Định lượng metformin trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
*; Nguyễ

ă

*;

**; ũ uấn Anh**
u ***;
u
**

TÓM TẮT

o

fortis phenyl (5 µm, 1

-

2HPO4

- 2 µg/m
97,

-

- 103,29%.

ự

ể ử

* ừ

DETERMINATION OF METFORMIN IN DOG PLASMA BY
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
SUMMARY
Metformin is an oral biguanide medication, it has effective in reducing blood glucose levels in
patients with type 2 diabetes. The aim of this study was to validate the analytical method of
metformin in dog plasma by high pressure liquid chromatography (HPLC) with detector UV
(at 232 nm) using ranitidin as an intenal standard. After precipating protein in plasma by
acetonitrile, metformin and internal standard were eluted from fortis phenyl column (5 m, 150 x
4.6 mm) at 25C with a mobile phase consisting of acetonitrile and 20 mM Na2HPO4 (60:40, v/v),
at a flow rate of 1.0 ml/min. The lower limit of quantitation was 0.05 µg/ml, with a relative standard
deviation of less than 20%. A linear range of 0.05 - 2 µg/ml was established. This HPLC method
was validated with between - batch and within - batch precision of 2.70 - 6.35% and 3.59 - 6.76%,
respectively. The between - batch and within - batch accuracy was 97.43 - 100.96% and 94.62 103.29%, respectively. This validated method is sensitive and repeatable enough to be used in
bioavailability studies in dogs.
* Key words: Metformin; Plasma; HPLC.
* Trường Cao đẳng Dược Phú Thọ
** Học viện Quân y
*** Trường Đại học Dược Hà Nội
N
N

13

ờ p ả ồ (C esp d

y
ậ b : 12/08/2014; N
N

): N uyễ
ă
(
v@
a l.c
yp ả b
đá
á b bá : 16/09/2014
y b bá đ ợc đă : 25/09/2014

)


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ĐẶT VẤN ĐỀ

c ký l ng hi
W
),
detector UV, máy ly tâm l nh UNIVERSAL
c), t l nh âm sâu DF8514
(Ilshinlab, Hàn Qu c).

K ô
ô

P

ừ
ô

X
ô

q

Ở
q

ô
ừ

ng d n c
gi i h
t l thu h

ặ
[ ]

[ ]
ì
ọ

ử

ặc hi u,
tuy n tính,
[ ]

1. K t quả
q

Q

ự
F A Vì ậ

ì
F A

ì

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN

ọ
q

ự

Kỳ
ô

trong huy

ng metformin
c xây dựng

ể
ữ
ô

é
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
N

p
ng vật thí nghi m, Học vi n Quân y
cung c p.
W
ử
c c t
(HPLC-Merck), các dung môi hoá ch t khác
t tiêu chu n PA.
chu n do Vi n Kiểm nghi
cung c
ữ -250

14

L y 0,2 ml huy
u tr ng/chu n/
thử) cho vào ng ly tâm. Thêm 50 µl dung
d ch ranitidin 7,5 µg/ml (n i chu n) và 50 µl

c c t; 0,4 ml dung d ch acetonitril,
l
, ly tâm 10.000
vòng/phút trong 10 phút. L y d ch n i, lọc
qua màng lọc 0,45 m. D ch lọ
c
ể tiêm s c ký.
K q
ự
ọ
c t fortis phenyl (5 m, 150 x 4,6 mm).
Nhi
c t: 25
ng: acetonitril m Na 2NPO 4
(v/v). T
dòng 1,0 ml/phút. Detector UV
c sóng 232 nm. Thể tích tiêm
m u: 50 l. N i chu n ranitidin có n ng
7,5 g/ml.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

K

ả

nh

* Độ đặc hiệu - chọn lọc:

Phân tích các m u huy
và n i chu n ranitidin (7,5 µg/ml).

ng và huy

n (0,05 µg/ml)

b

a

Hình 1: S
m u huy

và s

m u huy

UV

ể

ng (a)
a metformin và ranitidin (b).

ô
ẳ

ự

q

3.107 Peak 1

322.7
0.014

3.092 Peak 1

233.8

227.9

a

0.012

0.12

AU

AU

0.08

0.008
0.006

0.06

0.004

0.04

0.002

0.02

391.8

0.000
200.00

b

0.10

0.010

0.00

250.00

300.00

350.00

200.00

250.00

300.00

nm

350.00

nm

Hình 2: Ph h p th c a các pic có tR = 3,33 (ranitidin-a) và tR = 4,26 (metformin-b).
Bảng 1: K t qu kiể
STT

ặc hi u - chọn lọc c

DiÖn tÝch pic mÉu tr¾ng (mAU*s)

Rt từ 3,1 - 3,7 phút

Tr ng/metformin

Tr ng/ranitidin

1

328

-

< 20%

< 5%

2

-

-

< 20%

< 5%

3

-

276

< 20%

< 5%

4

-

-

< 20%

< 5%

5

-

652

< 20%

< 5%

6

-

-

< 20%

< 5%

(“-“: không có tín hiệu đáp ứng)
15

Tû lÖ ®¸p øng pic

Rt từ 4,0 - 4,4 phút

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ểm trùng v i th

T i th

ô

c
ng pic
c a m u tr
≤
n tích pic c a
m u chu n (di n tích pic trung bình c a
m u chu n metformin có n
g n
gi i h
i là 3.028 mAu.s).
Trong kho ng th
ừ 3,1 - 3,7 phút,
di n tích pic m u tr
≤
n tích pic
n i chu n (di n tích pic ranitidin trung bình
68.279 mAu.s).
ậ
ậ

metformin

ảng : ự

ọ

ọ

* Độ tuy n tính:

1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 µg/ml
q
ì
ự
X
q
ữ
metformin/
ranitidin.

ữ
.

Tªn mÉu

S1

S2

S3

S4

S5

S6

1,95

0,98

0,44

0,22

0,11

0,05

Di n tích pic metformin (mAU.s)

154.984

80.963

33.419

16.853

7.086

1.549

Di n tích pic ranitidin (mAU.s)

70.580

74.280

70.937

74.727

71.096

69.951

T l di n tích chu n/n i chu n

2,196

1,090

0,471

0,226

0,100

0,022

N

thực (µg/ml)

ì

2

i quy (Y = aX + b)*

N
nh từ
so v i giá tr thực (%)

ng chu n

Y = 1,1438X - 0,0303; R = 0,998
97,32

97,94

87,67

111,82

113,60

91,65

(*Y: tỷ lệ diện tích pic metformin/ranitidin; X: nồng độ metformin trong mẫu)

ừ

q

-

ữ
q

ừ
é
n

ự
-

iv in

th p nh t và 85 - 115% cho các

còn l i).
*

i i hạn đ nh ượng dư i (

X

Q:

ng pic c a m u chu n, m u tr ng. Tính n

chu n từ t l di
ng cách so sánh v i giá tr thực có trong m u.
16

-

metformin trong m u

ng chu n; từ


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ảng : K

q
DiÖn tÝch pic (mAU.s)

M u chu n (metformin 0,05 µg/ml)

STT

M u tr ng

Metformin
(Rt = 4,3 phút)

Ranitidin
(Rt = 3,3 phút)

Rt từ 4,0 - 4,4 phút

Rt từ 3,1 - 3,7 phút

1

2.483

68944

328

-

2

3.764

64835

-

-

3

3.051

68432

-

276

4

3.742

68211

-

-

5

3.471

68552

-

652

X

3.302

SD

541

RSD (%)

16,37

ặ
ậ
ọ
* Độ đúng độ chính ác trong ngày và
khác ngày:
Ti
ể
3m cn
LQC (0,15 µg/ml), MQC
(0,4 µg/ml) và HQC (1,5 µ
Q
ậ
ặ
ử
ữ
ự
ọ K
q
100,96% (n m trong gi i h
é
é
ọ
17

* Tỷ ệ thu hồi:
X
nh t l thu h i c a ch t chu n
và n i chu n b ng cách so sánh di n tích
pic c a metformin và ranitidin từ m u huy t
i di n tích pic c a chúng trong
m u ph
ng có ch a cùng n
K
q
l
90,23% (n = 4), c a metformin các n ng
LQC, MQC và HQC l
t là 70,94%,
ặ
D < 5%
v i n i chu n, RSD < 10% v i chu n).
* Độ n đ nh:
n i chu n g

q
v i metformin và

ch chu n g c,

ể
nhi
-200

-800
i
i v i ranitidin.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ảng :

nh th i gian ng n c a dung d ch chu n và n i chu n g c.
KÕt qu¶ ®Þnh l-îng

Giai ®o¹n

STT

Chu n g c (mAU.s)

N i chu n g c (mAU.s)

Th ng kê
B o qu n l nh

o

Sau 4 gi /25 C

Th ng kê

1

12.896

X = 12877

83.551

X = 86.893

2

13.525

SD = 904,8

87.965

SD = 2.265,6

3

11.591

87.526

4

13.495

88.530

1

12.759

X = 12635

85.609

X = 83.952

2

12.784

SD = 580,2

83.628

SD = 2.931,6

3

13.181

p = 0,668

86.606

p = 0,164

4

11.814

79.966

N
trung bình c a dung d ch chu n g c và n i chu n g
ể
và b o qu n l
ô
ĩ
>
chu n g c và dung d ch n i chu n g c b n vững
u ki n nhi
vòng 4 gi .
trong các m
u ki
qu n l nh từ 1 - 20 ngày -80o

nhi
phòng
ậy, dung d ch
phòng trong

nh n
c ch t có
ọn t i th
ểm ngay sau khi pha và sau khi b o

i v i metformin và -20o
i v i ranitidin.

Bảng 5:

.
KÕt qu¶ ®Þnh l-îng trung b×nh (n = 4)

Giai ®o¹n

Chu n g c (1.000 µg/ml)
u
Sau 3 ngày

Sau 5 ngày

Sau 7 ngày

Sau 9 ngày

Sau 20 ngày

18

N i chu n g c (1.500 µg/ml)

X  SD

1.000  32,06

X  SD

1.500  59,75

X  SD

973,80  15,23

X  SD

1.575,76  58,01

p0 - 3

0,190

p0 - 3

0,119

X  SD

974,29  4,16

X  SD

1.491,99  11,85

p0 - 5

0,163

p0 - 5

0,801

X  SD

952,66  29,18

X  SD

1.465,02  11,37

p0 - 7

0,072

p0 - 7

0,294

X  SD

1.033,91  21,02

X  SD

1.449,47  32,80

p0 - 9

0,127

p0 - 9

0,189

X  SD

970,19  38,33

X  SD

1.479,82  20,43

p0 - 15

0,278

p0 - 15

0,546

nh c a m u huy

ỳ ô

-

ô


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ảng 6: K

q

ỳ ô

ô

-

Nång ®é metformin (µg/ml)
Giai ®o¹n

M u LQC

STT

N

Phân tích ngay
u)

Sau 3 chu kỳ ô
ô

-

M u HQC

Th ng kê

N

Th ng kê

1

0,171

X = 0,165

0,170

X = 1,302

2

0,170

SD = 0,010

0,165

SD = 0,010

3

0,149

0,172

4

0,169

0,157

1

1,292

X = 0,166

1,285

X = 1,308

2

1,297

SD = 0,006

1,349

SD = 0,028

3

1,312

p = 0,831

1,299

p = 0,746

4

1,310

ỳ ô

1,296

ô

-

>

q
ì
ử
o sánh n

LQC, HQC xử lý m
q
ì
c lựa chọ
toàn nhi
phòng, các m u LQC, HQC có cùng n
lý m
ể tan ch y nhi
phòng 4 gi .
q

Bảng 7:

ì

metformin trong các m u
ể tan ch y hoàn
ti n hành xử

ử
Nång ®é metformin (µg/ml)

Giai ®o¹n

M u LQC

STT

N

M

M u HQC

Th ng kê

Th ng kê

1

0,171

X = 0,165

1,292

X = 1,302

2

0,170

SD = 0,010

1,297

SD = 0,010

3

0,149

1,312

4

0,169

1,310

1

0,165

X = 0,167

1,303

X = 1,320

2

0,169

SD = 0,002

1,310

SD = 0,016

3

0,169

p = 0,697

1,331

p = 0,111

4

0,164

c xử lý ngay

M
gi

c xử lý sau 4
ể tan ch y nhi t
phòng

N
sau 4 gi
-

metformin trong m
ể tan ch y nhi

Q

1,335

Q

c xử lý ngay so v i m
c xử lý
ô
ĩ
ng kê (p > 0,05).

nh c a m u huy
Q X
nh n
metformin có trong m u t i các th
và sau 7, 17 và 27 ngày b o qu n m u -20oC.
19

N

u LQC
ểm ngay sau khi pha


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

ảng 8: K

q

.
Nång ®é metformin (µg/ml)

Giai ®o¹n

STT

M u LQC

M

M u HQC

1

0,157

X = 0,151

1,373

X = 1,434

2

0,149

SD = 0,005

1,553

SD = 0,101

3

0,153

1,480

4

0,146

1,332

1

0,156

X = 0,159

1,366

X = 1,380

2

0,148

SD = 0,010

1,349

SD = 0,038

3

0,158

p = 0,221

1,371

p = 0,353

4

0,172

1

0,150

X = 0,154

1,510

X = 1,511

2

0,152

SD = 0,004

1,421

SD = 0,065

3

0,156

p = 0,377

1,571

p = 0,251

4

0,158

1

0,155

X = 0,161

1,333

X = 1,317

2

0,164

SD = 0,007

1,289

SD = 0,025

3

0,171

p = 0,060

1,343

p = 0,064

4

0,156

u

Sau 7 ngày
1,435

Sau 17 ngày
1,540

Sau 27 ngày
1,304

N
metformin trong các m u b o qu n
u ki n -20oC trong vòng 7, 17 và
27 ngày so v i n
metformin trong m u m i pha khác bi
ô
ĩ
th
>
ậy, metformin
nh trong huy
u ki n b o qu n -20oC.
KẾT LUẬN
Q
pháp

và th
ng metformin trong huy t
ự
ọ
q

ì
ử
ể
y
0,2 ml huy
(m u tr ng/chu n/thử) cho vào ng ly
tâm. Thêm 50 µl dung d ch ranitidin 7,5
µg/ml (n i chu n) và 50 µl
c c t, 0,4
ml acetonitril, l c xoáy 30 giây.

0,45 m. D ch lọ
tiêm s c ký.
phenyl (5 
C.
Na2HPO4 0,02 M,

ể

UV


ể
g/ml.
Q

ì
ọ

y d ch n i lọc qua màng lọc

20

ự
q


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

F A

3. Center for drug evaluation and
research.
Guidance
for
industry,
bioanalytical method validation. FDA, US,
Department of Health and Human Service.
2001.

ọ
ậ

ể

q

ì

ể
é

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dược thư quốc gia Việt Nam.

Y

. Thông tư hư ng dẫn báo cáo số iệu
nghiên cứu sinh khả dụng/tương đương
sinh học trong đăng ký thuốc.
Y
2010.

21

4. Himal Paudel Chhetri. Simple HPLCUV method for the quantification of
metformin
in human plasma with
one step protein precipitation. Saudi
Pharmaceutical Journal. 2014, pp.1-5.
5. Valentina Porta. HPLC-UV determintaion
of metformin in human plasma for
application in pharmacokinitics and
bioequivalence studies. 2007, pp.143-147.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014

22