Chẩn đoán di truyền ở các bệnh nhân mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh

Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN Ở CÁC BỆNH NHÂN  
MẮC BỆNH TĂNG SẢN TUYẾN THƯỢNG THẬN BẨM SINH 
Ngô Thị Hồng Phước*, Đỗ Thị Thanh Thủy*,**, Nguyễn Ngọc Minh***, Nguyễn Thị Băng Sương*,** 

TÓM TẮT 
Đặt vấn đề: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột 
biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong 
việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền.  
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2. 
Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên hai bệnh nhân CAH được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm 
sàng, tách chiết DNA của bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật  giải  trình  tự  gen  và  MLPA  (Multiplex  ligation‐
dependent probe amplification) để phân tích đột biến gen CYP21A2.  
Kết quả: Phát hiện được một bệnh nhân bị đột biến điểm và một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp 
tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2.  
Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình và ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật 
MLPA trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh CAH. 
Từ khóa: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, gen CYP21A2, MLPA. 

ABSTRACT
IDENTIFICATION OF GENE MUTATIONS AT CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA PATIENTS 
Ngo Thi Hong Phuoc, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Ngoc Minh, Nguyen Thi Bang Suong 
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 502 ‐ 507 
Introduction:  Congenital  Adrenal  Hyperplasia  (CAH)is  a  genetic  disease  caused  by  mutations  in  the 
CYP21A2gene  which  is  located  on  chromosome  6.  Detection  of  CYP21A2  gene  mutations  is  important  for 
diagnostic and genetic counseling. Sequencing and MLPA technique are used by many authors for diagnostic of 
CYP21A2 gene mutations. 
Objectives: Applification of sequencing and MLPA technique to identify mutations in CYP21A2 gene. 

Patients  and  Methods: Two patients were diagnosed CAH by clinical symptoms,DNA of these patients 
was  extracted  by  Qiagen  kit.  After  that  we  performedsequencing  technique  to  identify  point  mutations  and 
MLPA technique to identify deletion mutations in CYP21A2 gene. 
Results: Onepatient had point mutation and the other patient had homozygote deletion in CYP21A2 gene.  
Conclusions: The research was initially completed the application process and successfully in the diagnosis 
of CYP21A2 mutations causing CAH disease. 
Keywords:Congenital Adrenal Hyperplasia, CYP21A2gene, MLPA . 
lệ 90 ‐ 95%. Đứng thứ hai là thể 11β‐hydroxylase 
ĐẶT VẤN ĐỀ 
5 ‐ 9%, ngoài ra thiếu hụt các enzyme khác gây 
Bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng  thận  (CAH)  là 
các  thể  bệnh:  3β-HSD,  17α‐hydroxylase  và  20, 
bệnh  di  truyền  trong  đó  thể  thiếu  enzym  21‐
22‐desmolase  ít  gặp  hơn.  Sự  khiếm  khuyết  của 
hydroxylase là thể bệnh hay gặp nhất, chiếm tỷ 
enzyme  21‐hydroxylase  dẫn  đến  mức  độ  khác 
* Trung tâm Y Sinh học phân tử, **Bộ môn Hóa sinh, ***B�)  và  đoạn  từ  exon  3  đến  exon  9  (kích 
thước 2051 bp). Sau đó, sản phẩm PCR được giải 
trình tự và kết quả phát  hiện  bệnh  nhân  bị  đột 
biến  điểm  đồng  hợp  tử  ở  vị  trí  c.1276  C>T,  đột 
biến này làm thay đổi acid amin tại codon 426 là 
arginin thành cysteine (đột biến p.R426C) và đã 
được  Grischuk  công  bố  vào  năm  2006  trên  tạp 
chí  J  ClinEndocrinoMetab(5).  Arginine  là  một 
trong  4  acid  amin  có  liên  kết  hydro  với  chuỗi 
propionate  của  heme  (cysteine‐169,  glycine‐178, 
tryptophan‐302  và  arginine‐426),  điều  này 
không chỉ giúp định hướng heme trong protein 
mà  còn  tham  gia  vào  việc  vận  chuyển  điện  tử. 
Sự đột biến thay đổi acid amin arginine tại vị trí 

codon  426  thành  acid  amin  cysteine  sẽ  phá  vỡ 
các  liên  kết  hydro  với  nhân  tố  heme,  khiến 

505


Nghiên cứu Y học 

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014

protein  không  có  chức  năng  và  gây  thể  mất 
muối  CAH(6).  Ở  bệnh  nhân  này  chúng  tôi  còn 
tìm thấy có sự khác biệt so với trình tự Genbank 
NG_007941 như sau: tại codon 10 có chèn thêm 
3  nucleotid  TGC,  kiểm  tra  kết  quả  SNP  trên 
website  NCBI  chúng  tôi  phát  hiện  đây  chỉ  là 
SNP  chứ  không  phải  đột  biến.  Từ  kết  quả  này 
cho thấy chúng tôi đã bước đầu hoàn thiện được 
các  yếu  tố  thực  hiện  quy  trình  PCR  để  khuếch 
đại  gen  CYP21A2  như:  lựa  chọn  trình  tự  mồi, 
chuẩn nồng độ các thành phần phản ứng, nhiệt 
độ  của  chu  kì  luân  nhiệt  trong  phản  ứng 
PCR,…cũng  như  quá  trình  giải  trình  tự  gen  để 
xác định đột biến. 
Ở bệnh nhân 2, mặc dù đã sử dụng các cặp 
mồi  đặc  hiệu  như  đối  với  bệnh  nhân  CAH  01 
nhưng kết quả PCR không khuếch đại được hai 
đoạn gen của CYP21A2 như bệnh nhân CAH 01, 
trong  khi  đó  mẫu  người  bình  thường  vẫn  xuất 
hiện  2  vạch  tương  ứng  với  kích  thước  của  sản 

phẩm  PCR.  Điều  này  cho  thấy  khả  năng  bệnh 
nhân  bị  đột  biến  tại  vùng  gắn  mồi,  vì  vậy  các 
mồi  không  gắn  được  vào  phân  tử  DNA  của 
bệnh nhân và không khuếch đại được vùng gen 
cần khảo sát. Do cả hai đoạn exon 1‐3 và exon 3‐
9  đều  không  lên  vạch  của  sản  phẩm  PCR  nên 
chúng tôi nghĩ bất thường có thể liên quan đến 
exon gắn mồi chung là exon 3. Từ suy đoán này 
chúng tôi tiếp tục sử dụng phản ứng MLPA để 
phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2. Kết 
quả hình 5 cho thấy ở người bình thường, tất cả 
các  đỉnh  tương  ứng  với  các  exon  của  gen 
CYP21A2  đều  xuất  hiện,  trong  khi  đó  ở  mẫu 
bệnh  nhân,  đỉnh  của  exon  1  và  exon  3  không 
xuất hiện, còn đỉnh của các exon 4, 6, 8 có chiều 
cao  chỉ  bằng  ½  so  với  người  bình  thường.  Kết 
quả chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn đồng hợp 
tử từ exon 1 đến exon 3, còn từ exon 4 đến exon 
8 thì bị mất đoạn dị hợp tử. Điều này suy đoán 
rằngmột trong hai người bố (hoặc mẹ) của bệnh 
nhân  sẽ  mang  kiểu  gen  CYP21A2  dị  hợp  tử, 
trong  đó  1  allele  bình  thường  và  allele  bị  đột 
biến mất đoạn từ exon 1‐3. Người mẹ (hoặc bố) 
còn  lại  cũng  có  kiểu  gen  CYP21A2  dị  hợp  tử, 
mang 1 allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐8. 

506

Muốn khẳng định suy đoán cần tiến hành phân 
tích  kiểu  gen  của  bố  và  mẹ  bệnh  nhân.  Việc 

phân tích di truyền bệnh CAH vẫn còn hạn chế 
tại  Việt  Nam  nhưng  đối  với  các  nước  trên  thế 
giới  vấn  đề  này  được  quan  tâm  từ  lâu.  Năm 
2009, Concolino đã ứng dụng kỹ thuật MLPA để 
chẩn  đoán  đột  biến  mất  đoạn  và  lặp  đoạn  gen 
CYP21A2(3). Năm 2011, tác giả Rabbani cũng đã 
dùng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất 
đoạn  đồng  hợp  tử  gen  CYP21A2  gây  thể  nam 
hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp 
MLPA  có  thể  sử  dụng  trong  chẩn  đoán  mất 
đoạngen  CYP21A2  gây  bệnh  tăng  sản  tuyến 
thượng  thận  bẩm  sinh  và  chúng  tôi  đã  thành 
công trong việc ứng dụng phương pháp này. 

KẾT LUẬN 
Nghiên  cứu  đã  bước  đầu  ứng  dụng  thành 
công kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột 
biến  điểm  và  kỹ  thuật  MLPA  để  phát  hiện  đột 
biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản 
tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh.  Điều  này  có  ý 
nghĩa  quan  trọng  trong  việc  chẩn  đoán  người 
lành  mang  gen  bệnh  và  chẩn  đoán  trước  sinh 
cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp 
tục mang thai nhằm tránh sinh ra những đứa trẻ 
bị bệnh. 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1.

2.

3.

4.

5.

Bahareh  R,  Akbari  MT,  Mahdieh  N,  Zaridust  E,  Ashtiani  MT, 
Lee HH,  Auchus  R,  Rabbani  A  (2011).  Homozygous  complete 
deletion of CYP21A2causes a simple virilizing phenotype in an 
Azeri child. Asian Biomedicine. 889‐892. 
Brook C, Hughes I, and Kelnar C (2000). Antenatal Treatment of 
a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia. 
Archive Disease Children Fetal Neonatal. 82(3):F176‐81. 
Concolino  P, Mello  E, Toscano  V, Ameglio  F, Zuppi 
C, Capoluongo E (2009). Multiplex ligation – dependent probe 
amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene 
deletions/  duplications  in  Congenital  Adrenal  Hyperplasia: 
First technical report.Clin Chim Acta. 402(1‐2):164‐70. 
Day  DJ, Speiser  PW, Schulze  E, Bettendorf  M, Fitness  J, Barany 
F, White  PC  (1996).  Identification  of  Non‐Amplifying  CYP21 
Genes  When  Using  PCR‐Based  Diagnosis  of  21‐Hydroxylase 
Deficiency in Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Affected 
Pedigrees. Hum Mol Genet. 5(12):2039‐48. 
Grischuk  Y, Rubtsov  P, Riepe  FG, Grötzinger  J, Beljelarskaia 
S, Prassolov  V, Kalintchenko  N, Semitcheva  T, Peterkova 
V, Tiulpakov  A, Sippell  WG, Krone  N  (2006).  Four  novel 
missense  mutations  in  the  CYP21A2  gene  detected  in  Russian 
patients suffering from the classical form of congenital adrenal 

Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 

6.

7.

8.

hyperplasia:  identification,  functional  characterization,  and 
structural analysis. J.Clin Endocrinol Metab;91(12):4976‐80. 
Haider  S, Islam  B, DʹAtri  V, Sgobba  M, Poojari  C, Sun  L, Yuen 
T, Zaidi M, New MI (2013).Structure phenotype correlations of 
human  CYP21A2  mutattions  in  congenital  adrenal 
hyperplasia.Proc Natl Acad Sci USA; 110(7):2605‐10. 
Loke KY, Lee YS, Lee WW, Poh LK (2001). Molecular Analysis 
of  CYP‐21  Mutations  for  Congenital  Adrenal  Hyperplasia  in 
Singapore.Horm Res; 55(4):179‐84. 
Speiser  PW,  Dupont  J,  Zhu  D,  Serrat  J,  Buegeleisen  M,  Tusie‐
Luna  MT,  Lesser  M,  New  MI,  White  PC  (1992).  Disease 
expression  and  molecular  genotype  in  congenital  adrenal 
hyperplasia  due  to  21‐hydroxylase  deficiency.  J  Clin.  Invest; 
90(2): 584‐595. 
 

Nhi Khoa

Nghiên cứu Y học

9.

Trần  Vân  Khánh,  Lê  Thị  Phương,  Trần  Huy  Thịnh  và  Tạ 
Thành Văn (2012). Phát  hiện  đột  biến  gen  CYP21A2  ở  bệnh 
nhân  tăng  sản  thượng  thận  bẩm  sinh.Tạp  chí  nghiên  cứu  Y 
học, 78(1):100‐103. 
10. Vrzalova’  Z,  et  al  (2011).Chimeric  CYP21A1P/  CYP21A2  genes 
identified  in  Czech  patients  with  congenital  adrenal 
hyperplasia. Eur J Med Genet; 54(2):112‐7. 

 
Ngày nhận bài báo:  

 

 

01/11/2013 

Ngày phản biện nhận xét bài báo:  

26/11/2013 

Ngày bài báo được đăng:  

05/01/2014 

 

507