Xây dựng phương pháp định lượng paclitaxel trong phức chất với hydroxypropyl β cyclodextrin của thuốc tiêm truyền 30mg/5ml

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PACLITAXEL
TRONG PHỨC CHẤT VỚI HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN
CỦA THUỐC TIÊM TRUYỀN 30 mg/5 ml
Nguyễn Thanh Hà*, Lương Khánh Duy**, Lê Minh Trí**, Nguyễn Thiện Hải**, Lê Nguyễn Nguyệt Minh**

TÓM TẮT
Mục tiêu: Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ cây thông đỏ Taxus brevifolia. Hiện nay có một số chế
phẩm chứa PTX dưới dạng phức chất với hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Nghiên cứu này nhằm mục đích xây
dựng phương pháp định lượng hàm lượng PTX trong chế phẩm nghiên cứu NC-10 chứa phức chất của PTXhydroxypropyl-β-cyclodextrin.
Phương pháp: HPLC với cột pha đảo Pentafluorophenyl-propyl L43 (250 mm x 4 mm, 5 µm), đầu dò PDA,
bước sóng phát hiện 227 nm, pha động: hỗn hợp nước - acetonitrile theo tỉ lệ thể tích 55:45, tốc độ dòng: 1,2
ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, nhiệt độ cột: 25 oC, chương trình gradient dung môi.
Kết quả: nghiên cứu cho thấy phương pháp xây dựng để kiểm nghiệm PTX trong chế phẩm NC-10 có tính
đặc hiệu và tương thích tốt. Đỉnh của PTX trong mẫu chuẩn và mẫu thử ổn định với thời gian lưu tR = 11,8 ± 0,1
phút, mẫu trắng chỉ xuất hiện pic ở tR >20 phút hoàn toàn không ảnh hưởng đến kết quả định lượng, phương
pháp có độ chính xác cao với RSD=1,14%, độ lập lại trung bình là 100,57% (RSD=0,992%) với khoảng tuyến
tính là 0,1-1,32 mg/ml (phương trình hồi quy là Y=17239637,68x với R2=0,9997). Như vậy phương pháp đáp
ứng yêu cầu của quy trình kiểm nghiệm dược phẩm.
Kết luận: Kết quả cho thấy phương pháp có thể áp dụng tốt để kiểm nghiệm các chế phẩm chứa PTX tương
tự.
Từ khoá: paclitaxel, HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin

ABSTRACT
DETERMINATION PACLITAXEL IN COMPLEX
WITH HYDROXYPROPYL-β-CYCLODEXTRIN OF INFUSION 30 MG/ 5 ML
Nguyen Thanh Ha, Le Minh Tri, Nguyen Thien Hai, Luong Khanh Duy, Le Nguyen Nguyet Minh
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 368 - 373

Objectives: Paclitaxel (PTX) was originally isolated from the bark of Pacific yew tree, Taxus brevifolia.
Inclusion complexes of PTX and hydroxypropyl-β-cyclodextrin are in several commercially available
formulations. This study to aim at determination PTX’s content in complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrine
(NC-10)
Methods: HPLC method for determination of PTX in a research product (NC-10) was developed:
pentafluorophenyl-propyl L43 column (250 mm x 4 mm, 5 µm), PDA detector (227 nm), gradient mobile phase :
water:acetonitrile from 55:45 to 65:35 over 20 minutes, flow rate: 1,2 ml/min, injection volumn: 10 µl, column
temprature: 25 oC.
Results: the method demonstrated selectivity with no interfering peaks eluting near the vicinity of drug peak.
The peaks of PTX in the chromatograme of standard and sample are stable (Rt =11.8 ± 0.1 min), Rt of blanc is >

* Viện kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS. TS. Lê Minh Trí
ĐT: 0903718190
Email:

368

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

20 min. The method was validated for specificity, accuracy the developed method exhibited linearity over an
analytical range of 0,1-1,32 mg/ml with regression equation Y=17239637,68X (R2=0,9997, RSD=1,14%), the
average repeatability is 100,57% (RSD=0,992%)
Conclusion: the method demonstrated selectivity with no interfering peaks eluting near the vicinity of drug
peak.. The method was validated for specificity, accuracy and can be apply for determination of paclitaxel content

in similar pharmaceutical formulations.
Keywords: paclitaxel, HPLC, hydroxypropyl-β-cyclodextrin
HPLC), NaCl (Merck, Đức, tinh khiết phân
ĐẶT VẤN ĐỀ
tích)...
Paclitaxel (PTX), hoạt chất phân lập từ vỏ cây
Chất chuẩn: chuẩn làm việc paclitaxel của Ý,
thông đỏ Taxus brevifolia, được chứng minh
hàm lượng: 98,80%.
mang lại hiệu quả cao trong trị liệu ung thư
Mẫu thử: thuốc tiêm truyền NC-01 (mẫu
buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi và ung
nghiên cứu chứa paclitaxel 30 mg/5 ml dạng
thư cổ tử cung. PTX không hấp thu qua đường
phức với hydroxypropyl-β-cyclodextrin)
tiêu hoá nên chỉ sử dụng bằng đường tiêm
Mẫu giả dược: các chất phụ gia, tá dược
truyền tĩnh mạch. Hiện nay có rất nhiều chế
trong pha động.
phẩm chứa PTX trên thị trường và thường được
bào chế có dung môi trợ tan là Cremophor LH40.
Phương pháp nghiên cứu
Một số chế phẩm khác đắt tiền hơn chứa PTX
Điều kiện sắc ký(3)
dưới dạng phức chất với hydroxypropyl-β- Cột pha đảo Pentafluorophenyl-propyl L43
cyclodextrin nhằm giảm độc tính trên gan của
(250 mm x 4 mm, 5 µm)
Cremophor LH 40(1,2,4). Nghiên cứu này nhằm
- Đầu dò: PDA, bước sóng phát hiện 227 nm.
mục đích xây dựng phương pháp định lượng

hàm lượng PTX trong các chế phẩm chứa phức
- Pha động: hỗn hợp nước - acetonitril theo tỉ
chất của PTX- hydroxypropyl-β-cyclodextrin với
lệ thể tích 55:45
các mục tiêu sau :
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Xây dựng phương pháp định lượng PTX
trong chế phẩm tiêm truyền.
- Thẩm định phương pháp định lượng (tính
tương thích, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ
đúng) theo yêu cầu của ICH.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Hoá chất, dung môi, máy móc trang thiết bị
Trang thiết bị
Máy HPLC Shimadzu đầu dò PDA, bộ dụng
cụ lọc 0,45 µm, máy ly tâm...
Hoá chất
Paclitaxel (Cty Jingi Wen, lô 20090312, Trung
Quốc) Tween 80 (Pháp, dược dụng),
hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Roquette, Pháp),
Acetonitril, Ethanol tuyệt đối (Đức, dùng cho

Chuyên Đề Dược Học

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
- Nhiệt độ cột: 25 oC
- Chương trình Gradient dung môi
Bảng 1. Chương trình gradient dung môi

Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitril (%)
0→13
45
13→20
45→65
20→23
65
23→30
65→45

Tỉ lệ nước (%)
55
55→35
35
35→55

Tính đặc hiệu
Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch mẫu thử: hút chính xác 1 ml
dung dịch thử (có nồng độ 30 mg PTX /5 ml).
Thêm 2 ml cồn tuyệt đối. Pha loãng dung dịch
này với pha động thành 20 ml. Dung dịch sau
khi pha có nồng độ PTX là 0,3 mg/ml được lọc
qua màng 0,45 µm rồi đem định lượng.

369


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác 6 mg PTX
chuẩn, thêm 2 ml cồn tuyệt đối. Pha loãng chính
xác thành 20 ml trong pha động để thu được
dung dịch chuẩn có nồng độ PTX 0,3 mg/ml.
Dung dịch này được lọc qua màng 0,45 µm rồi
đem định lượng.
Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử như
trên nhưng không có PTX (chứa tween 80,
hydroxypropyl-β-cyclodextrin, ethanol tuyệt đối,
nước cất)
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn, mẫu thử
và mẫu trắng bằng phương pháp sắc ký đã lựa
chọn. Yêu cầu kết quả sắc ký đồ phân tích mẫu
thử phải có đỉnh PTX như mẫu chuẩn với
cùng thời gian lưu, sắc ký đồ mẫu trắng phải
không có đỉnh PTX tại thời gian lưu như mẫu
chuẩn và thử.

Sự tương thích của hệ thống
Chuẩn bị mẫu: dung dịch mẫu chuẩn và
dung dịch mẫu thử được chuẩn bị giống như
trên
Tiến hành: sắc ký 6 lần cho mỗi mẫu chuẩn
và mẫu thử theo điều kiện trên.
Tính tương thích của hệ thống được khảo sát
với các thông số sắc ký: thời gian lưu (tR); diện
tích đỉnh (S); số đĩa lý thuyết (N).

Tính chính xác
Mẫu chuẩn: pha tương tự như trên để được
dung dịch có nồng độ PTX 0,3 mg/ml.
Mẫu thử: pha PTX trong nước cất,
hydroxypropyl-β-cyclodextrin, ethanol, tween 80
để có nồng độ 0,3 mg/ml
Chuẩn bị 6 dung dịch mẫu thử có nồng độ
0,3 mg/ml như trên
Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã
khảo sát.
- Yêu cầu: phương pháp định lượng đạt độ
chính xác khi tính giá trị thống kê hàm lượng
hoạt chất được xác định trên 6 mẫu có RSD ≤ 2%.

Độ đúng
Tiến hành: Để thử độ đúng của một quy trình
thử nghiệm, thêm một lượng chất chuẩn vào
mẫu thử. Lượng chất chuẩn thêm vào tương
đương với 80%, 100%, 120% của hàm lượng hoạt
chất tương ứng trong mẫu thử. Lần lượt thực
hiện 3 mẫu thêm 80%, 100%, 120% chất chuẩn.
Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch mẹ được pha như trên (0,3
mg/ml)
- Dung dịch gốc được pha từ dung dịch mẹ
như sau : hút 2 ml dung dịch mẹ cho vào bình

Tính tuyến tính và khoảng xác định

định mức 5 ml, điền đầy đến vạch bằng hỗn hợp

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: PTX được
hòa tan trong hỗn hợp theo thể tích nước –
acetonitrile (50: 50) để được dãy nồng độ trình
bày trong bảng 4

nước-ethanol (1:1), dung dịch được lọc qua

- Tiến hành sắc ký 2 lần cho mỗi mẫu. Ghi lại
sắc ký đồ và giá trị diện tích đỉnh.
- Xác định sự tương quan giữa nồng độ và
diện tích đỉnh của các dung dịch.

màng 0,45 µm, rồi đem định lượng.
- Dung dịch chuẩn thêm vào: PTX được cân
chính xác cho vào bình định mức 20 ml, bổ sung
bằng hỗn hợp nước : ethanol (1:1) đến vạch theo
bảng 8.
- Tính tỉ lệ phục hồi lượng chất chuẩn thêm

- Vẽ đường biểu diễn sự tương quan giữa
nồng độ và diện tích đỉnh.

vào và so với tỉ lệ phục hồi lý thuyết.

- Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc
nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số và
trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của
phương trình hồi quy.

đúng khi tỷ lệ phục hồi thực nghiệm nằm

370

- Yêu cầu: Phương pháp định lượng đạt độ
trong giới hạn cho phép 98-102% tỷ lệ phục
hồi lý thuyết.

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
KẾT QUẢ VÀ BÀNLUẬN

Nồng độ (mg/ml)

Tính tương thích

0,7
0,9
1,1
1,3

Bảng 2. Giá trị thống kê các thông số sắc ký ứng với
đỉnh PTX trong mẫu chuẩn
Mẫu
STD 1
STD 2
STD 3
STD 4

STD 5
STD 6
TB
SD
RSD%

tR
11,507
11,489
11,541
11,623
11,666
11,697
11,587
0,087
0,750

S
5215573
5235917
5223867
5206310
5211583
5210498
5217291
108857
0,209

As
1,046

1,044
1,045
1,046
1,051
1,052
1,047
0,003
0,318

N
9256,417
9234,290
9277,664
9299,074
9315,946
9318,460
9283,642
33,783
0,364

Bảng 3. Giá trị thống kê các thông số sắc ký ứng với
đỉnh PTX trong mẫu thử
Mẫu
Thử 1
Thử 2
Thử 3
Thử 4
Thử 5
Thử 6
TB

SD
RSD%

tR
11,644
11,652
11,633
11,633
11,616
11,618
11,633
0,014
0,121

S
5146776
5143571
5184469
5168846
5188677
5192659
5170833
21478,49
0,415

As
1,061
1,061
1,063
1,065

1,065
1,064
1,050
0,002
0,155

N
9814,101
9810,821
9877,472
9903,311
9862,884
9896,824
9860,902
40,164
0,407

Nhận xét: độ lệch chuẩn tương đối RSD %
của các thông sắc ký trong phân tích mẫu chuẩn
và mẫu thử đều < 2%.
Kết luận: quy trình định lượng đạt tính tương
thích hệ thống của một quy trình định lượng
hoạt chất trong chế phẩm.

Tính đặc hiệu
Kết quả cho thấy phương pháp có tính đặc
hiệu, các pic của PTX trong dung dịch mẫu
chuẩn và thử có tR # 11,8±0,1 phút. Các pic của tá
dược trong mẫu placebo và trong mẫu thử
không ảnh hưởng đến việc định lượng PTX

trong chế phẩm.

Tính tuyến tính và khoảng xác định
Bảng 4. Dãy nồng độ PTX thẩm định tính tuyến tính
Nồng độ (mg/ml)
0,1
0,3
0,5

Lượng cân PTX
(mg)
10
15
10

Chuyên Đề Dược Học

Thể tích vừa đủ
(ml)
100
50
20

Nghiên cứu Y học
Lượng cân PTX
(mg)
14
18
22
26

Thể tích vừa đủ
(ml)
20
20
20
20

+ Trắc nghiệm t (phân phối Student)

Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý
nghĩa thống kê”
HA:

Bj ≠ 0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống

kê”
Nếu F < F 0,05 ⇒ chấp nhận giả thuyết H0
Nếu F > F 0,05 ⇒ chấp nhận giả thuyết HA
Bảng 5. Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh
Nồng độ (mg/ml)
0,100
0,298
0,485
0,705
0,905
1,115
1,320

Diện tích đỉnh

1766212
5218124
8465164
12591484
15719650
19326958
22778857

Bảng 6. Kết quả xử lý thống kê dựa vào công cụ
Regression (MS – Excel)
Hệ số tương quan
Hệ số a
Giá trị t1 của hệ số a
Hệ số bo
Giá trị t0 của hệ số bo
Giá trị F
Giá trị F0.05
Giá trị t0.05

0,9997
17239637,68
121,34
129930,64
1,12
14723,28
6,61
2,57

Nhận xét
F = 14723,28 > F0.05 = 6,61. Vậy phương trình

hồi qui có tính tương thích.
t0 = 1,12 < t0.05 = 2,57. Vậy hệ số bo không có ý
nghĩa.
t1 = 121,34 > t0.05 = 2,57. Vậy hệ số a có ý nghĩa
Phương trình hồi qui tuyến tính giữa độ hấp
thu và nồng độ PTX (từ 0,1 mg/ml đến 1,3
mg/ml) trong môi trường nước – acetonitrile tỉ lệ
thể tích 1 : 1, định lượng bằng phương pháp đã
chọn như sau:
Y = 17239637,68X (với R2 = 0,9997)

371


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

Kết luận: có sự tương quan tuyến tính giữa
nồng độ và độ hấp thu của paclitaxel tại bước
sóng 227 nm trong khoảng nồng độ 0,1-1,3
mg/ml trong nước : acetonitrile theo tỉ lệ thể
tích 1 : 1.

Độ đúng
Bảng 8. Lượng cân PTX pha dung dịch chuẩn thêm
vào
Ký hiệu bình
STD 80%
STD 100%

STD 120%

Tính chính xác
Bảng 7. Kết quả khảo sát độ chính xác của mẫu thử
PTX
Mẫu
Thử 1
Thử 2
Thử 3
Thử 4
Thử 5
Thử 6
TB
SD
RSD%

S
5038351
5006389
5000658
5021361
5123997
5126538
5052882,33
57578,15
1,14

PTX (mg)
9,6
12,0

14,4

- Tiến hành thêm chuẩn vào dung dịch gốc
như bảng 9
Bảng 9. Lượng chuẩn thêm vào dung dịch gốc
Lượng thêm vào so với
nồng độ bình gốc
Bình mẹ (ml)
STD 80% (ml)
STD 100% (ml)
STD 120% (ml)
Nước - ethanol (1:1) (ml) vừa
đủ

Nhận xét: Kết quả giá trị độ lệch chuẩn tương
đối RSD =1,14% < 2%. Vậy quy trình định lượng
paclitaxel trong chế phẩm bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao đạt yêu cầu về độ
chính xác của một quy trình kiểm nghiệm dược
phẩm.

80%

100%

120%

2
1
0

0

2
0
1
0

2
0
0
1

5

5

5

- Ứng với mỗi hàm lượng chuẩn thêm vào sẽ
có 3 bình được pha, dung dịch được lọc qua
màng 0,45 µm.
- Tiến hành sắc ký các mẫu đã thêm chuẩn
mỗi mẫu 3 lần lấy trung bình và 1 mẫu từ bình
dung dịch gốc.

Bảng 10. Kết quả thử nghiệm độ đúng của phương pháp
Tỷ lệ chất chuẩn Lượng chất chuẩn thêm Lượng lý thuyết Lượng tìm thấy Tỷ lệ phục hồi
thêm vào (%)
vào (mg)
(mg)

(mg)
(%)

80

100

120

0,096

0,212

0,215

101,42

0,096

0,212

0,213

100,47

0,096

0,212

0,214

100,94

0,12

0,236

0,232

98,31

0,12

0,236

0,240

101,69

0,12

0,236

0,236

100,00

0,144

0,26

0,261

100,38

0,144

0,26

0,262

100,77

0,144

0,26

0,263

101,15

Tỷ lệ phục hồi lý thuyết (%)

Kết quả thống kê

- Tỷ lệ phục hồi TB: 100,57%
- SD: 0,998
- RSD: 0,992%

98 - 102

Ghi chú : diện tích pic là kết quả trung bình của 3 lần đo

- Tỷ lệ phục hồi TB: 99,34%
- SD: 0,998
- RSD: 0,992%

mẫu đều trong khoảng cho phép (100% ± 2%).
Vậy phương pháp định lượng Paclitaxel bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đạt yêu
cầu về độ đúng.

Nhận xét: Kết quả cho thấy độ phục hồi các

372

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

Hình 1 và 2. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn paclitaxel và mẫu thử

Hình 3. Sắc ký đồ mẫu trắng chứa tá dược

KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp
xây dựng để kiểm nghiệm PTX trong chế phẩm

nghiên cứu NC-10 có tính đặc hiệu và tương
thích tốt. Đỉnh của PTX trong mẫu chuẩn và mẫu
thử ổn định với tR = 11,8 ± 0,1 phút, mẫu trắng
chỉ xuất hiện pic ở tR > 20 phút hoàn toàn không
ảnh hưởng đến kết quả định lượng, phương
pháp có độ chính xác cao với RSD = 1,14%, độ
lập lại trung bình là 100,57% (RSD = 0,992%) với
khoảng tuyến tính là 0,1-1,32 mg/ml (phương
trình hồi quy là y = 17239637,68x với R2 = 0,9997).
Như vậy phương pháp đáp ứng yêu cầu của quy
trình kiểm nghiệm dược phẩm.

Chuyên Đề Dược Học

Nghiên cứu này có mục đích xây dựng
phương pháp kiểm nghiệm chế phẩm PTX dạng
tạo phức hoà tan với hydroxypropyl-βcyclodextrin NC-10 của cùng nhóm tác giả nhằm
chuẩn bị hoàn chỉnh cho đề tài nghiên cứu bào
chế thuốc tiêm truyền chứa PTX hoà tan không
dùng chất trung gian hoà tan gây độc tính trên
gan. Kết quả cho thấy phương pháp có thể áp
dụng tốt để kiểm nghiệm các chế phẩm chứa
PTX tương tự.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.
3.
4.

Hamada H, Ishihara K, Masuoka N, Mikuni K, Nakajima N
(2006), “Enhancement of water-solubility and bioactivity
of paclitaxel using modified cyclodextrins”, Journal of Bioschience
and Bioenginerring, 102(4), 369-371.
Strickley RG (2004), “Solubilizing excipients in oral and
injectable formulations”, Pharmaceutical Research, 21(2), 201- 230.
United State Pharmacopoeia (USP34-NF29) (2012), CD-ROM.
Stella V, Mathew A (1990), “Derivatives of taxol, pharmaceutical
compositions thereof and methods for the preparation thereof”,
United States Patent, US 4 960 790.

Ngày nhận bài báo:

14.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 27.12.2012
Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

373