Phát triển mô hình gây co giật bằng picrotoxin trên chuột nhắt và khảo sát tác động chống co giật của NL197 và nọc bò cạp

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

Nghiên cứu Y học

PHÁT TRIỂN MÔ HÌNH GÂY CO GIẬT BẰNG PICROTOXIN
TRÊN CHUỘT NHẮT VÀ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT
CỦA NL197 VÀ NỌC BÒ CẠP
Trần Hoàng Yến*, Trương Thị Thu Trang**, Nguyễn Ngọc Vinh***, Hoàng Ngọc Anh****,
Phạm Thành Suôl*, Võ Phùng Nguyên**

TÓM TẮT
Mục tiêu: Phát triển mô hình gây co giật bằng Picrotoxin và khảo sát tác động chống co giật của NL197 và
các phân đoạn nọc Heterometrus laoticus trên chuột nhắt trắng.
Phương pháp: Xác định liều gây co giật động kinh và tử vong chuột nhắt trắng. LD100 được sử dụng để
khảo sát tác động của NL197 và phân đoạn nọc bò cạp. Thời gian khởi phát cơn, số lần, thời gian co giật, thời gian
mỗi loại, khoảng cách giữa các cơn co giật, thời gian và tỉ lệ tử vong và thời gian bám trên thanh quay được ghi
nhận. Khảo sát sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng nhuộm Hematoxylin Eosin và Cresyl violet.
Kết quả: Picrotoxin 8 mg/kg SC gây co giật, tử vong 100% chuột thử nghiệm, làm giảm thời gian bám
trên thanh quay và tổn thương vùng hải mã. NL197 PO liều 50, 73 và 100 mg/kg bảo vệ, chống co giật, làm
tăng thời gian bám trên thanh quay và bảo vệ tế bào thần kinh. Phân đoạn nọc bò cạp chỉ kéo dài thời gian
bám trên thanh quay.
Kết luận: NL197 có tác động chống co giật, bảo vệ khỏi tử vong, tăng khả năng phối hợp vận động, giảm
thoái hóa tế bào thần kinh. Các phân đoạn nọc bò cạp làm tăng khả năng phối hợp vận động của chuột.
Từ khóa: Động kinh, Co giật, Picrotoxin, NL197, Nọc bò cạp, Mô hình thanh quay rotarod, Sự thoái hóa tế
bào thần kinh.

ABSTRACT
DEVELOPMENT OF PICROTOXIN – INDUCED CONVULSIVE MICE MODEL TO EVALUATE
ANTICONVULSIVE ACTIVITIES OF NL197 AND THE VENOM OF SCORPION
Tran Hoang Yen, Truong Thi Thu Trang, Nguyen Ngoc Vinh, Hoang Ngoc Anh, Pham Thanh Suol,
Vo Phung Nguyen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 401 - 405

Objectives: Picrotoxin (PTX)-induced seisure on mice was studied then applied to evaluate anticonvulsive
activities of NL197 and venom from Heterometrus laoticus.
Methods: LD100 SC PTX was used to evaluate anticonvulsive effect and protection from death of NL197
and the venom of scorpion. The following parameters: latency of onset, duration of convulsions, frequency of
convulsions, classification – time of each convulsion, spread of convulsions, time of death, mortality and duration
on rotating cylinder in rotarod test were recorded for evaluating the convulsive condition. Evaluate the
degeneration of neurons by hematoxylin eosin and cresyl violet staining.
Results: LD100 PTX 8 mg/kg SC caused the decrease in the time which mice spent on rota-rod and injured
neurons in hippocampus. In PTX induced-seizure model, NL197, administered orally, had anticonvulsive
activities at doses of 50 mg/kg, 73 mg/kg and 100 mg/kg, respectively, prolonged the time spent on the rotating

* Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ
** Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh
*** Viện Kiểm nghiệm Tp. Hồ Chí Minh
**** Viện khoa học vật liệu ứng dụng Tp. HCM
Tác giả liên lạc: DS. Trần Hoàng Yến
ĐT: 01222 884 888 Email:

Chuyên Đề Dược Học

401


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

cylinder and showed protective effect on neurons. The fractions of scorpion’s venom only increased the duration
mice spent on the rod in rotarod.
Conclusions: In PTX induced-seizure model, NL197 had anticonvulsive effect and protection from death,

strengthened motor coordination ability and prevented neurons from degeneration.
Keywords: Epilepsy, Convulsion, Seizure, Picrotoxin, NL197, Venom of scorpion, Rotarod test,
Degeneration of neurons.
gian tử vong và tỉ lệ tử vong(3), (5) và khả năng
ĐẶT VẤN ĐỀ
phối hợp vận động.
Trong vài thập niên gần đây, nhiều nghiên
Liều LD100 PTX được sử dụng để khảo sát
cứu thử nghiệm hiệu quả trị động kinh của các
tác động chống co giật và bảo vệ chuột khỏi tử
thuốc đã được báo cáo, tuy nhiên kết quả đạt
vong của PĐ nọc bò cạp và NL197. DZP 5 mg/kg
được vẫn chưa thật sự hiệu quả và vẫn còn
uống 60 phút trước khi tiêm PTX được sử dụng
khoảng 1/3 bệnh nhân chưa có đáp ứng tốt với
đối chứng. Điều kiện sử dụng các chất là 0,1
những thuốc điều trị hiện tại(4). Nhu cầu đặt ra là
mL/10 g thể trọng.
cần có mô hình để khảo sát tác động chống động
Khảo sát tác động chống co giật của NL197 và
kinh của thuốc mới, đặc biệt trong điều kiện thí
các phân đoạn nọc bò cạp trên mô hình
nghiệm tại Việt Nam. Trong khuôn khổ nghiên
picrotoxin và so sánh với diazepam
cứu này, chúng tôi tiến hành phát triển mô hình
gây co giật bằng tác nhân Picrotoxin (PTX) và
Trong thử nghiệm NL197, lô chứng uống
khảo sát tác động bảo vệ chống co giật của
nước cất, NL197 dạng hỗn dịch uống(8). Trong
NL197, một dẫn xuất 4(3H)-quinazolinon và các

thử nghiệm nọc bò cạp, lô chứng SC dung dịch
phân đoạn nọc bò cạp Heterometrus laoticus trên
sinh lý, phân đoạn nọc SC 5 mg/kg. Sau 30 phút,
mô hình khảo sát.
tiêm PTX, SC. Ghi nhận các thông số khảo sát.

ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực Swiss albino, 5 – 6 tuần
tuổi, 18 – 22 g, nuôi ổn định trong hộp nhựa 2
ngày trước thử nghiệm, cung cấp đầy đủ thức
ăn, nước uống trong chu trình 12 giờ sáng tối ở
nhiệt độ 27 ± 1oC. Cường độ ánh sáng 100 ± 5 lux,
đảm bảo yên tĩnh.

Hóa chất nghiên cứu
Picrotoxin (Sigma), Diazepam (DZP – Cty
CPDLDP Pharmadic), NL197 (Viện Kiểm
nghiệm), các phân đoạn (PĐ) nọc bò cạp (Viện
Khoa học Vật liệu ứng dụng).

Phát triển mô hình gây cảm ứng co giật bằng
picrotoxin
Khảo sát tác động gây co giật và tử vong của
PTX trong 30 phút sau khi tiêm dựa vào thời
gian khởi phát cơn, số cơn, thời gian co giật, thời
gian mỗi loại cơn, khoảng cách giữa các cơn, thời

402

Khảo sát tác động của các chất trên khả năng
phối hợp vận động – Mô hình thanh quay
Rotarod
Huấn luyện chuột 2 ngày trước khi thử
thuốc ở tốc độ 35 vòng/phút. Sau khi cho uống
NL197 hoặc tiêm PĐ nọc bò cạp 30 phút hoặc
uống DZP 60 phút, tiêm PTX, SC (liều LD100).
Ghi nhận thời gian chuột bám trên thanh quay
của mỗi lô.
Khảo sát sự thoái hóa tế bào thần kinh –
Phương pháp nhuộm mô tế bào
Não chuột được đúc khuôn nến, cắt nhuộm
với Hematoxylin Eosin (HE) và Cresyl violet
(CV) và quan sát vùng hải mã dưới kính hiển vi
quang học(1,2,6).

Phân tích dữ liệu thống kê
Dữ liệu được trình bày ở dạng số trung bình
± SEM. Phân tích bằng Mann-Whitney (Minitab
14), p<0,05 khác biệt có ý nghĩa thống kê. Dùng
Sigma Plot 11.0 vẽ đồ thị.

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

Nghiên cứu Y học

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Mơ hình gây cảm ứng co giật bằng picrotoxin
80

500

400
***
***
300

200

100

(A)

0
PTX
5 mg/kg
(n=10)

PTX
7 mg/kg
(n=9)

PTX
8 mg/kg
(n=9)

2500

60

Thời gian tử vong (giây)

Khoảng cách giữa các cơn co giật (giây)

Thời gian khởi phát cơn co giật (giây)

600

**

40

***
##

20

PTX
5 mg/kg
(n=10)

PTX
7 mg/kg
(n=9)

1500
**

PTX
8 mg/kg
(n=9)

**

1000

(B)

0

30

2000

500

(C)

0
PTX
5 mg/kg
(n=10)

PTX
8 mg/kg
(n=9)

PTX
7 mg/kg
(n=9)

180

100

PTX 5 mg/kg (n=10)

Thời gian co giật (giây)

Số cơn co giật

*

160

20
*

**

15

10
**

PTX 7 mg/kg (n=9)
PTX 8 mg/kg (n=9)

140
120

Tỉ lệ tử vong (%)

PTX 5 mg/kg (n=10)
PTX 7 mg/kg (n=9)
PTX 8 mg/kg (n=9)

25

*
*

100
80
60
40

80

60

40

20

5
20

(D)

0

Tổng số cơn
co giật

Cơn cục bộ

Cơn toàn thể

0

Tổng số cơn
co giật

Cơn toàn thể

Cơn cục bộ

(E)

0

PTX
5 mg/kg
(n=10)

PTX

8 mg/kg
(n=9)

PTX
7 mg/kg
(n=9)

(F)

Hình 1. Thời gian khởi phát cơn (A), khoảng cách giữa các cơn (B), thời gian tử vong (C), số cơn (D), thời gian co
giật (E) và tỉ lệ tử vong (F). ***p<0,001,**p<0,01,*p<0,05: so với PTX 5 mg/kg, SC; ##p<0,001: so với PTX 7
mg/kg, SC
sát sơ bộ tác động chống co giật và bảo vệ chuột
Trong mơ hình gây co giật bằng PTX 8
khỏi tử vong của NL197 và các PĐ nọc bò cạp.
mg/kg, SC, 100% chuột có biểu hiện co giật và tử
vong. Như vậy, mơ hình có thể áp dụng để khảo
2500
***

***
##

50 0

40 0

30 0

20 0

10 0

0

ED
+ PTX
(n = 1 0 )

DZP
+ PTX
(n = 10 )

NL197
5 0 m g /kg
+ PT X
(n = 1 0 )

NL197
7 3 m g /kg
+ PT X
(n = 1 0 )

NL197
10 0 m g /k g
+ PTX
(n = 1 0 )

(A)

***
#

50
**
## #

40

** *
##

30

20

10

0

DZP
+ PTX
(n = 1 0 )

N L 1 97
5 0 m g /k g
+ PT X
(n = 1 0 )

N L 1 97

7 3 m g /k g
+ PTX
(n = 1 0 )

N L 1 97
1 0 0 m g /k g
+ PTX
(n = 1 0 )

1500

1000

500

(B)

0

**

*

*

20

10

160

140

Tổng số cơn
co giật

Cơn cục bộ

Cơn toàn thể

ED
+ PTX
(n=10)

DZP
+ PTX
(n=10)

N L 197
50 m g /kg
+ PT X
(n= 10 )

N L 1 97
7 3 m g /kg
+ PTX
(n = 10)

N L 197
10 0 m g/k g
+ PTX

(n= 10)

(C)

80

120
**
100

**

**

80
#

*

##

60
* **

40
20

0

D ZP

+ PTX
(n = 10)

100

E D + P T X (n = 1 0 )
D Z P + P T X (n = 1 0 )
N L 1 9 7 5 0 m g /k g + P T X (n = 1 0 )
N L 1 9 7 7 3 m g /k g + P T X (n = 1 0 )
N L 1 9 7 1 0 0 m g /k g + P T X (n = 1 0 )

Tỉ lệ tử vong (%)

*

ED
+ PTX
(n= 10)

180

Thời gian co giật (giây)

**

*

ED + PTX (n=10)
DZP + PTX (n=10)
NL197 50 mg/kg + PTX (n=10)

NL197 73 mg/kg + PTX (n=10)
NL197 100 mg/kg + PTX (n=10)

***
##

**

2000

200

***
##
40

Số cơn co giật

**
**

60

ED
+ PT X
(n =1 0)

50

30

***

70

Khơng có chuột tử vong

***

(D)

0

T o ån g so á c ơ n
c o g ia ät

C ơ n c u ïc b o ä

C ơ n t o a øn th e å

(E)

Khơng có chuột tử vong

**

60 0

Thời gian tử vong (giây)

70 0

Khoảng cách giữa các lần co giật (giây)

Thời gian khởi phát cơn co giật (giây)

Tác động chống co giật của NL197 trên mơ hình picrotoxin

60

40

20

0

NL197
NL197
NL197
50 mg/kg 73 mg/kg 100 mg/kg
+ PTX
+ PTX
+ PTX
(n=10)
(n=10)
(n=10)

(F)

Hình 2. Thời gian khởi phát cơn (A), khoảng cách giữa các cơn (B), thời gian tử vong (C), số cơn (D), thời

gian co giật (E) và tỉ lệ tử vong (F) ở chuột gây co giật bằng PTX 8 mg/kg, SC sử dụng NL197 PO 50, 73,
100 mg/kg, và DZP PO 5 mg/kg. ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05: so với chứng, #p<0,001; ##p<0,001;
###p<0,001: so với DZP. .
cơn, thời gian tử vong và rút ngắn thời gian co
NL197 PO 50, 73 và 100 mg/kg và DZP PO 5
giật có ý nghĩa so với lơ chứng. Cả 3 liều NL197
mg/kg đều có tác động chống co giật, kéo dài
đều làm giảm tỉ lệ tử vong so với lơ chứng, trong
thời gian khởi phát cơn, khoảng cách giữa các

Chun Đề Dược Học

403


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

Nghiên cứu Y học

các cơn, thời gian tử vong, số cơn, thời gian co
giật và tỉ lệ tử vong ở các lơ sử dụng các PĐ nọc
bò cạp SC 5 mg/kg, khơng khác biệt so với lơ
chứng tiêm nước muối sinh lý.

đó NL917 PO 100 mg/kg làm giảm tỉ lệ tử vong
tốt nhất (60%).

Tác động chống co giật của các phân đoạn
nọc bò cạp trên mơ hình picrotoxin
Thời gian khởi phát cơn, khoảng cách giữa

1200

1000

800

600
a

a

400
a
200

0

K hôn g
dùn g thuốc

PTX
5 m g/kg

PTX
7 m g/kg

PTX
8 m g/kg

(A)

800

b

600

b
b
b

400

200

0

ED
+ PTX
(n=8)

NL197
50 mg/kg
+ PTX
(n=8)

DZP
+ PTX
(n=8)

NL197
73 mg/kg
+ PTX
(n=8)

NL197
100 mg/kg
+ PTX
(n=8)

(B)

Thời gian bám trên thanh quay (giây)

1400

Thời gian bám trên thanh quay (giây)

Thời gian bám trên thanh quay (giây)

Thử nghiệm khảo sát tác động của picrotoxin, NL197 và các phân đoạn nọc bò cạp lên chức
năng phối hợp vận động – Mơ hình thanh quay rotarod
600

c
500

c

c

Nọc PĐ2
5 mg/kg
+ PTX
(n=8)

Nọc PĐ3
5 mg/kg
+ PTX
(n=8)

400

300

200

100

0

NaCl
+ PTX
(n=8)

Nọc PĐ1
5 m g/kg
+ PTX
(n=8)

(C)

Hình 4. Ảnh hưởng của PTX (A) và tác động của NL197 (B) và các PĐ nọc bò cạp (C) trên chuột gây rối loạn
phối hợp vận động bởi PTX SC 8 mg/kg. a: p<0,001: so với chứng trắng, b: p<0,001: so với chứng PO nước cất, c:
p<0,001: so với chứng SC dung dịch sinh lý.
nọc bò cạp SC 5 mg/kg kéo dài thời gian bám
PTX SC 5, 7 và 8 mg/kg làm giảm thời gian
trên thanh quay bị giảm gây bởi PTX.
bám trên thanh quay so với lơ chứng. DZP PO 5
mg/kg; NL197 PO 50, 73, 100 mg/kg và các PĐ

Tác động của picrotoxin và các chất khảo sát trên tế bào vùng hải mã

( (A)

(B)

(C)

(D)

Hình 5. Mơ thần kinh bình thường (A) và khi dùng PTX 5, 7 và 8 mg/kg (B,C và D) PTX SC 5, 7, và 8 mg/kg
gây co cụm tế bào, màng tổn thương, mất nhân và thể Nissl.

(A’)

(B’)
A

B

C

D

Hình 6. Mơ thần kinh được bảo vệ bằng NL197 uống liều 50 mg/kg (A’), 73 mg/kg (B’), 100 mg/kg, (C’) và
DZP uống liều 5 mg/kg (D’) trước khi gây độc bằng PTX liều 8 mg/kg, SC.

404

Chun Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
Khi dùng DZP bảo vệ nhận thấy một số TB
bị tổn thương nhưng ít co cụm hơn, TB còn
màng, nhân và thể Nissl. Khi dùng NL197, màng
bị tổn thương ít hơn, TB mất thể Nissl, nhân co
cụm lại ít hơn so với lô chứng.

Hình 7. Mô TK được bảo vệ bằng nọc bò cạp liều 5
mg/kg trước khi gây độc bằng PTX 8 mg/kg, SC.
Màng TB tổn thương rõ, mất thể Nissl, TB co
cụm thành đám.

BÀN LUẬN
Mô hình cảm ứng co giật bằng hóa chất có
thể giúp định hướng sơ bộ chất có tác động
chống co giật thông qua đánh giá các thông số

khảo sát. Bên cạnh đó, dựa trên cơ chế cảm ứng
của tác nhân có thể dự đoán cơ chế bảo vệ của
từng chất thử nghiệm và định hướng nghiên
cứu cho từng nhóm chất cụ thể. PTX là chất đối
vận tại thụ thể GABAA gây tình trạng khử cực
làm khởi phát các kích thích gây co giật động
kinh. Trong mô hình cảm ứng co giật bằng
Pentylentetrazol và Strychnin đã được nghiên
cứu(7), NL197 thể hiện tác động chống co giật và
bảo vệ chuột khỏi tử vong. Dựa trên cơ chế của
chất gây cảm ứng PTX, Pentylentetrazol và
Strychnin, NL197 có thể có cơ chế tác động liên
quan đến thụ thể GABA. Để có kết luận chính
xác hơn về cơ chế hoạt động của NL197 trên tác
động chống co giật cần thực hiện thêm nhiều
nghiên cứu trên các tác nhân cảm ứng khác kết
hợp nghiên cứu trên cơ chế tế bào.

KẾT LUẬN
Trong mô hình cảm ứng co giật bằng PTX đã
xác định được PTX liều 8 mg/kg, SC gây tử vong
100% thú thử nghiệm, dựa trên số liệu này để
khảo sát tác động bảo vệ và giảm tỉ lệ tử vong
trên chuột bị gây co giật bởi PTX.

Chuyên Đề Dược Học

Nghiên cứu Y học

Trên mô hình cảm ứng co giật bằng PTX 8

mg/kg, SC, cả 3 liều NL197 là 50 mg/kg, 73
mg/kg và 100 mg/kg đều thể hiện tác động
chống co giật làm kéo dài thời gian khởi phát
cơn co giật, thời gian tử vong và khoảng cách
giữa các cơn co giật; làm giảm thời gian co giật
và tỉ lệ tử vong. Trong mô hình rotarod, NL197
làm tăng khả năng phối hợp vận động của chuột,
làm kéo dài thời gian chuột bám trên thanh quay
và thể hiện tác động bảo vệ tế bào thần kinh, làm
tế bào ít bị tổn thương khi khảo sát sự thoái hóa
tế bào thần kinh vùng hải mã.
Các PĐ nọc bò cạp liều 5 mg/kg, SC chưa thể
hiện tác động chống co giật và giảm tỉ lệ tử vong
trên chuột khi gây co giật bằng PTX 8 mg/kg, SC
và cũng như chưa thể hiện tác động bảo vệ tế
bào thần kinh. Cả 3 PĐ làm màng tế bào bị tổn
thương nhiều và có hiện tượng co cụm tế bào.
Trong mô hình thanh quay rotarod, các PĐ nọc
bò cạp thể hiện tác động làm tăng khả năng phối
hợp vận động của chuột.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.
4.
5.

6.
7.

8.

Acharya MM, Katyare SS (2006). Picrotoxin-induced
convulsions alters rat brain microsomal membrane structural
properties. Neuroscience Letters, 394(1): 9-12.
Andrew HF, Kenneth AJ, Jack R, Rolf Z (2006). Hematoxylin
and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. In: Spector and
Goldman (eds). Basic Methods in Microscopy, Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Asla P, Philip AS, Solomon LM (2006). Models of seizure and
epilepsy. Elsevier Academic Press, pp 126-154.
Brodie MJ (2002). Staged approach to epilepsy management.
Neurology, 58(5): 2-8.
Hans GV (2004). Drug Discovery and Eluvation pharmacological
Assay Second Edition, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New
York, pp 398.
Kiernan JA (2008). Histological and Histochemical Methods:
Theory and Practice 4th Ed., Bloxham, UK: Scion.
Lien Kieu Suong, Trinh Thi Phuong Lan, Vo Phung Nguyen
(2009). Anti-convulsive activity of NL197, a derivative from
4(3H)-quinazolinon on chemical induced seizure mice. c015 13th International Electronic Conference on Synthetic Organic
Chemistry, 30 November, 2009.
Nguyễn Xuân Dũng, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Ngọc Vinh
(2008). Độc tính cấp và tác động dược lý của dẫn xuất 4(3H)quinazolinon. Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh, 12(1): 94-100.

Ngày nhận bài báo:

14.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

20.12.2012

Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

405