Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN VI SINH VẬT
TRONG DƯỢC PHẨM
Trương Ngọc Lan**, Nguyễn Thanh Thuận*, Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Cát Đông*

TÓM TẮT
Mở đầu: Dược phẩm cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh. Một
trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật. Thời gian xác định giới hạn vi sinh vật theo phương pháp
truyền thống là từ 5 đến 7 ngày. Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược
phẩm.
Mục tiêu: Xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dược
phẩm.
Phương pháp: Dựa trên phương pháp PCR, tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu, độ đặc hiệu và độ nhạy
của các cặp cặp mồi chung và mồi đặc hiệu, khảo sát thời gian tăng sinh thích hợp để phát hiện từng loại vi sinh
vật. Sau đó kiểm tra các thông số tối ưu bằng phản ứng RT-PCR.
Kết quả: Xác định được nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ cho các cặp mồi. Các cặp mồi đều đạt độ đặc hiệu để
phát hiện vi khuẩn, vi nấm và vi sinh vật chỉ thị và có giới hạn phát hiện tốt. Phương pháp RT-PCR rút ngắn
thời gian của kiểm tra giới hạn nhiễm vi sinh vật khoảng 5 lần so với phương pháp Dược điển.
Kết luận: Phương pháp RT-PCR thích hợp để xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm.
Từ khóa: Kỹ thuật PCR, thử giới hạn vi sinh vật, kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp nhanh.

ABSTRACT
APPLICATION OF RT-PCR TECHNIQUE FOR DETERMINATION OF MICROBIAL LIMIT TEST OF
PHARMACEUTICALS
Truong Ngoc Lan, Nguyen Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 202 - 210
Background: Microbial contamination in pharmaceutical products is one of the major causes of health risk to
consumers. Vietnamese Pharmacopoeia microbial limit test requires 5 - 7 days. RT-PCR detection of

microorganisms is a rapid, sensitive, and infallible method.
Objectives: To develop a convenient, reproducible and rapid test for microbial limit of pharmaceutical
products.
Methods: Base on PCR method, annealing temperature, Mg2+ concentration, sensitivity and specificity of the
universal and specific primers, proliferating time for microorganisms were optimized. After that, the optimal
conditions were applied to RT-PCR ( Reverse Transcriptase PCR) assay.
Results: The annealing temperature, Mg2+ concentration of primer pairs were determined. All primers are
specific to detect bacteria, fungi and indicative microorganisms and have good detection limits. RT-PCR analysis
can be used for microbial limit determination 5 times faster than the standard method.
Conclusions: RT-PCR is a suitable method for rapid and reliable detection of microbes pharmaceutical
samples.
Keywords: PCR, microbial limit test, pharmaceutical quality control, rapid method.
*Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM
Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông

202

** Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Bình Dương
ĐT: 08. 38295641 – 127
Email:

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dược phẩm là chế phẩm dùng để phòng và

Nghiên cứu Y học

nay, kỹ thuật RT-PCR đã khá phổ biến ở nước ta
và ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩn

điều trị bệnh, do đó cần phải đạt các tiêu chuẩn

đoán, xét nghiệm.

an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

bệnh. Một trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm

Các chủng vi sinh vật

các vi sinh vật, các vi sinh vật này có thể gây

Các chủng vi sinh vật sử dụng gồm các

bệnh trực tiếp hoặc gián tiếp làm hỏng dạng bào

chủng chuẩn của ATCC và các chủng được phân

chế, làm cho chế phẩm không chỉ mất đặc điểm

lập và giữ tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh:

cảm quan mà còn mất tác dụng điều trị. Dược

Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus

điển Việt Nam quy định các dạng thuốc dùng

ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC

đường uống không chứa chất bảo quản phải đạt

27853, Salmonella typhi, Streptococcus feacalis

các giới hạn về độ nhiễm khuẩn, việc xác định

ATCC 29213, Bacillus subtilis PY 79, Bacillus

giới hạn vi sinh vật được thực hiện theo phương

cereus, Shigella sp., Klebsiella sp., Candida albicans

pháp tăng sinh, và nuôi cấy trên môi trường

ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404 và

chọn lọc , tuy nhiên thời gian để có kết quả một

Monascus purpureus.

(1)

mẫu kiểm nghiệm là từ 5 đến 7 ngày, nếu mẫu
không đạt chúng ta phải lặp lại một lần nữa,
chưa kể đến phân lập vi khuẩn gây bệnh.

Phương pháp này ngoài tốn kém thời gian, kết
quả còn phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật viên
kiểm nghiệm, thuốc sẽ lưu lại kho lâu hơn, gây
tốn kém, tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành.
Trong khi hầu hết tuổi thọ các thuốc dùng
đường uống ngắn (12 đến 24 tháng).
Gần đây, các nước tiên tiến trên thế giới đã
bắt đầu áp dụng các phương pháp xác định
nhanh giới hạn vi sinh vật trong quá trình kiểm
tra để xuất xưởng. Các phương pháp này có độ
nhạy cao và được chứng minh là tương đương
với các phương pháp truyền thống, với phương
pháp này có thể giúp tự động hóa một phần và
cho kết quả khách quan hơn.
Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh
và chính xác, do đó có thể ứng dụng để xác định
số lượng vi sinh vật trên cơ sở mỗi vi sinh vật
mang số bản sao biết trước của khuôn mẫu. Hiện

Chuyên Đề Dược Khoa

Tách chiết ADN, ARN
ADN vi khuẩn được tách chiết bằng phương
pháp phenol–chloroform. Để phá vỡ tế bào,
dùng đệm ly giải BLB (EDTA 50mM, NaCl 0,1M,
pH 7,5) và lysozyme đối với vi khuẩn Gram
dương và dùng SDS 10% đối với vi khuẩn Gram
âm. ADN nấm men được chiết theo phương
pháp của Harju(4), ADN nấm mốc được chiết
theo phương pháp của Vanittanakom(2,8)

ARN vi sinh vật được tách chiết và tinh
sạch bằng kit SV total RNA isolation system
(Promega) khi đo OD600 của dịch nuôi cấy đạt
0,6-1.

Phản ứng PCR
Mồi sử dụng trong phản ứng PCR được
chọn theo hai hướng: mồi đa năng phát hiện tất
cả vi sinh vật và mồi chuyên biệt phát hiện
nhóm vi sinh vật chỉ thị như: E. coli,
Staphylococcus sp., Salmonella sp., P. aeruginosa.
Trình tự của các mồi được liệt kê trong Bảng 1.

203


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

Các phản ứng PCR được thực hiện riêng rẽ để

thăm dò ở các thông số khác nhau từ 1 – 5 mM.

tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+.

Chu trình phản ứng là 1 chu kỳ: 95oC trong 5

PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 μl

phút; 35 chu kỳ: 95oC trong 1 phút, thời gian gắn

gồm

Taq

mồi là 1 phút với các nhiệt độ khác nhau cho

dNTP

từng loại mồi, 72oC trong 2 phút và cuối cùng là

1μM/mồi

polymerase

(Sigma

(Promega);

Proligo);
0,25

1U

mM

(BioLabs); 1X PCR buffer (Promega). Mg2+ được

1 chu kỳ ở 72oC trong 5 phút.

Bảng 1. Mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Vi sinh vật chỉ thị- gen đích

Mồi

Trình tự

Sản phẩm (bp)

Vi khuẩn-16S rADN [8]

p8FPL-UF

AGTTTGATCCTGGCTCAG

798

p806R-UR

GGACTACCAGGGTATCTAAT

U340-UF

TCCTACGGGAGGCAGCAGT

U806-UR

GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT

RRF1-UF

ATCTAAATCCCTTAACGAGGAACA

RRH1-UR

CCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTT

SSU-0817-UF

TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA

SSU196-UR

TCTGGACCTGGTGAGTTTCC

UAL 754

AAAACGGCAAAGAAAAAGCAG

UAR 900

ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG

Pseud-oprLR

ATGGAAATGCTGAAATTCGGC

Pseud-oprLR

CTTCTTCAGCTCGACGCGACG

Sal-Malo2-F

GTATTGTTGATTAATGAGATCCG

Sal-Malo2-Ra

ATATTACGCACGGAAACACGTT

STAIb-F

GGAATAACGTGACATATTGTA

STAIib-R

TTCACTCGGTTTTGCTTGG

Vi khuẩn-16S rADN [6]

Vi nấm-18S rADN [8]

Vi nấm- 18S rADN [3]

E. coli-uidA [7]

P. aeruginosa- oprL [5]

Salmonella- invA [6]

Sta. sp-16S rADN [9]

Phản ứng RT-PCR

466

631

422

147

504

373

300

và 1 fg trên 10 µl để khảo sát độ nhạy của phản

Phản ứng PCR ngược (reverse transcriptase

ứng PCR. Cách quy đổi số bản sao như sau với

PCR - RT-PCR) được thực hiện với kit Ready-To-

nồng độ ADN như sau: 100 fg ADN tương

Go RT-PCR Beads (GE Healthcare) và các mồi

đương với 22 bản sao bộ gen vi khuẩn hoặc 10

như trên. ARN được chuyển thành cADN ở

bản sao bộ gen vi nấm. Các thông số phản ứng

nhiệt độ 42oC trong 15 phút sau đó các chu kỳ

như đã được thiết lập ở trên. Độ nhạy được xác

phản ứng tiến hành như đối với PCR.

định là số lượng bản sao của ADN đích thấp

Độ nhạy của phản ứng PCR
Dung dịch ADN đích đã biết được số bản
sao được pha loãng liên tiếp sao cho trong 10 µl
khuôn mẫu có chứa 2x107 bản sao đến 2 bản sao

nhất vẫn cho sản phẩm khi thực hiện phản ứng
PCR với cặp mồi tương ứng.

Thời gian tăng sinh để phát hiện các vi
sinh vật

đối với vi khuẩn và 107 đến 1 bản sao đối với vi

Khảo sát thời gian tăng sinh cần thiết sẽ giúp

nấm tương ứng với nồng độ ADN đích từ 100

làm giàu số lượng vi sinh vật trong mẫu lên đến

ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg

ngưỡng phát hiện của phương pháp PCR. Để

204

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

khảo sát thời gian tăng sinh phát hiện vi sinh vật

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

trong các mẫu dược phẩm, tiến hành gây nhiễm

Chiết tách ADN, ARN

vi khuẩn chỉ thị, nấm men, nấm mốc vào thuốc

Sản phẩm ADN, ARN chiết được có tỉ lệ

tiêm lidocain 2% với lượng vi sinh vật gây

OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2, đảm

nhiễm lần lượt từ 100 - 105 CFU/ml. Sau đó, các

bảo hàm lượng và độ tinh sạch để thực hiện

mẫu thuốc tiêm đã được gây nhiễm được tăng

phản ứng PCR. Khi chiết ADN, ARN của

sinh trong các môi trường thích hợp với từng đối

Aspergilus niger thì không loại được sắc tố đen

tượng (môi trường TSB đối với vi khuẩn, PDP

trong phần dịch nổi, tuy nhiên, kết quả này

đối với nấm mốc và YPD đối với nấm men). Sau

không ảnh hưởng khi thực hiện phản ứng PCR

khi tăng sinh, tiến hành chiết ADN ở các mốc

và RT-PCR.

thời gian 6, 9 và 12 giờ (đối với vi khuẩn và nấm
men) và 24, 48 và 60 giờ (đối với nấm mốc) và
thực hiện phản ứng PCR theo điều kiện tối ưu
trên đối với từng loại vi sinh vật.

Phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR với từng cặp mồi
với nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ theo tài
liệu tham khảo. Đối với các cặp mồi có nhiệt độ

Phát hiện sản phẩm PCR

và nồng độ Mg2+ phù hợp với tài liệu cho sản

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel

phẩm PCR rõ và đúng kích thước chúng tôi

agarose 1% ở điện thế 120V trong 20 phút, đọc

không tiến hành khảo sát lại. Với các cặp mồi

kết quả bằng phương pháp nhuộm ethidium

không cho sản phẩm PCR hoặc vạch sản phẩm

bromide. Sản phẩm điện di được chụp hình

không rõ chúng tôi tiến hành khảo sát lại nhiệt

bằng máy Dolphin (Wealtec Corp.).

độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ tối ưu. Kết quả
khảo sát nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho từng cặp

mồi như trong Bảng 2.

Bảng 2. Nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ tối ưu
Vi sinh vật

Mồi

Vi khuẩn
Vi khuẩn
Vi nấm
Vi nấm
P. aeruginosa
Salmonella
S. aureus
E. coli

U340-UF/U806-UR
P8FPL-UF/p806R-UR
RRF1-UF/RRH1-UF
SSU-0817-UF/SSU-1196-UR
Pseud-oprLF/Pseud-oprLR
Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra
STAIb-F/STAIib-R
UAL 754/UAR 900

Nhiệt độ bắt cặp
Nồng độ Mg2+
Theo tài liệu Thực nghiệm Theo tài liệu Thực nghiệm
58
58

2
2
55
55
2
2
56
53
2,5
2,5
56
52
2,5
2,5
58
64
1,5
2
55
55
1,5
3,5
46
50
3
3
(*)
50
1,5
2

(*): tài liệu không đề cập

Tính đặc hiệu của các cặp mồi
Các vi sinh vật gồm: Bacillus subtilis (Bs),
Bacillus cereus (Bc), E. coli (Ec), Klebsiella (Kle),
Pseudomonas aeruginosa (Pse), Salmonella sp (Sal),
Shigella (Shi), Staphylococcus aureus (St),
Streptococcus feacalis (Stre), Candida albicans (Ca),
Aspergillus (As), Monascus purpureus (Mo).

Chuyên Đề Dược Khoa

Mồi chung để phát hiện vi khuẩn, vi nấm
Cặp mồi p8FPL-UF/p806R-UR cho vạch
sản phẩm có kích thước 798 bp, cặp mồi U340UF/U806-UR cũng có sản phẩm PCR có kích
thước 466 bp trên vi khuẩn mà không có sản
phẩm PCR trên vi nấm thử nghiệm. Cặp mồi

205


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

SSU-0817-UF/SSU-1196-UR cho vạch sản phẩm

mồi Pseud-oprLF/Pseud-oprLR cho vạch sản

có kích thước 422 bp, tương tự, cặp mồi RRF1-

phẩm có kích thước 504 bp trên P. aeruginosa,

UF/RRH1-UF cũng có sản phẩm PCR kích

cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-R cho sản phẩm

thước 631 bp trên vi nấm mà không xuất hiện

có kích thước 373 bp trên Salmonella sp, UAL-

vạch sản phẩm trên vi khuẩn thử nghiệm tính

754/UAR-900 cho sản phẩm có kích thước 147

đặc hiệu. Vậy các cặp mồi chung khảo sát là

bp trên E. coli và STAIb-F/STAIib-R cho sản

đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn hoặc vi nấm

phẩm có kích thước 300 bp trên S. aureus và

(Hình 1).

không cho sản phẩm PCR trên các vi khuẩn, vi

Mồi phát hiện các vi sinh vật chỉ thị

nấm chứng âm. Như vậy các cặp mồi đã chọn

Phản ứng PCR chỉ cho sản phẩm trên vi

đều đạt yêu cầu về tính đặc hiệu PCR (Hình 2).

khuẩn chỉ thị tương ứng với từng cặp mồi: cặp
M

As Ca Mo Bs Ec Kle Ps

Sa Shi Sta Stre

422bp

M As Ca Mo Bs Ec Kle Ps Sal Shi Sta Stre

631bpp

SSU-0817-UF/SSU-1196-UR

RRF1-UF/RRH1-UF

M Bs Ec Kle Ps Sa Bc Sta Str Bc Shi Ca Mo As

M Bs Ec Kle Ps Sa Sh Sta Str Bc Shi As Ca Mo

798bp

466bp

p8FPL-UF/p806R-UR

U340-UF/U806-UR

Hình 1. Tính đặc hiệu của mồi chung phát hiện vi nấm và vi khuẩn

206

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
M Ps Bs Ec Kl Sal Sh Sta Stre Ca As Mo

504bp

Nghiên cứu Y học

M Sal Bs Ec Kl Ps Shi Sta Stre Ca As Mo

373bp

Pseud-oprLF/Pseud-oprLR

Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra

M Ec Bs Kl Ps Sal Sh St Stre Ca As Mo

M St Bs Ec Kl Ps Sal Sh Stre Ca As Mo

300bp

147bp

UAL754/UAR900

STAIb-F/STAIibR

Hình 2. Độ đặc hiệu trên các vi sinh vật chỉ thị

Độ nhạy của phản ứng PCR
Dãy nồng độ ADN, số bản sao bộ gen vi
khuẩn và vi nấm như Bảng 3.
Kết quả PCR cho thấy trên cả hai cặp mồi
chung phát hiện vi khuẩn có giới hạn phát
hiện tương đương nhau là 10fg ADN tương
ứng với 2 bản sao của vi khuẩn. Đối với hai
cặp mồi phát hiện vi nấm cặp mồi SSU-0817-

UF/SSU-1196-UR có giới hạn phát hiện là 100fg
ADN tương ứng với 10 bản sao của vi nấm,
nhạy hơn cặp mồi RRF1-UF/RRH1-UR có giới
hạn phát hiện là 1pg ADN tương đương 100
bản sao (Hình 3). Vậy cặp mồi SSU-0817UF/SSU-1196-UR thích hợp cho các thử
nghiệm về vi nấm trên mẫu dược phẩm.

Bảng 3. Nồng độ ADN và số bản sao bộ gen
Giếng
ADN

Số vi khuẩn
Số vi nấm

1
100ng
7
2.10
7
10

Chuyên Đề Dược Khoa

2
10ng
2.106
106

3
1ng
2.105
105

4
100pg
2.104
104

5
10pg
2.103

103

6
1pg
2.102
102

7
100fg
2.10
10

8
10fg
2
1

9
1fg
0,2
0,1

10
0
0
0

207

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học
M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

631bp

422bp

SSU-0817-UF/SSU-1196-UR
M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

RRF1-UF/RRH1-UF
10

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

798bp

466bp

U340-UF/U806-UR

p8FPL-UF/p806R-UR

Hình 3. Giới hạn phát hiện của mồi chung phát hiện vi khuẩn và vi nấm
M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

M

10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

504bp
373bp

Pseud-oprLF/Pseud-oprLR
M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra

10

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

300bp
147bp

UAL 754/UAR-900

STAIb-F/STAIib-R

Hình 4. Giới hạn phát hiện của các cặp mồi trên các vi sinh vật chỉ thị

208

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-F phát hiện
Salmonella có giới hạn phát hiện ở nồng độ ADN
10fg tương đương 2 bản sao, cặp mồi PseudoprLF/Pseud-oprLR phát hiện P. aeruginosa có
giới hạn phát hiện là 2pg tương dương với 200
bản sao, cặp mồi UAL 754/UAR900 phát hiện E.
coli có giới hạn phát hiện là 20pg tương dương
với 2.103 bản sao và cặp mồi STAIb-F/STAIib-R
phát hiện S. aureus có giới hạn phát hiện là 200pg
tương dương với 2.104 bản sao (Hình 3). Như
vậy, các mồi phát hiện Salmonella, P. aeruginosa,
vi khuẩn, vi nấm đều cho kết quả tốt, các mồi E.
coli, S. aureus có giới hạn phát hiện khá cao: 2.103,
2.104 tế bào/phản ứng. So với tiêu chuẩn Dược
điển yêu cầu phát hiện được một vi khuẩn trong
mẫu thì các cặp mồi trên không đạt. Tuy nhiên,
khi tiến hành thực nghiệm trên mẫu thuốc, việc
chiết được hoàn toàn ADN trong mẫu không thể
đạt được, thông thường chỉ sử dụng một lượng
nhỏ đem tăng sinh trước khi chiết ADN. Sau khi
tăng sinh lượng vi sinh vật sẽ đạt ngưỡng giới
hạn của tất cả các cặp mồi.
M

1

M

2

M

3

4

5

798bp

Thời gian tăng sinh để phát hiện vi sinh
vật
Kết quả thử nghiệm về thời gian tăng sinh để
phát hiện các vi sinh vật cho thấy: E. coli, P.
aeruginosa thời gian phát hiện là 6 giờ, lượng vi
khuẩn gây nhiễm là 100 CFU; Salmonella, S. aureus
là 9 giờ và lượng vi khuẩn gây nhiễm là 100. Còn
với thử nghiệm vô khuẩn: thời gian tăng sinh
của vi khuẩn là 9 giờ với lượng gây nhiễm là 100,
nấm men thời gian tăng sinh là 12 giờ với lượng
gây nhiễm là 100, nấm mốc thời gian tăng sinh là
60 giờ với gây nhiễm là 101.

Phản ứng RT-PCR
Dược điển quy định, việc kiểm nghiệm chỉ
tiêu vi sinh của các mẫu dược phẩm dựa trên các

vi sinh vật sống, do đó các thử nghiệm phát hiện
dựa trên phương pháp RT-PCR, nghĩa là tiến
hành trên các vi sinh vật sống vì ARN chỉ tồn tại
trong các tế bào sống. Tuy nhiên sử dụng ARN
không ổn định, vì số lượng bản sao của ARN
trong tế bào luôn thay đổi tùy vào từng giai
đoạn của tế bào.
6
M Ec Ps Sal Sta

631bp

466bp

Nghiên cứu Y học

422bp

504bp
373bp
300bp
147bp

Hình 5. Phản ứng RT-PCR trên mồi chung và mồi đặc hiệu
1, 2: ARN của vi khuẩn với mồi p8FPL-UF/ p806R-UR, U340-UF/ U806-UR; 3,4: ARN của Candida và Aspergillus với
mồi RRF1-UF/ RRH1-UR; 5, 6: ARN của Candida và Aspergillus với mồi SSU-0817-UF/ SSU196-UR; Ec, Ps, Sal, Sta:
ARN của vi sinh vật chỉ thị với mồi đặc hiệu.

Do vậy khi tối ưu các thông số của các cặp
mồi sử dụng, cũng như khảo sát giới hạn phát

hiện, tính đặc hiệu của mồi, thời gian tăng sinh
để phát hiện các vi sinh vật... chúng tôi tiến hành
trên khuôn mẫu là ADN và kiểm tra lại các
thông số này với khuôn mẫu là ARN. Kết quả
cho thấy các thông số của phản ứng PCR đều

Chuyên Đề Dược Khoa

thích hợp khi áp dụng lên phản ứng RT-PCR với
khuôn mẫu là ARN.

KẾT LUẬN
Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy kỹ
thuật RT-PCR để phát hiện vi sinh vật chỉ thị và
thử vô khuẩn trong dược phẩm có thời gian thực
hiện nhanh hơn khoảng 5 lần so với phương

209


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

pháp Dược điển. Ngoài ra, các yêu cầu về độ đặc
hiệu và độ nhạy đều đạt trên các cặp mồi đã
khảo sát. Như vậy, kỹ thuật PCR để xác định
giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm là hoàn
toàn khả thi.

5.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

7.

1.
2.

3.

4.

210

Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam 4. Phụ luc 13.6 Thử giới
hạn nhiễm khuẩn. PL258- PL269. Hà Nội.
Bayardelle P., Zafarullah M. (2002). Development of
oligonucleotide primers for the specific PCR-based detection
of the most frequent Enterobacteriaceae species ADN using
wec gene templates. Can J Microbiol. 48(2): 113-22.
Borneman J., Hartin R. J. (2000). PCR primers that amplify
fungal rADN genes from environmental samples. Appl
Environ Microbiol. 66(10): 4356-60.
Harju S., Fedosyuk H., et al. (2004). Rapid isolation of yeast
genomic ADN: Bust n' Grab. BMC Biotechnol. 4: 8.

6.

8.

9.

Jaffe R. I., Lane J. D., et al. (2001). Real-time identification of
Pseudomonas aeruginosa direct from clinical samples using a
rapid extraction method and polymerase chain reaction
(PCR). J Clin Lab Anal. 15(3): 131-7.
McCabe K. M., Zhang Y. H., et al. (1999). Bacterial species
identification after ADN amplification with a universal
primer pair. Mol Genet Metab. 66(3): 205-11.
Tsai Y. L., Palmer C. J., et al. (1993). Detection of Escherichia coli
in sewage and sludge by polymerase chain reaction. Appl
Environ Microbiol. 59(2): 353-7.
Vanittanakom N., Vanittanakom P., et al. (2002). Rapid
identification of Penicillium marneffei by PCR-based detection
of specific sequences on the rADN gene. J Clin Microbiol.
40(5): 1739-42.
Voytenko A. V., Kanbar T., et al. (2006). Identification of
Staphylococcus hyicus by polymerase chain reaction mediated
amplification of species specific sequences of superoxide
dismutase A encoding gene sodA. Vet Microbiol. 116(1-3):
211-6.

Chuyên Đề Dược Khoa