Kết quả bước đầu nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi

TP CH Y DC HC QUN S S 6 - 2013

KT QU BC U NGHIấN CU HèNH THI PHễI SAU
SINH THIT CHN ON DI TRUYN TRC CHUYN PHễI
Nguyn Ngc Dip*; Nguyn Thanh Tựng*; Qun Hong Lõm*
TểM TT
Vic ỏnh giỏ v hỡnh thỏi phụi trong th tinh trong ng nghim cha phn ỏnh y cht
lng thc ca phụi. nõng cao cht lng trong iu tr, chn oỏn di truyn trc chuyn phụi
(Preimplantation Genetic Diagnosis/PGD) l mt trong nhng yờu cu quan trng, cp thit v thc tin.
Chỳng tụi tin hnh nghiờn cu ny nhm ỏnh giỏ thay i hỡnh thỏi ca phụi sau sinh thit. 60 phụi
c chia lm 2 nhúm. Nhúm 1: 30 phụi c sinh thit vo ngy 3, tip tc nuụi cy v lng giỏ
hỡnh thỏi phụi sau sinh thit, so sỏnh vi 30 phụi nhúm chng. Kt qu: t l mnh v bo tng, t
l phụi sng sút, t l to thnh blastocyst, ng kớnh ca phụi v dy mng trong sut thay i
khụng cú ý ngha thng kờ.
* T khúa: Hỡnh thỏi phụi; Chn oỏn di truyn; Chuyn phụi.

initial results of embryo morphology after biopsy in
preimplantation genetic diagnosis
Summary
In vitro fertilization, morphological assessment not fully reflect the true quality of the embryos.
To improve the quality of treatment, the preimplantation genetic diagnosis is one of the critical
requirements, urgent and practical. We conducted a study to examine the assessment of embryo
morphology changes after biopsy. 60 embryos were divided into 2 groups, group 1: 30 embryo
biopsy on day 3, and continue culture, morphology evaluation after biopsy, compared with the control
group embryos. Results: fragment ratio, embryo survival rate, blastocyst forming rate, the diameter of
the embryo and ZP thickness change not significantly.
* Key words: Embryo morphology; Genetic diagnosis; Embryo implantation.

T VN
Hin nay, hu nh vic la chn phụi
u da trờn nhng tiờu chun v hỡnh thỏi

ca phụi. Tuy nhiờn, vic ỏnh giỏ v hỡnh
thỏi cha phn ỏnh y cht lng thc
ca phụi, nu ch da vo cỏc thụng s v

hỡnh thỏi, kt qu iu tr th tinh ng
nghim b hn ch. Nhiu phụi cú ch s
hỡnh thỏi cao, nhng khụng lm t c
hoc khụng to ra tr kho mnh. Ngc li,
cú khi phụi cú cỏc ch s hỡnh thỏi kộm hn,
li to ra em bộ bỡnh thng. Trong nhiu
trng hp, lý do phụi khụng phỏt trin,

* Học viện Quân y
Ng-ời phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Diệp ()
Ngày nhận bài: 20/5/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/6/2013
Ngày bài báo đ-ợc đăng: 24/6/2013

33


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
không làm tổ được hoặc bị sảy thai sớm là
do chất lượng của phôi. Ví dụ, bị rối loạn về
số lượng nhiễm sắc thể gây ảnh hưởng đến
sự sống và phát triển của phôi [4].
Để nâng cao chất lượng trong điều trị
cũng như đảm bảo cho ra đời một thế hệ
khoẻ mạnh về thể lực, sáng suốt về tinh
thần, đồng thời sàng lọc một số bệnh di
truyền, việc chẩn đoán di truyền trước chuyển

phôi (PGD) là một trong những yêu cầu
quan trọng, cấp thiết và thực tiễn. Nguyên
tắc kỹ thuật của PGD dựa trên việc thực
hiện thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON)
để tạo phôi, sau đó sinh thiết phôi và phân
tích nhiễm sắc thể hoặc ADN bằng kỹ thuật
FISH, CGH hoặc PCR [2].
Kỹ thuật sinh thiết phôi là kỹ thuật xâm
lấn, đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ, chính xác.
Vì vậy, trong quá trình thực hiện có thể ảnh
hưởng đến chất lượng của phôi. Song song
với công việc hoàn thiện quy trình sinh thiết
phôi, chúng tôi tiến hành đánh giá hình thái
phôi, đồng thời theo dõi khả năng phát triển
của phôi sau sinh thiết. Trên cơ sở đó
chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm:
Đánh giá sự thay đổi hình thái của phôi sau
sinh thiết.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
- 60 phôi người còn dư khi TTTON.
Chia đối tượng nghiên cứu thành 2 nhóm:
- Nhóm I: 30 phôi sinh thiết vào ngày 3
trong quá trình nuôi cấy.
- Nhóm II: 30 phôi không sinh thiết (nhóm
chứng).
* Tiêu chuẩn lựa chọn phôi để sinh thiết:
phôi được nuôi cấy đến ngày thứ 3 trong
môi trường nuôi cấy TTTON. Phôi có tế bào

đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment)
< 20% (phôi độ III, độ IV).

* Tiêu chuẩn loại trừ: phôi giai đoạn
sớm độ I, độ II; các tế bào không đồng đều,
tỷ lệ mảnh vỡ bào tương ≥ 20%.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Kích thích buồng trứng:
- Phác đồ dài, sử dụng GnRHa để ức
chế hormon FSH, LH của tuyến yên, điều
hoà xuống 14 ngày, bắt đầu từ ngày 21 của
chu kỳ kinh. Sau đó sử dụng rFSH tái tổng
hợp kích thích nang trứng.
- Phác đồ ngắn: dùng FSH từ N2 chu kỳ
kinh.
- Phác đồ GnRH antagonists (Cetrotide,
Serono, Mỹ): bệnh nhân (BN) được kích thích
bằng FSH tái tổng hợp (Gonal-F, Serono),
có thể kết hợp với menopur từ ngày thứ 2
của chu kỳ kinh. Sử dụng antagonist sau
5 - 6 ngày dùng FSH.
HCG (5.000 - 10.000 IU Profasi, Serono;
Pregnyl, Organon) chỉ định khi có ít nhất
trên 2 nang noãn có kích thước > 17 mm.
* Đánh giá thụ tinh và quá trình nuôi cấy
phôi:
Khoảng 16 - 18 giờ sau khi tiêm tinh
trùng vào trứng, đánh giá trứng xem có thụ
tinh hay không. Nếu đã thụ tinh tạo thành
phôi sẽ xuất hiện 2 tiền nhân và 2 thể cực.

Sau đó, đánh giá phôi ghi điểm ở từng thời
điểm 36; 48 giờ sau thụ tinh. thu thập số
lượng và hình thể của nhân, tế bào phôi và
thể loại mảnh vỡ để đánh giá chất lượng
phôi [1, 3].

* Sinh thiết tế bào phôi:

34


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
Phương pháp chi tiết sinh thiết một phôi bào từ phôi đang thời kỳ phân cắt bằng tia
laser như sau: dùng kim sinh thiết hút nhẹ nhàng 1 tế bào của phôi vào ngày thứ 3 (66 - 68
giờ sau tiêm tinh trùng) khi phôi có ít nhất 4 tế bào và có số lượng mảnh vỡ không quá
30%. Sau đó, chuyển phôi lại vào môi trường nuôi cấy cho đến ngày 5 [2].
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Hình thái phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết.
Bảng 1: Hình thái phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết ở thời điểm 3 ngày tuổi.
NGÀY 3

NGÀY 4

NGÀY 5

X ± SD
(tỷ lệ mảnh vỡ bào
tương) (%)

X ± SD

(tỷ lệ phôi sống sót)

X ± SD
(tỷ lệ tạo thành blastocyst)

p

NHÓM (n = 30)

Sinh thiết (I)

8,63

92,22

89,81

p1-2 < 0,01

Chứng (II)

8,82

93,13

90,10

NGÀY

Tại thời điểm ngày 3, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tại thời điểm ngày 4, tỷ lệ phôi sống sót

và tại thời điểm ngày 5, tỷ lệ tạo thành bastocyst giữa 2 nhóm trong quá trình phát triển sau
sinh thiết khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
2. Đƣờng kính của phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết.
Bảng 2:
NGÀY

NGÀY 3

NGÀY 4

NGÀY 5

NHÓM (n = 30)

X ± SD

X ± SD

X ± SD

Sinh thiết (I)

150,20 ± 7,85

151,50 ± 6,32

152,40 ± 6,42

Chứng (II)

149,50 ± 8,15

152,50 ± 5,32

152,60 ± 7,45

p

p1-2 < 0,01

3. Độ dày màng trong suốt của phôi trong quá trình phát triển sau sinh thiết ở thời
điểm 3 ngày tuổi.
Bảng 3:
NGÀY

NGÀY 3

NGÀY 4

NGÀY 5

X ± SD

X ± SD

X ± SD

Sinh thiết (I)

16,10 ± 1,12

15,80 ± 1,13

15,70 ± 1,14

Chứng (II)

16,80 ± 1,20

16,30 ± 1,20

16,20 ± 1,22

NHÓM (n = 30)

p1-2 < 0,01

* Một số hình ảnh phôi trong quá trình
sinh thiết và nuôi cấy dưới kính hiển vi đảo

ngược Olympus gắn phần mềm trên máy
sinh thiết Saturn Active x400:

36


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
Hình 3: Phôi sau sinh thiết 36 giờ.

Hình 1: Phôi trước sinh thiết.

Hình 4: Phôi thoát màng sau sinh thiết
48 giờ.
BÀN LUẬN

Hình 2: Phôi sau sinh thiết 0 giờ.

Phương pháp kích thích buồng trứng
trong hỗ trợ sinh sản thường tạo được
nhiều trứng để thụ tinh và tạo ra nhiều phôi
cho mỗi chu kỳ điều trị. Những năm trước
đây, hầu hết các trung tâm điều trị TTTON
đều có xu hướng chuyển nhiều phôi vào
buồng tử cung để tăng tỷ lệ có thai, nhưng
đồng thời cũng làm tăng nguy cơ đa thai.
Đa thai thường liên quan nhiều đến biến
chứng cho cả mẹ và con. Ví dụ, mẹ có thể
bị tiền sản giật, chảy máu sau đẻ, phải cắt
bỏ tử cung hoặc đái đường khi mang thai,
trẻ sơ sinh dễ bị nhẹ cân, đẻ non, bại não
và các dị tật bẩm sinh. Vì vậy, hiện nay
nhiều trung tâm TTTON đang cố gắng giới
hạn số lượng phôi chuyển, có thể chuyển
đơn phôi vào buồng tử cung và giảm nguy
cơ nói trên, do ®ã giảm số lượng đa thai
đáng kể. Tuy nhiên, việc giảm số lượng phôi
chuyển lại làm giảm tỷ lệ có thai trong điều
trị hỗ trợ sinh sản. Nguồn gốc của vấn đề là
do phôi được chuyển không có khả năng
sống và phát triển như nhau. Để làm tăng tỷ

lệ có thai như mong muốn, giảm số lượng
phôi chuyển vào buồng tử cung, đồng thời
giảm tỷ lệ nguy cơ cho mẹ và con, điều cần

37


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
thiết là phải chọn lọc được phôi có khả
năng làm tổ cao nhất để chuyển phôi.
Phương pháp phổ biến được sử dụng ở đa
số các trung tâm TTTON để đánh giá phôi
tốt hay xấu phần lớn dựa vào các chỉ số
hình thái, ví dụ như số lượng, kích thước
của tế bào phôi, sự có mặt và phân bố các
mảnh vỡ bào tương, đa nhân và tốc độ
phân chia của phôi. Đánh giá phôi theo hình
thái nói trên tuy chưa thể đảm bảo được
yêu cầu quan trọng nhất là khả năng sống
và phát triển bình thường của phôi, nhưng
có ưu điểm là nhanh và dễ dàng thực hiện.
Đề tài chẩn đoán di truyền trước chuyển
phôi nghiên cứu chất lượng của phôi trước
khi làm tổ nhằm bổ sung thêm kỹ thuật
sàng lọc phôi, đồng thời sàng lọc một số
bệnh di truyền trước chuyển phôi. Trong
khuôn khổ đề tài này, đánh giá sự biến đổi
hình thái cấu trúc phôi sau sinh thiết [9] là
một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam, chưa có
công trình nào nghiên cứu một cách bài bản.

Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học và thực
tiễn, góp phần nâng cao chất lượng trong
điều trị vô sinh.
Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng
cách phân độ phôi của Andres Salumets
và CS (2001) [10], cách phân độ phôi này
đơn giản phù hợp với thời gian ngắn 2 - 3
phút khi quan sát phôi ở ngoài tủ nuôi
cấy. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy
cách đánh giá hình thái phôi này hoàn
toàn có thể tiên lượng được khả năng
sống của phôi sau sinh thiết để chuyển
cho bệnh nhân [3].
Trong nghiên cứu, chúng tôi đã chụp
ảnh tất cả phôi trước và sau sinh thiết,
tính tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi
sống sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đo độ
dày màng trong suốt và đường kính phôi.

Kết quả cho thấy cấu trúc hình thái phôi
ngày 3, ngày 5 thay đổi trước và sau sinh
thiết về đường kính phôi, độ dày màng
trong suốt không có ý nghĩa thống kê
(p > 0,05). Có thể đây là một minh chứng
cho quy trình sinh thiết phôi mà chúng tôi
đang sử dụng là ổn định, đáng tin cậy.
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với
Trương Đình Kiệt và các tác giả khác trên
thế giới [2, 5, 6].
KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu bước đầu, chúng tôi rút
ra kết luận sau:
Quy trình sinh thiết bằng tia laser và kỹ
thuật tiến hành một cách chu đáo và tỉ mỉ,
không ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như
quá trình phát triển của phôi. Thể hiện bằng
tỷ lệ mảnh vỡ bào tương, tỷ lệ phôi sống
sót, tỷ lệ tạo thành blastocyst, đường kính
của phôi và độ dày màng trong suốt thay
đổi không có ý nghĩa thống kê.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đoàn Thị Hằng. Nghiên cứu biến đổi hình
thái cấu trúc phôi người ngày 3, ngày 5 trước
đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thuỷ tinh
hóa. Luận án Tiến sỹ Y học. 2013.
2. Trương Đình Kiệt, Hồ Mạnh Tường. Thiết
lập quy trình kỹ thuật trong chẩn đoán di truyền
tiền làm tổ (PGD) các phôi TTTON. Báo cáo đề
tài cấp thành phố 4/2011.
3. Nguyễn Thanh Tùng. Nghiên cứu hình thái
cấu trúc hợp tử giai đoạn tiền nhân và phôi hai
ngày tuổi trên bệnh nhân TTTON. Luận án Tiến
sỹ Y học. 2011.
4. Gardner D.K, Lane M. Embryo culture.
Textbook of Assisted Reproductive Techniques.
2001, pp.203-222.

38

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
5. Hardarson. T Hanson C, Sjogren A. Human
embryos with uneven sized blastomeres have
lower pregnancy and implantation rates: indication
for aneuploidy and multinucleation. Human
Reproduction. 2001, 16, pp.313-318.

8. Kirstine Kirkegaard, Johnny Juhl Hindkjaer.
Human embryonic development after blastomere
removal: a time-lapse analysis. Hum Reprod.
2012, Jan, 27 (1), pp.97-105.

6. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K,
Winston RM. Pregnancies from biopsied human
preimplantation embryos sexed by Y-specific
DNA amplification. Nature. 1990, Apr 19, 344
(6268), pp.768-770.

9. Kyrou D, Popovic-Todorovic B. Does the
estradiol level on the day of human chorionic
gonadotrophin administration have an impact on
pregnancy rates in patients treated with recFSH/GnRH antagonist?. Hum Reprod. 2009,
Nov, 24 (11), pp.2902-2909.

7. Joris H, De Vos A, Janssens R, Devroey
P, Liebaers I. Comparison of the results of
human embryo biopsy and outcome of PGD
after zona drilling using acid tyrode medium or a
laser. Fertil Steril. 2006, Feb, 85 (2), pp.487-491.

10. Salumets A, Hydén-Granskog C, Suikkari
AM, Tiitinen A. The predictive value of pronuclear
morphology of zygotes in the assessment of
human embryo quality. Hum Reprod. 2001, Oct,
16 (10), pp.2177-2181.

39


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013

40