Đánh giá bất thường cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng bằng nhuộm aniline blue

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

ĐÁNH GIÁ BẤT THƢỜNG CÔ ĐẶC NHIỄM SẮC THỂ TINH TRÙNG
BẰNG NHUỘM ANILINE BLUE
Nguyễn Thanh Hoa*; Phan Nữ Thục Hiền*
TÓM TẮT
Mục tiêu: thử nghiệm nhuộm aniline blue (AB) đánh giá mức độ cô đặc nhiễm sắc thể (NST)
tinh trùng. Đối tượng và phương pháp: 40 mẫu tinh dịch chất lượng bình thường theo tiêu
chuẩn WHO (2010). Tiến hành nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc NST. Xem xét mối liên quan
giữa mức độ cô đặc NST tinh trùng và hình thái tinh trùng. Kết quả: nhuộm AB cho hình ảnh
tinh trùng bất thường cô đặc NST có đầu bắt màu thuốc nhuộm, tinh trùng bình thường cô đặc
NST không bắt màu thuốc nhuộm. Không có mối liên quan giữa bất thường hình thái và bất
thường cô đặc NST tinh trùng. Kết luận: có thể sử dụng nhuộm AB đánh giá mức độ cô đặc
NST tinh trùng như một xét nghiệm độc lập không liên quan đến hình thái tinh trùng.
* Từ khóa: Cô đặc nhiễm sắc thể tinh trùng; Nhuộm aniline blue; Hình thái tinh trùng.

Assessment of Mature Sperm by Aniline Blue Stain
Summary
Objectives: Aniline blue stain test evaluated sperm chromatin condensation or sperm
nucleus maturity. Subjects and methods: 40 semen samples with normal quality semen
according to WHO 2010 standard. Using AB stain to evaluate chromatin condensation sperm.
Assess the relationship between abnormal chromatin condensation and abnormal sperm
morphology. Results: Abnormal chromatin condensation sperms (immature chromatin sperms)
had blue-stained nucleus, normal chromatin condensation (mature sperm) had unstained
nucleus. There is no correlation between sperm morphology and sperm maturity. Conclusion:
AB stain can be used to assess sperm chromatin condensation as an independent test that
does not involve sperm morphology.
* Keywords: Sperm chromatin condensation; Aniline blue stain; Morphology sperm.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vô sinh nam chiếm một nửa nguyên

nhân gây vô sinh nói chung. Tinh dịch đồ là
xét nghiệm đầu tiên được chỉ định để chẩn
đoán nguyên nhân vô sinh nam nhưng
không đánh giá được hết khả năng sinh
sản của nam giới. Trong quá trình sinh tinh,
đóng gói hay cô đặc NST tinh trùng nhằm

bảo vệ vật chất di truyền, đảm bảo chức
năng sinh sản của tinh trùng. Quá trình này
gồm có sự thay đổi các histone trong ADN
bằng biến thể histone, sau đó là protein
chuyển tiếp và cuối cùng là protamine [1].
Nhiều nghiên cứu chỉ ra bất thường ADN
tinh trùng gặp nhiều hơn ở nam giới vô sinh
và liên quan đến sảy thai tự phát cũng như
thất bại trong hỗ trợ sinh sản.

* Trường Đại học Y Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Hoa ()
Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017

87


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Các phương pháp đánh giá bất thường
về ADN như SCSA (Sperm chromatin
structure assay), TUNEL (Terminal
deoxynucleotidyl transferase dUTP nick

end labling), phương pháp phân tích sao
chổi (Comet assay) hay các dấu ấn sinh
học... trang thiết bị phức tạp, chi phí cao,
khó áp dụng rộng r i trong điều kiện
Việt Nam hiện nay. Trong khi đó, nhuộm
AB là phương pháp có thể đánh giá được
mức độ hoàn thiện trong khâu đóng gói
ADN tinh trùng, dễ thực hiện, giá thành
rẻ. Nguyên lý của phương pháp này dựa
trên việc AB phản ứng với lysine nên có
thể phân biệt được sự khác biệt trong
thành phần protein nhân cơ bản của tinh
trùng. Nhân tinh trùng chưa trưởng thành
hay bất thường về cô đặc NST rất giàu
histon chứa hàm lượng lysine phong phú
nên bắt màu thuốc nhuộm xanh da trời.
Ngược lại, nhân tinh trùng trưởng thành
giàu protaime có hàm lượng lysine rất
thấp không bắt màu AB.
Trên thế giới, các nghiên cứu vẫn còn
nhiều tranh cãi về tương quan giữa tỷ lệ
tinh trùng bất thường ngưng tụ NST và
các thông số khác của tinh dịch đồ [2, 3].
Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào ứng
dụng phương pháp này. Do đó, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Thử
nghiệm nhuộm AB và bước đầu đánh giá
mối liên quan giữa bất thường cô đặc NST
của tinh trùng bằng nhuộm AB và hình thái
tinh trùng.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
40 mẫu tinh dịch có chất lượng bình
thường theo tiêu chuẩn WHO (2010).
88

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
* Kỹ thuật:
- Lấy mẫu: mẫu tinh dịch được bệnh
nhân (BN) tự lấy bằng phương pháp thủ
dâm, đựng trong cốc chuyên dụng không
độc với tinh trùng. Sau lấy, để trong tủ ấm
37°C đợi tinh dịch ly giải hoàn toàn.
- Đánh giá chất lượng tinh dịch trước
nhuộm. Lựa chọn các mẫu chất lượng bình
thường theo tiêu chuẩn WHO (2010).
- Đánh giá bất thường về hình thái
theo từng đặc điểm: nhuộm lam hình thái
theo quy trình thường quy. Đánh giá hình
thái của 200 tinh trùng dưới vật kính dầu
độ phóng đại x 1.000 lần. Tính tỷ lệ % từng
loại bất thường, gồm bất thường đầu,
bất thường cổ, bất thường đuôi và bất
thường chung.
- Đánh giá bất thường cô đặc NST của
tinh trùng bằng AB: nhỏ 10 μl mẫu tinh
dịch lên lam kính, dùng lam khác kéo làm
lam đàn; để khô trong nhiệt độ phòng; cố

định bằng nhỏ PFA 4% trong 30 phút; rửa
bằng PBS 0,1 M x 2 lần. Nhỏ 10 μl AB 5%
trong dung dịch axít acetic 4% (pH 3.5)
phủ kín lam đàn. Để trong vòng 5 phút;
rửa sạch bằng PBS 0,1 M x 2 lần; để khô
ở nhiệt độ phòng.
- Đánh giá bất thường cô đặc NST tinh
trùng bằng kính hiển vi quang học, đếm
200 tinh trùng sử dụng vật kính dầu độ
phóng đại x 1.000 lần:
+ Tinh trùng chưa trưởng thành có phần
đầu bắt màu xanh đậm của AB.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
+ Tinh trùng bán trưởng thành có phần
đầu vẫn bắt màu thuốc nhuộm chiếm < 50%
diện tích đầu.
+ Tinh trùng trưởng thành đầu không
bắt màu.

Bảng 1: Đặc điểm chung vi thể tinh dịch
đồ nghiên cứu.
Đặc điểm

* Chỉ tiêu nghiên cứu:

Mật độ (triệu/ml)

- Tỷ lệ tinh trùng bất thường đầu.

Di động

Giá trị Giá trị
lớn
nhỏ
nhất
nhất

Trung bình
( X ± SD)

210

20

72,18 ± 36,42

- Tỷ lệ tinh trùng bất thường cổ.

PR (%)

84

38

58,68 ± 10,70

- Tỷ lệ tinh trùng bất thường đuôi.

PR + NP (%)

85

42

66,90 ± 10,39

18

4

10,30 ± 4,21

- Tỷ lệ tinh trùng bất thường chung.
- Tỷ lệ tinh trùng bất thường cô đặc.

NST =

Hình thái bình
thường (%)

Nhóm nghiên cứu có chất lượng vi thể
tinh dịch đồ trong giới hạn bình thường.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái bất thường.

* Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
từ tháng 10 - 2016 đến 4 - 2017 tại Trung
tâm Hỗ trợ Sinh sản và Công nghệ Mô ghép,
Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.

* Phân tích và xử lý số liệu:
- Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS
16.0.
- Kiểm tra mối tương quan bằng hàm
Scatter. Xét mối tương quan: |R| < 0,3:
không có mối tương quan; 0,3 < |R| < 0,5:
mối tương quan lỏng lẻo; 0,5 < |R| < 0,7:
mối tương quan trung bình; |R| > 0,7: mối
tương quan chặt chẽ.

Đặc điểm bất
thƣờng (%)

Giá trị Giá trị
ớn
nhỏ
nhất
nhất

Bất thường đầu

91

77

83,88 ± 4,13

Bất thường cổ

49

12

30,28 ± 8,61

Bất thường đuôi

21

2

6,75 ± 3,97

Bất thường chung

96

82

89,25 ± 4,05

Trong các dạng bất thường, bất thường
đầu gặp tỷ lệ nhiều nhất, tiếp đến là bất
thường cổ, bất thường đuôi ít gặp nhất.
Bảng 3: Đặc điểm về bất thường cô đặc
NST sau nhuộm AB.

* Đạo đức nghiên cứu:
- Nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng
chăm sóc sức khỏe BN.

Đặc điểm
cô đặc NST (%)

- Mẫu sau nghiên cứu sẽ được hủy bỏ.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu nhuộm
AB.
Nghiên cứu sử dụng 40 mẫu tinh dịch
bình thường theo tiêu chuẩn WHO (2010).

Trung nh
( X ± SD)

Giá
trị
ớn
nhất

Giá
trị Trung nh
nhỏ
( X ± SD)
nhất

Tinh trùng bất thường

29

4

16,25 ± 5,83

Chưa trưởng thành

20

1

8,20 ± 4,84

Bán trưởng thành

15

3

8,05 ± 2,98

Tinh trùng bình thường

96

71

83,75 ± 5,83

Dưới đây là một số hình ảnh nhuộm
mức độ trưởng thành tinh trùng bằng AB.
89

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

Hình 1: Mức độ trưởng thành của tinh trùng (nhuộm AB; x400).
(1. Tinh trùng trưởng thành; 2. Tinh trùng bán trưởng thành; 3. Tinh trùng chưa trưởng thành)

2. Mối liên quan giữa bất thƣờng hình thái và bất thƣờng cô đặc NST.

Biểu đồ 1: Mối tương quan giữa bất thường hình thái đầu tinh trùng và
bất thường cô đặc NST.
Có mối tương quan thuận lỏng lẻo giữa tinh trùng bất thường đầu với bất thường cô
đặc NST (R = 0,330).

Biểu đồ 2: Mối tương quan giữa tinh trùng bất thường cổ và bất thường cô đặc NST.
Không có mối tương quan giữa tinh trùng bất thường cổ với bất thường cô đặc NST
(R = 0,257 < 0,3).
90


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

Biểu đồ 3: Mối liên quan giữa tinh trùng bất thường đuôi và bất thường cô đặc NST.
Không có mối tương quan giữa tinh trùng bất thường đuôi và bất thường cô đặc NST
(R = 0,03 < 0,3).

Biểu đồ 4: Mối tương quan giữa tinh trùng bất thường chung và
bất thường cô đặc NST.
Có mối tương quan thuận lỏng lẻo giữa bất thường hình thái tinh trùng mức độ vi thể
và bất thường cô đặc NST (R = 0,430).

BÀN LUẬN
1. Phƣơng pháp đánh giá ất thƣờng
cô đặc NST của tinh trùng ằng nhuộm
AB.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng phương pháp nhuộm AB để kiểm
tra bất thường cô đặc NST của tinh trùng.

Phương pháp này có ưu điểm dễ thực hiện,
giá thành rẻ, nhanh chóng và kỹ thuật
tương đối đơn giản so với các kỹ thuật
đánh giá độ trưởng thành của tinh trùng
khác như sử dụng các chất đánh dấu sinh
học của tinh trùng trưởng thành (creatine
kinase, heat shock protein HspA2 chaperone
và hyaluronic axít).
91


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Tuy nhiên, tiêu bản nhuộm màu AB có
nhược điểm khó quan sát do tinh trùng
bình thường về ngưng tụ NST không bắt
màu thuốc nhuộm. Một số nghiên cứu
cũng đ thử nghiệm phối hợp AB với các
loại thuốc nhuộm khác như rose bengal,
janus green, eosin Y và đưa ra kết luận
kết hợp nhuộm AB với nhuộm eosin Y sẽ
quan sát tinh trùng được r ràng nhất [4].
Vì vậy, để cải tiến kỹ thuật, chúng tôi đề

xuất có thể phối hợp nhuộm AB với eosin
để tiêu bản quan sát dễ dàng hơn.
2. Mối tƣơng quan giữa ất thƣờng
ngƣng tụ NST và h nh thái tinh trùng.
Theo khuyến cáo của nhiều nghiên cứu,
nên lấy mốc có tỷ lệ tinh trùng bắt màu
thuốc nhuộm AB < 20%, coi như mẫu tinh
dịch có độ trưởng thành của tinh trùng
trong giới hạn bình thường [5]. Tuy nhiên,
để đảm bảo không bỏ sót mối tương quan
có thể có giữa các thông số về hình thái
và độ trưởng thành của tinh trùng, chúng
tôi không chia nhóm mà xét mức độ tương
quan giữa các chỉ số hình thái và bất
thường cô đặc NST.
Theo kết quả nghiên cứu, không có
mối tương quan giữa bất thường về độ
trưởng thành của tinh trùng với tỷ lệ bất
thường về hình thái của cổ và đuôi tinh
trùng. Sự biến đổi của cổ và đuôi tinh
trùng song song và độc lập với quá trình
biến đổi đầu tinh trùng nên không quan
sát thấy mối liên quan giữa bất thường
cổ và đuôi tinh trùng với bất thường cô
đặc NST.
Chúng tôi quan sát thấy có mối tương
quan thuận giữa tỷ lệ tinh trùng bất thường
về hình thái đầu và bất thường hình thái
nói chung với tỷ lệ tinh trùng bất thường
cô đặc NST, nghĩa là tỷ lệ bất thường hình

92

thái tăng, tỷ lệ bất thường cô đặc NST
cũng tăng. Nhiều tác giả cũng chỉ ra mối
tương quan giữa tỷ lệ tinh trùng chưa
trưởng thành hay bất thường cô đặc NST
và tỷ lệ tinh trùng dị dạng nói chung và dị
dạng đầu nói riêng [6, 7, 8]. Nguyên nhân
có thể do thiếu hụt protamine liên quan
tới sự toàn vẹn ADN. Có mối liên quan
chặt chẽ giữa quá trình biến đổi tạo túi
cực đầu trong quá trình sinh tinh với quá
trình cô đặc NST. Đồng thời, sai sót trong
quá trình ngưng tụ NST tinh trùng dẫn
đến suy yếu liên kết gắn acrosome với
nhân cô đặc cũng gây ra những khiếm
khuyết ở acrosome. Vì lý do này mà ít
nhiều dị dạng đầu tinh trùng có liên quan
đến bất thường ngưng tụ nhân tinh trùng.
Nhưng vì bất thường đầu tinh trùng còn
gồm nhiều dạng bất thường khác không
chỉ về nhân, hơn nữa nhiều tinh trùng có
hình thái vi thể bình thường, nhưng lại có
bất thường trong cô đặc NST, do đó mối
tương quan chúng tôi tìm được là lỏng lẻo,
hệ số tương quan với hình thái bất thường
nói chung là 0,430 và với hình thái đầu
nói riêng là 0,330.
Như vậy, có thể nhận thấy ý nghĩa của
kết quả phương pháp nhuộm AB đánh giá

mức độ cô đặc NST tinh trùng tương đối
độc lập với hình thái tinh trùng. Nhiều nghiên
cứu cũng chỉ ra những khiếm khuyết trong
đóng gói nhân tinh trùng có liên quan đến
trường hợp sảy thai nguyên phát không rõ
nguyên nhân, cũng như tỷ lệ thành công
của hỗ trợ sinh sản [9]. Do đó, có thể xem
xét nghiệm đánh giá bất thường về cô đặc
NST như một xét nghiệm độc lập, bổ sung
chẩn đoán nguyên nhân vô sinh nam,
cũng như những thất bại trong lĩnh vực
sinh sản nói chung.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
KẾT LUẬN
Nhuộm AB là phương pháp đơn giản
giúp đánh giá mức độ cô đặc NST tinh
trùng. Do mối tương quan giữa bất thường
cô đặc NST với các dạng bất thường hình
thái là lỏng lẻo, hay không có tương quan
nên có thể sử dụng phương pháp này như
một xét nghiệm độc lập đánh giá chất lượng
tinh dịch.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lewis J.D, Abbott D.W. Ausio J. A haploid
affair: core histone transitions during
spermatogenesis. Biochem Cell Biol. 2003,
81 (3), pp.131-140.
2. Hammadeh M.E, Zeginiadov T, Rosenbaum

P et al. Predictive value of sperm chromatin
condensation (aniline blue staining) in the
assessment of male fertility. Archives of
Andrology. 2001, 46 (2), pp.99-104.
3. Hekmatdoost A, Lakpour N, Sadeghi
M.R. Sperm chromatin integrity: etiologies and
mechanisms of abnormality, assays, clinical
importance, preventing and repairing damage.
Avicenna J Med Biotechnol. 2009, 1 (3),
pp.147-160.

4. Park Y.S, Kim M.K, Lee S.H et al.
Addition of eosin to the aniline blue assay to
enhance detection of immature sperm histones.
Fertil Steril. 2011, 90 (5), pp.1999-2002.
5. Esterhuizen A.D, Franken D.R, Lourens
J.G et al. Sperm chromatin parkaging as an
indicator of in-vitro fertilization rates. Hum Reprod.
2000, 15 (3), pp.657-661.
6. Zini A, Phillip S, Courchesne A et al.
Sperm head morphology is related to high
deoxyribonucleic acid stainability assessed by
sperm chromatin structure assay. Fertil Steril.
2009, 91 (6), pp.2495-2500.
7. Boitrelle F, Ferfouri F, Petit J.M et al.
Large human sperm vacuoles observed in motile
spermatozoa under high magnification: nuclear
thumbprints linked to failure of chromatin
condensation. Hum Reprod. 2011, 26 (7),
pp.1650-1658.

8. Sellami A et al. Assessment of chromatin
maturity in human spermatozoa: useful aniline
blue assay for routine diagnosis of male infertility.
Adv Urol. 2013, pp.578-631.
9. Talebi A.R, Vahidi S, Aflatoonian A et al.
Cytochemical evaluation of sperm chromatin
and DNA integrity in couples with unexplained
recurrent spontaneous abortions. Andrologia.
2012, 44 (1), pp.462-470.

93