Đánh giá và kiểm soát nhiễm ADN trong sinh thiết phôi phục vụ chẩn đoán và sàng lọc tiền làm tổ

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM SOÁT NHIỄM ADN TRONG SINH THIẾT
PHÔI PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN VÀ SÀNG LỌC TIỀN LÀM TỔ
Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Duy Bắc*; Trần Ngọc Anh*
Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Văn Điều*; Nguyễn Duy Ánh**
Nguyễn Thị Sim**; Phạm Đức Minh***; Đàm Linh Phương*; Đặng Tiến Trường**
TÓM TẮT
Mục tiêu: thiết lập kỹ thuật multiplex PCR phục vụ đánh giávà kiểm soát nhiễm trong sinh
thiết phôi phục vụ sàng lọc và chẩn đoán phôi tiền làm tổ. Đối tượng và phương pháp: xây dựng
phản ứng multiplex PCR trên mẫu gADN; tiến hành đánh giá trên 96 tế bào sinh thiết và 96
mẫu dung dịch rửa tương ứng. Kết quả: thiết lập được phản ứng multiplex PCR đủ mạnh; kết
quả đánh giá nhiễm ADN cho thấy 13,54% số mẫu media blank bị nhiễm và 87,5% số mẫu tế
bào sinh thiết phôi có chứa ADN. Kết luận: thiết lập được phản ứng multiplex PCR đủ mạnh,
đánh giá trạng nhiễm ADN ngoại lai trong sinh thiết và sàng lọc trước chuyển phôi đơn giản và
hiệu quả. Chất lượng quá trình sinh thiết và kiểm soát nhiễm đã được cải thiện đáng kể.
* Từ khóa: Kiểm soát nhiễm; Sinh thiết phôi; Multiplex PCR.

Access and Control DNA Contamination in Embryo Biopsy
Procedure for Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening
Summary
Objectives: To establish a multiplex PCR method for contamination and quality control of
embryo biopsy in PGD/PGS. Subjects and methods: Establish multiplex PCR on gDNA;
evaluation of embryo biopsy on 96 single cells along with 96 media blank samples biopsied
from the same embryos. Results: Established efficiency multiplex PCR; evaluation of embryo
biopsy showed that 13.54% of media blank samples were contaminated and 87.5% of total
single cells samples contained DNA. Conclusion: Successfully established a simple but
effective DNA contamination and quality control method by multiplex PCR in embryo biopsy and
PGS. The quality of embryo biopsy procedure and DNA were approval.
* Keywords: DNA contamination control; Embryo biopsy; Multiplex PCR.

ĐẶT VẤN ĐỀ

giá tình trạng bất thường về di truyền ở
Trong chẩn đoán và sàng lọc trước cấp độ gen đến toàn bộ nhiễm sắc thể;
chuyển sinh (PGD/S - Preimplantation Genetic lựa chọn các phôi không bất thường
Disgnosis/Screening), các phôi được đánh trước khi chuyển vào tử cung và có thai.
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Phụ sản Hà Nội
** Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Đặng Tiến Trường ()
Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017

219


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017
Các phôi tạo từ quy trình thụ tinh trong
ống nghiệm (IVF-In vitro fertilization) được
sinh thiết và thu nhận một hoặc một số tế
bào phôi phục vụ phân tích di truyền bằng
nhiều phương pháp, trong đó hầu hết đều
có giai đoạn khuếch đại bằng phản ứng
chuỗi (PCR - Polemerase Chain Reaction).
Đặc trưng của PCR trong PGD và PGS là
cực nhạy nên rất dễ nhiễm ADN ngoại lai
và khả năng mất alen (ADO - allele Dropout)
[7, 9]... Trong đó, nhiễm ADN ngoại lairất
khó kiểm soát dẫn đến chẩn đoán sai.
Nguồn ADN ngoại lai rất phong phú, nhưng

chủ yếu xảy ra trong giai đoạn trước tiến
hành PCR, đó là sinh thiết phôi và rửa tế
bào phôi [10]; ADN ngoại nhiễm có thể từ
kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc ADN
trong khu vực sinh thiết, rửa tế bào. Mẫu
media blank xuất hiện ADN cũng có thể
do quá trình sinh thiết phôi không thành
công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát
ADN vào giọt rửa. Bên cạnh đó, thành
công của sinh thiết và rửa tế bào được
đánh giá bằng sinh thiết được tế bào,
không bị vỡ; rửa tế bào đảm bảo không bị
nhiễm ADN ngoại lai. Hiện nay, có nhiều
phương pháp kiểm soát nhiễm: không sử
dụng lại vật tư cho các lần sinh thiết phôi
tiếp theo; mặc đồ bảo hộ, rửa tế bào
trong tủ hút vô trùng đặt trong phòng sạch
riêng biệt [7]; lau bề mặt thiết bị bằng khử
ADN [6]; sử dụng đầu côn có cột lọc;
dùng đèn cực tím để khử nhiễm trong tủ
hút [1, 2, 8, 3].. Tuy nhiên, các phương

pháp này chưa thể khẳng định có sự xuất
hiện ADN ngoại nhiễm hay không?. Đến
nay, các trung tâm PGD trên thế giới đều
tiến hành thử nghiệm đánh giá kết quả
sinh thiết và rửa tế bào phôi trước khi tiến
hành PGD trên lâm sàng nhằm đảm bảo
chất lượng kết quả chẩn đoán [4]. Ở Việt
Nam, đã có một số báo cáo về chẩn đoán

trước chuyển phôi nhưng chưa thấy có
nội dung nào đề cập vấn đề này. Nghiên
cứu này, kỹ thuật multiplex PCR đủ nhạy
được thiết lập và thực hành đánh giá quá
trình sinh thiết phôi, rửa tế bào thành
công và không bị nhiễm ADN ngoại lai.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu.
- ADN tổng số của đối tượng nam, nữ;
mẫu tế bào phôi và mẫu dung dịch rửa
cuối cùng của mẫu tế bào phôi tương ứng.
- Primer được tổng hợp bởi IDT (Mỹ)
(bảng 1); KOH (Sigma); tricine (Sigama);
2x PCR Master mix Solution i-Taq, PBS
(Sigma), nước tinh khiết (Invitrogen),
agarose (Merk); Redsafe (Intron).
- Thiết bị nghiên cứu: máy PCR ProFlex
(Thermo Fisher Scientific, Mỹ), máy ly tâm
lạnh Mikro 22R (Heltich, Đức), máy điện di
(Cleaver Scientific, Anh), máy chụp ảnh
gel OmniDOCi (Cleaver Scientific, Anh) và
các thiết bị khác tại Phòng Phân tích ADN,
Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân y.

Bảng 1: Thông tin 2 cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR.
o

Tên mồi

Trình tự 5’-3’

Tm ( C)

FIIX-4F [5]

ATGGGCTTGGACTTGGTATG

60,4

FIIX-4R [5]

AGCAGCTCCTCACCAGGAT

62,3

DYS14F [11]

GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC

62,7

DYS14R [11]

GCCCATCGGTCACTTACACTTC

64,5

220

Sản phẩm
318 bp
84 bp


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Giai đoạn tối ưu hóa: xác định nhiệt
độ gắn mồi tối ưu của 2 cặp mồi trong
phản ứng multiplex PCR trên 20 ng ADN
toàn hệ gen, sau đó tiến hành phản ứng
multiplex PCR trên 200 pg và 20 pg ADN
toàn hệ gen để xác định chu trình nhiệt
phù hợp và đánh giá khả năng thành
công của phản ứng multiplex PCR trên
mẫu tế bào sinh thiết từ phôi.
* Giai đoạn đánh giá quy trình sinh
thiết phôi: tiến hành phản ứng multiplex
PCR trên mẫu tế bào sinh thiết từ phôi và
mẫu media blank tương ứng nhằm xác
định sự xuất hiện của ADN. Thành phần
phản ứng multiplex PCR thể tích 25 µl
gồm: 1x PCR Master mix Solution; 0,5 µM
mỗi mồi trong cặp FIIX-4; 0,75 µM mỗi
mồi trong cặp DYS14, 20 pg gADN
(chứng dương) hoặc mẫu tế bào trong 2
µl dung dịch PBS được ly giải bằng 1,5 µl

KOH 0,6M; trung hòa bằng 1,5 µl tricine
0,6M; nước tinh khiết tùy chỉnh để phù

hợp với thể tích phản ứng là 25 µl.
Quá trình này gồm 4 lần đánh giá, mỗi
lần đánh giá trên 24 mẫu tế bào sinh thiết
từ phôi cùng với 24 mẫu media blank tương
ứng. Tế bào sau khi sinh thiết phôi đặt
trong 2,5 µl dung dịch PBS vào mỗi ống
PCR, sau đó bổ sung 1,5 µl KOH 0,6 M, ủ
65oC trong 10 phút để ly giải tế bào và sau
đó bổ sung 1,5 µl trisine 0,6 M để trung hòa.
* Địa điểm và thời gian nghiên cứu:
- Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện
Quân y; Bệnh viện Phụ sản Hà Nội; Bệnh
viện Phụ sản Trung ương.
- Thời gian: 12 - 2016 đến 6 - 2017.
* Đạo đức trong nghiên cứu:
Nghiên cứu được Hội đồng Đạo đức
trong nghiên cứu y sinh của Học viện
Quân y phê duyệt.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR trên mẫu ADN.

(Hình 1: Ảnh minh họa kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi DYS14
((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 lần lượt là các băng sản phẩm của phản ứng ở Ta
lần lượt là 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M50, M100: Marker 50 bp, 100 bp)
221


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017

Hình 2: Ảnh minh họa kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi FIIX-4
((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 lần lượt là các băng sản phẩm của phản ứng ở Ta
lần lượt là 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M100: Marker, 100 bp)
Để thiết lập được phản ứng PCR đủ nhạy nhằm xác định sự có mặt các đoạn ADN
ngoại lai, lượng ADN tương đương của một hoặc một vài tế bào, nghiên cứu đã sử
dụng cặp mồi DYS14 có 9 amplicon và Cặp mồi FIIX-4.
- Xác định Ta của các primer và Ta của phản ứng multiplex PCR.
Hình 1 và hình 2 cho kết quả nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 2 cặp mồi DYS14 và FIIX4 đều là 60oC.

Hình 3: Hình ảnh minh họa phản ứng multiplex PCR trên các mẫu ADN
có nồng độ 10 pg/µl khác nhau.
(F1-F5: sản phẩm các phản ứng PCR trên 20 pg ADN của nữ; M1-M5: sản phẩm các
phản ứng PCR trên 20 pg ADN của nữ; (-): chứng âm; M100: marker 100 bp)
222


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết
quả phản ứng PCR như nhiệt độ gắn mồi,
thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi,
hoạt động của enzym, nồng độ dNTP,
nồng độ Mg2+…Khi tối ưu hóa phản ứng
PCR, cần phải tối ưu hóa tất cả những
yếu tố đó để đạt kết quả tốt nhất. Tuy
nhiên, công việc này mất nhiều thời gian,
công sức và hóa chất. Vì vậy, thực tế tối
ưu hóa phản ứng PCR thường tiến hành
lựa chọn thành phần phản ứng tiêu chuẩn
và tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (Ta) đầu
tiên. Nghiên cứu này, đã sử dụng 2x

Master mix Solution của INtRON để tiết
kiệm thời gian và chi phí tối ưu hóa các
yếu tố liên quan tới thành phần phản ứng.
Ta của phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ

nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi và
thường hơn kém Tm từ 5-10oC. Căn cứ
vào Tm (bảng 1), chúng tôi tiến hành thử
nghiệm tối ưu hóa ở dải nhiệt 55 - 65oC.
Sau đó, tiến hành phản ứng multiplex
PCR trên mẫu ADN có nồng độ 10 ng/µl
và giảm dần xuống 100 pg/µl, 20 pg/µl kết
hợp với điều chỉnh chu trình nhiệt phù
hợp cho phản ứng multiplex PCR, kết quả
thể hiện ở hình 3; ở các mẫu g ADN của
nữ (F1 đến F5) xuất hiện sản phẩm có
kích thước 318 bp; xuất hiện 2 băng (84
bp và 318 bp) ở các mẫu gADN của nam
(M1 đến M5).
Qua nhiều thử nghiệm khác, chúng tôi
xác định được thành phần phản ứng và
chu trình nhiệt của phẩn ứng như bảng 1.

Bảng 1: Chu trình nhiệt tối ưu hóa của phản ứng multiplex PCR.
Bắt đầu

Biến tính

Gắn mồi

Kéo dài

Kết thúc

Bảo quản

95

95

60

72

72

11

Thời gian

15 phút

20 giây

30 giây

20 giây

3 phút

+∞

Số chu kỳ

1

1

1

o

Nhiệt độ ( C)

45

2. Kết quả thực nghiệm trên các tế bào sinh thiết từ phôi dƣ.
Quá trình đánh giá gồm 4 giai đoạn khảo sát, giữa các giai đoạn có hiệu chỉnh và bổ
sung các biện pháp để làm tăng tỷ lệ thu được tế bào và giảm tỷ lệ nhiễm ADN ngoại lai.

Hình 3: Hình ảnh minh họa kết quả kiểm soát ADN ngoại nhiễm và đánh giá quá
trình sinh thiết phôi ở lần 1.
(M50: marker 50 bp; 1AN, 2AN…: các mẫu media blank của các phôi số 1, 2…; 1A,
2A: các mẫu chứa tế bào sinh thiết từ các phôi 1, 2…; NC (negative control): đối chứng
âm; PC (positive control): đối chứng dương)
223


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017
Mỗi giai đoạn tiến hành thí nghiệm trên 24 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi dư cùng 24

mẫu dung dịch rửa ở giọt rửa cuối cùng tương ứng với các phôi. Theo lý thuyết, tất cả
mẫu media blank và đối chứng âm đều không có sản phẩm multiplex PCR, các mẫu
chứa tế bào sinh thiết từ phôi đều xuất hiện sản phẩm của cặp mồi FIIX-4 và một số
mẫu có thể có sản phẩm của cặp mồi DYS14, nếu trong hệ gen của tế bào có nhiễm
sắc thể Y. Các mẫu phát hiện sản phẩm của cặp mồi DYS14 hoặc FIIX-4 hoặc cả 2
được kết luận là có chứa ADN.

Hình 4: Hình ảnh minh họa kết quả kiểm soát ADN ngoại nhiễm và
đánh giá quá trình sinh thiết phôi ở lần 4.
(M50: marker 50 bp; 73AN, 74AN…: các mẫu media blank của các phôi số 73, 74…;
73A, 74A: các mẫu chứa tế bào sinh thiết từ các phôi 73, 74…; NC (negative control):
đối chứng âm; PC (positive control): đối chứng dương)
Mẫu media blank của tế bào sinh thiết từ phôi số 2, 5 có sản phẩm của cặp mồi
FIIX-4, mẫu media blank của phôi số 73, 74, 76 có sản phẩm của cặp mồi DYS14,
chứng tỏ có xuất hiện ADN ngoại nhiễm. Đối chứng âm của phản ứng multiplex PCR
đánh giá quá trình sinh thiết phôi âm tính, không phát hiện có sản phẩm của phản ứng
multiplex PCR nên có thể loại trừ trường hợp phản ứng bị nhiễm trong quá trình làm
multiplex PCR kiểm soát nhiễm. Quá trình sinh thiết phôi thành công khi trong mẫu
chứa tế bào sinh thiết từ phôi phải chứa tế bào. Điều này được khẳng định khi phát
hiện có sản phẩm của một hoặc cả 2 cặp mồi DYS14 và FIIX-4 trong các mẫu này.
Bảng 1: Kết quả kiểm soát nhiễm ADN ngoại lai và thu được tế bào trên 96 ống
chứa tế bào sinh thiết từ phôi và mẫu media blank tương ứng.
Mẫu chứa tế bào

Mẫu media blank

1
(24)

2

(24)

3
(24)

4
(24)

Tổng (96)

1
(24)

2
(24)

3
(24)

Số mẫu chứa ADN

18

20

20

22

84

5

4

2

2

13

Tỷ lệ chứa AND (%)

75,00

83,33

8,33

8,33

13,54

Giai đoạn (n)

83,33 91,67

87,50

20,83 16,67

4
Tổng (96)
(24)

Trong số 96 mẫu media blank của các tế bào sinh thiết này, tổng cộng 84/96 mẫu
tương ứng với tỷ lệ 87,5% số tế bào sinh thiết phôi có chứa ADN và 13/96 mẫu media
224


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
blank tương ứng với tỷ lệ 13,54% mẫu bị nhiễm ADN ngoại lai. Tuy nhiên, qua các lần
khảo sát, kết quả sinh thiết phôi đã có cải thiện đáng kể: tăng tỷ lệ sinh thiết phôi thành
công (lần lượt là 75%; 83,33%; 83,33%; 91,67%) và giảm số lần sinh thiết bị nhiễm
ADN ngoại lai (lần lượt là 20,83%; 16,67%; 8,33%; 8,33%; 13,54%).
KẾT LUẬN
Thiết lập được phản ứng multiplex
PCR đủ nhạy, đánh giá tình trạng nhiễm
ADN ngoại lai trong sinh thiết và sàng lọc
trước chuyển phôi đơn giản và hiệu quả.
Kết quả thu tế bào và kiểm soát nhiễm
của quá trình sinh thiết và rửa tế bào phôi
được cải thiện đáng kể.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Agrawal V, Roy N. Contaminating insert
degradation by preincubation colony PCR: a
method for avoiding false positives in
transformant screening. Anal Biochem. 2008,
375 (1), pp.159-161.
2. Champlot S, Berthelot C, Pruvost M,

Bennett E.A, Grange T, Geigl EM. An efficient
multistrategy DNA decontamination procedure
of PCR reagents for hypersensitive PCR
applications. PLoS One. 2010, 5 (9)
3. Dallas-Yang Q, Jiang G, Sladek F.M.
Avoiding false positives in colony PCR.
Biotechniques. 1998, 24 (4), pp.580-582.
4. Harper J.C, Sengupta S, Vesela K,
Thornhill A, Dequeker E, Coonen E, Morris
MA. Accreditation of the PGD laboratory. Hum
Reprod, 2010, 25 (4), pp.1051-1065.
5. Machado F.B, Medina-Acosta E. Highresolution combined linkage physical map of

short tandem repeat loci on human
chromosome band Xq28 for indirect
haemophilia A carrier detection. Haemophilia.
2009, 15 (1), pp.297-308.
6. Prince A.M, Andrus L. PCR: how to kill
unwanted DNA. Biotechniques, 1992, 12 (3),
pp.358-360.
7. Stern HJ. Preimplantation genetic
diagnosis: prenatal testing for embryos finally
achieving its potential. Journal of clinical
medicine. 2014, 3 (1), pp.280-309.
8. Tamariz J, Voynarovska K, Prinz M,
Caragine T. The application of ultraviolet
irradiation to exogenous sources of DNA in
plasticware and water for the amplification of
low copy number DNA. Journal of forensic
sciences. 2006, 51 (4), pp.790-794.

9. Thornhill A.R, Snow K. Molecular
diagnostics
in
preimplantation
genetic
diagnosis. J Mol Diagn. 2002, 4 (1), pp.11-29.
10. Thornhill A.R, Snow K. Molecular
diagnostics
in
preimplantation
genetic
diagnosis. The Journal of molecular
diagnostics: JMD. 2002, 4 (1), 11.
11. Zimmermann B, El-Sheikhah A,
Nicolaides K, HOLzGREVE W., Hahn S.
Optimized
real-time
quantitative
PCR
measurement of male fetal DNA in maternal
plasma. Clinical chemistry. 2005, 51 (9),
pp.1598-1604.

225