Nghiên cứu sàng lọc alen HLA-B*1502 dự phòng phản ứng thuốc carbamazepine thể nặng bằng phương pháp Nested-SSP-PCR

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ALEN HLA-B*1502 DỰ PHÕNG
PHẢN ỨNG THUỐC CARBAMAZEPINE THỂ NẶNG BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NESTED-SSP-PCR
Trần Văn Khoa*; Ngô Trường Giang*
Đặng Thị Hồng*, Vũ Thị Lệ**
TÓM TẮT
Mục tiêu: hoàn thiện quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502 bằng phương pháp Nested-SSPPCR để dự phòng phản ứng thuốc carbamazepine thể nặng. Đối tượng và phương pháp: 45
mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại alen HLA-B được tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng
nested-SSP-PCR, điện di sản phẩm trên gel agarose 2%, phân tích kết quả. Kết quả: trong 45
mẫu ADN, sàng lọc được 7 mẫu dương tính với HLA-B*1502. Kết luận: đã hoàn thiện được quy
trình sàng lọc gen HLA-B*1502 bằng phương pháp nested-SSP-PCR.
* Từ khóa:HLA-B*1502; Phản ứng thuốc; Carbamazepine; Nested-SSP-PCR.

Study on Screening HLA-B*1502 Allele for Prevention of
Carbamazepine-Induced Severe Drug Reactions using Nested-SSPPCR Technique
Summary
Objective: To complete a protocol for screening HLA-B*1502 gene to prevent
carbamazepine-Induced severe drug reactions using nested-SSP-PCR technique. Subjects and
methods: 45 blind blood samples with unknown HLA-B allelic types, total DNA was extracted,
amplifying HLA-B gene using nested-SSP-PCR technique, electrophoresis PCR products in 2%
agarose gel and analysis. Result: We were able to detect HLA-B*1502 in 7 of 45 samples.
Conclusion: We have completed a protocol for screening HLA-B*1502 gene using nested-SSPPCR technique.
* Keywords: HLA-B*1502; Drug reactions; Carbamazepine; Nested-SSP-PCR.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản
ứng thuốc thể nặng ngày càng giảm xuống
nhờ những nguyên tắc dùng thuốc dần
được hoàn thiện theo hướng cá thể hoá.

Tuy nhiên, số lượng các dược chất được
đưa vào điều trị lâm sàng ngày càng tăng.
Hơn nữa, khi phản ứng thuốc nặng xảy ra,
tỷ lệ bệnh nhân (BN) tử vong khá cao, tới
30%. Do đó, dự phòng phản ứng thuốc thể
nặng vẫn là một vấn đề rất đáng quan tâm.

* Học viện Quân y
** Bệnh viện TWQĐ 108
Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa ()
Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 06/09/2017

325


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017
Hiện nay, một số kháng nguyên bạch cầu
người (HLA) được sử dụng như là marker
để phát hiện phản ứng thuốc nặng: hội
chứng Stevens- Johnson (hay nhiễm độc
hoại tử). Trong các HLA này, HLA-B*1502
là một marker di truyền có liên quan chặt
chẽ tới phản ứng thuốc thể nặng khi dùng
thuốc carbamazepine, đặc biệt ở cộng
đồng người châu Á [1, 2 . Vấn đề này đã
được Chung và CS báo cáo lần đầu tiên
vào năm 2004. Cùng với các nghiên cứu
của nhiều tác giả khác, Cục Quản lý Thực

phẩm và Dược phẩm Mỹ đã khuyến cáo
các bác sỹ nên sàng lọc HLA-B*1502 trên
BN châu Á trước khi sử dụng
carbamazepine [5 . Để thực hiện được
việc này, cần có một phương pháp hiệu
quả, đơn giản, nhanh và rẻ tiền. SSPPCR là kỹ thuật được dùng khá hiệu quả
để phát hiện gen HLA-B*15. Tuy nhiên, kỹ
thuật này vẫn phải cần tới 6 tổ hợp nhân
gen đa mồi để sàng lọc [6 . Một số kít
thương mại của nước ngoài đang lưu
hành tại Việt Nam tiện nhưng giá thành
cao.
Trước thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu này với mục tiêu: Chuẩn hóa
quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502 bằng
kỹ thuật nested-SSP-PCR để dự phòng
phản ứng thuốc thể n ng trên BN sử
dụng carbamazepine
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG
PHÁPNGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
45 mẫu máu chưa biết loại alen HLA-B
chống đông bằng EDTA được thu thập tại
Học viện Quân y.
326

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Tách chiết ADN tổng số từ 45 mẫu
máu thu thập được: bằng kít tách chiết
ADN từ máu toàn phần của Qiagen.

* Tiến hành phản ứng nested-SSPPCR nhân gen HLA-B*1502:
- Vòng 1: để kiểm soát quá trình nhân
gen khi khuếch đại gen HLA-B, chúng tôi
sử dụng cặp mồi F1, R1 nhân gen IFN-γ
làm nội chứng.
+ Cặp mồi F1, R1 nhân gen HLA-B
vòng 1: cặp mồi IF, IR nhân gen IFN-γ
vòng 2. Trình tự các cặp mồi tham khảo
trên cơ sở dữ liệu IMGT/HLA bản 3.6
tháng 10 - 2011 [7].
+ Thành phần phản ứng PCR nhân
gen vòng 1: Master mix: 12,5 μl; primers
(10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: 7 μl;
mẫu: 5 μl, tổng thể tích 25 μl.
+ Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng
1: 950C trong 5 phút; tiếp theo là chu trình
touchdown theo 5 bước, mỗi ba bước
đầu gồm 5 chu kỳ: 950C trong 30 giây,
gắn mồi trong 30 giây, nối dài 720C trong
30 giây. Nhiệt độ gắn mồi được giảm dần
từ 720C, 680C, 67,10C; hai bước tiếp theo
gồm 10 chu kỳ và 20 chu kỳ, nhiệt độ gắn
mồi giảm lần lượt là 650C và 550C. Cuối
cùng là 720C trong 5 phút. Sản phẩm
PCR được điện di trên gel agarose 2%,
phân tích kết quả.
- Vòng 2: các mẫu có kết quả nhân
gen vòng 1 dương tính với cả 2 cặp mồi
HLA-B và IFN-γ, sản phẩm sẽ được dùng
làm khuôn nhân gen vòng 2. Để kiểm

soát nhân gen vòng 2, chúng tôi sử dụng


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
thêm cặp mồi kiểm soát phản ứng
nested-PCR khi nhân gen HLA-B*1502:

(10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: 7 μl;
mẫu: 5 μl, tổng thể tích 25 μl.

+ Cặp mồi F2, R2 nhân gen HLAB*1502 vòng 2; cặp mồi F3, R1 kiểm soát
phản ứng nested-PCR. Trình tự các cặp
mồi tham khảo trên cơ sở dữ liệu
IMGT/HLA bản 3.6, tháng 10-2011 [7].

+ Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng
2: 950C trong 5 phút; 30 chu kỳ 950C
trong 30 giây, 700C trong 30 giây và 720C
trong 30 giây; ổn định chuỗi cuối cùng ở
720C trong 5 phút.

+ Thành phần phản ứng PCR nhân
gen vòng 1: Master mix: 12,5 μl; primers

+ Sản phẩm PCR điện di trên gel
agarose 2%, phân tích kết quả.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả nh n gen HLA-B vòng 1.
Sản phẩm PCR vòng 1 được điện di trên gel agarose 2% trong 30 phút:

Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm nhân gen vòng 1.
((-): chứng âm; M: marker 100 bp; các dải còn lại: băng gen HLA-B vòng 1
có kích thước 430 bp và băng gen IFN-γ có kích thước 150 bp)
Tất cả các dải đều xuất hiện băng gen
IFN-γ có kích thước 150 bp, chứng tỏ
phản ứng PCR diễn ra bình thường ở tất
cả các mẫu.

đều rõ ràng, đúng kích thước thiết kế và
không xuất hiện băng phụ. Như vậy, các
điều kiện cho phản ứng nested-SSP-PCR
vòng 1 đã được tối ưu.

Trong 11 mẫu điện di trên hình, các
mẫu 39, 40, 41, 45, 48, 50 xuất hiện băng
430 bp, đây là các mẫu có alen HLA-B
thuộc loại hay gặp ở cộng đồng người
châu Á.

Sau khi nhân gen vòng 1 cho 45 mẫu
nghiên cứu, chúng tôi sàng lọc được 17
mẫu đạt yêu cầu cho nhân gen vòng 2, đó
là: 39, 40, 41, 46, 48, 50, 54, 55, 57, 65,
66, 71, 72, 73, 78, 79, 83.

Kết quả cho thấy cả 2 băng xuất hiện
khi điện di sản phẩm nhân gen vòng 1

Sản phẩm nhân gen vòng 1 được sử

dụng cho nhân gen vòng 2.
327


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017
2. Kết quả nh n gen HLA-B vòng 2
để phát hiện HLA-B*1502.
Cặp mồi R2, F2 được thiết kế đặc
trưng để nhân gen HLA-B*1502. Để kiểm
soát tình trạng thất bại nhân gen vòng 2

dẫn đến âm tính giả trong phản ứng
nested-PCR, chúng tôi dùng thêm cặp mồi
F3, R1 trong hỗn hợp nhân gen vòng 2.
Sản phẩm nhân gen vòng 2 được điện
di trên gel agarose 2%:

Hình 2: Kết quả nhân gen vòng 2 các mẫu dương tính vòng 1.
(M: marker 100 bp; các dải còn lại: sản phẩm nhân gen vòng 2
của các mẫu dương tính vòng 1)
Mặc dù, trong hỗn hợp phản ứng nhân
gen vòng 2 chỉ có 2 cặp mồi, nhưng có
thể gặp 3 băng khi điện di sản phẩm tạo
ra: băng F3, R1 có kích thước 298 bp;
băng F2, R2 có kích thước 87 bp và băng
F2, R1 có kích thước 397 bp.
Băng F3, R1 (298 bp) gặp trên tất cả
các mẫu nhân gen vòng 2, vì đây là băng
kiểm soát quá trình nested-PCR. Mẫu nào
không xuất hiện băng này cần thực hiện

lại phản ứng nhân gen.
Băng F2, R1 (397bp) có thể gặp ở các
mẫu có kiểu alen là HLA-B*1502, HLAB*1521, HLA-B*1525.
Băng F2, R2 (87 bp) chỉ xuất hiện ở
mẫu có kiểu alen là HLA-B*1502.
Như vậy, nếu sản phẩm vòng 2 xuất
hiện 3 băng có kích thước lần lượt 87 bp,
298 bp, 397 bp, xác định BN đó mang
alen HLA-B*1502.
328

Bằng kỹ thuật này, bước đầu chúng tôi
đã xác định được 7/45 mẫu nghiên cứu
(15,5%) có kiểu alen HLA-B*1502, tương
đương một số công bố tại châu Á [3, 4 ,
nhưng cao hơn ở người châu Âu da trắng
[5].
KẾT LUẬN
Đã chuẩn hóa thành công quy trình
sàng lọc alen HLA-B*1502 bằng kỹ thuật
nested-SSP-PCR phát hiện được 7/45
mẫunghiên cứu mang kiểu alen HLAB*1502.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chung WH, Hung SI, Chen YT. Human
leukocyte antigens and drug hypersensitivity.
Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2007, 7,
pp.317-323.
2. Man CB, Kwan P, Baum L et al.
Association between HLA-B*1502 allele
and antiepileptic drug-induced cutaneous

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
reactions in Han Chinese. Epilepsia. 2007, 48,
pp.1015-1018.
3. Locharernkul C, Loplumlert J, Limotai C
et al. Carbamazepine and phenytoin induced
Stevens-Johnson syndrome is associated with
HLA-B*1502 allele in Thai population.
Epilepsia. 2008, 49, pp.2087-2091.
4. Alfirevic A, Jorgensen AL, Williamson
PR, Chadwick DW, Park BK, Pirmohamed M.
HLA-B locus in Caucasian patients with
carbamazepine
hypersensitivity.
Pharmacogenomics. 2006, 7, pp.813-818.
5.
Ferrell
PB
Jr,
McLeod
HL.
Carbamazepine HLA-B*1502 and risk of

Stevens-Johnson
syndrome
and
toxic
epidermal
necrolysis:

US
FDA
recommendations. Pharmacogenomics. 2008,
9, pp.1543-1546.
6 Bunce M, O’Neill CM, Barnardo MC et
al. Phototyping: comprehensive DNA typing
for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5
& DQB1 by PCR with 144 primer mixes
utilizing sequence-specific primers (PCRSSP). Tissue Antigens. 1995, 46, pp.355-367.
7. Robinson J, Mistry K, McWilliam H,
Lopez R, Parham P, Marsh SG. The
IMGT/HLA database. Nucleic Acids Res.
2011, 39, pp.1171-1176.

329