR
PI

Hình 1: Sắc ký đồ của curcumin và
piperin trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c).

9


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của curcumin và
piperin không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong
mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ
đặc hiệu cao.
- Khoảng nồng độ tuyến tính:
Pha một dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin
có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.
Bảng 2: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của curcumin
và piperin.
(µg/ml)

Diện tích pic (μV.s)

610060

3120758

6203550

Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88
Piperin.

9380402

12407214

R² = 0,9999

Nồng độ (µg/ml)

0,52

1,04

2,08

5,2

10,4

Diện tích pic (μV.s)

29006

52082

96523

219847

452053

Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994

Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của curcumin.

Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của piperin.
Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ piperin
và curcumin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:
Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng của curcumin và piperin. Tiến hành pha thử 4 - 5
nồng độ quanh điểm dự kiến. Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của curcumin là
0,01 µg/ml và piperin là 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của curcumin là 0,04 µg/ml
và piperin là 0,08 µg/ml.

10


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

- Độ chính xác:
Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB và nghiền thành bột mịn.
Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại

6 lần). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, kết quả được thể hiện trong bảng 3.
Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC.

(mg)

DiÖn tÝch pic
(μV.s)

Hµm l-îng t×m thÊy
(mg/viên)

DiÖn tÝch pic (μV.s)

Hµm l-îng t×m thÊy
(mg/viên)

1

125,6

5205871

171,86

23014

1,34

2

124,8

5058579

168,94

22635

1,31

3

125,6

5247484

175,25

22887

1,33

4

124,9

4996609

166,87

22761

1,32

5

125,1

5064267

169,13

221295

1,27

X

169,89

RSD (%)

1,85

1,31
1,89

Độ lệch chuẩn tương đối đều < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt,
đáp ứng yêu cầu phân tích.
- Độ đúng:

Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, và nghiền thành bột mịn.
Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với 6 lần cân
khác nhau. Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, và 10 mg
chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký.
Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp HPLC.
C h Ê t

Curcumin

pepirin

STT

l - î n g

1

10

2
3
4

mg)

L - î n g

(mg)

T û

9,58

95,8

10,1

9,41

93,2

10,2

10,12

99,2

10

9,67

96,7

5

9,9

9,42

95,2

6

10,3

10,12

98,3

1

0,1

0,097

97

2

0,1

0,095

95

3

0,1

0,093

93

4

0,1

0,094

94

5

0,1

0,097

97

6

0,1

0,095

95

(%)

X = 96,41

SD = 2,1
RSD = 2,2%

X = 95
SD = 1,6
RSD = 1,7%

Tỷ lệ thu hồi của curcumin và piperin từ 93 - 99% nằm trong giới hạn cho phép
(92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao.

11


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014

KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định
được quy trình định lượng đồng thời curcumin
và piperin bằng phương pháp HPLC. Quy
trình xử lý mẫu: chiết cách thuỷ bằng MeOH;
dịch chiết để bốc hơi đến cắn và hoà tan
cắn trong pha động để phân tích bằng
HPLC. Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha
động ACN:KH2PO4 50 mM (60:40, v/v), tốc
độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50
µl. Quy trình định lượng này đã được
thẩm định và có thể ứng dụng để định
lượng đồng thời curcumin và piperin trong
các chế phẩm trên thị trường.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Viện Dược liệu. Cây thuốc và động vật
làm thuốc Việt Nam. NXB Khoa học và
Kỹ thuật. 2002.

12

2. Bộ Y tế. Hướng dẫn của Asean về thẩm
định quy trình phân tích. Phụ lục 7 - Thông tư
22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc.
2009.
3. P. Anand, A.B Kunnunmakkaram. Bioavailability
of curcumin: proplems and promises, Molecular
Pharmaceutics. 2007, 4 (6), pp.807-818.
4. P. Anand et al. Biological activities of
curcumin and its analogues (Congeners) made
by man and Mother Nature. Biochemical
Pharmacology. 2008, 76, pp.1.590-1.611.
5. Krishna Veni Nagappan, Meyyanathan S
N, Rajinikanth B Raja and Elango Kannan. A
liquid chromatography method for the
simultaneous determination of curcumin and
piperine in food products using diode array
detection. Asian J. Research Chem. 2009, 2 (2),
April.-June.
6. Zhong Ming-Yuan, Quan Shan-Cong, Hu
Jin-Hong.
Simultaneous
determination
of curcumin and piperine in turmeric capsule

by HPLC method, Pharmaceutical Care and
Research. 2006, 6 (1), pp.54-56.