Định lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg 1 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013

ĐỊNH LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
Trần Quang Trung*; Trịnh Văn Lẩu**; Nguyễn Văn Bạch*
TÓM TẮT
Xây dựng phương pháp định lượng 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao (HPTLC) với các điều kiện:
+ Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254.
+ Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10.
+ Bước sóng:  = 275 nm.
* Từ khóa: Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao; Phương pháp định lượng ginsenoside.

QUANTITATIVE ANALYSIS OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 BY
HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
SUMMARY
Quantitative analysis method of ginsenoside Rb1, Re, Rg1 by high performance thin layer chromatography
was built based on the following conditions:
+ Thin layer: HPTLC silica gel 60F254.
+ Solvens system: chloroform/AcOEt/MeOH/H2O = 15/40/22/10.
+ Wavelength:  = 275 nm.
* Key words: High performance thin layer chromatography; Ginsenoside quantitative method.

ĐẶT VẤN ĐỀ

hoạt chất có trong các chế phẩm, đặc biệt

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là một
kỹ thuật hiện đại, nhưng còn khá mới ở
nước ta do trang thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên,
độ nhạy và độ chính xác cao trong phân

tích

chế phẩm có nguồn gốc dược liệu. Chúng
tôi đã tiến hành xây dựng phương pháp này
nhằm: Định tính và định lượng 3 ginsenoside
Rb1, Re, Rg1.

* Học viện Quân y
** Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW
Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm
PGS. TS. Nguyễn Văn Minh

12


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu.
* Nguyên liệu, dung môi, hoá chất:
- Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1
loại SH (hãng Chromadex, Mỹ).
- Các dung môi, hoá chất tinh khiết PA.
* Dụng cụ và trang thiết bị:
- Hệ thống HPTLC của hãng DESAGA;
bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x 10 cm;
20 x 20 cm; pipet tự động 1 - 10 l, 1 - 20 l,
100 l, 200 l, 500 l; các loại dụng cụ thuỷ
tinh có độ chính xác thích hợp.

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp:
- Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch
ginsenoside Rb1 có nồng độ 51,1875 g/ml;
ginsenoside Re có nồng độ 20,0625 g/ml
và ginsenoside Rg1 có nồng độ 51,475 g/ml.
- Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch
ginsenoside Rb1 có nồng độ 150,9375 g/ml;
ginsenoside Re có nồng độ 40,125 g/ml và
ginsenoside Rg1 có nồng độ 200,575 g/ml.
- Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch
ginsenoside Rb1 có nồng độ 250,6875 g/ml;
ginsenoside Re có nồng độ 60,1875 g/ml
và ginsenoside Rg1 có nồng độ 351,45 g/ml.
- Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch
ginsenoside Rb1 có nồng độ 350,4375 g/ml;
ginsenoside Re có nồng độ 80,25 g/ml và
ginsenoside Rg1 có nồng độ 500,55 g/ml.
- Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch
ginsenoside Rb1 có nồng độ 450,1875 g/ml;
ginsenoside Re có nồng độ 100,3125 g/ml
và ginsenoside Rg1 có nồng độ 651,425 g/ml.

- Khảo sát và lựa chọn pha động:
Tiến hành khảo sát quá trình tách
ginsenoside Rb 1, Re, Rg1 trong dung dịch
chuẩn hỗn hợp với 3 hệ dung môi sau:
chloroform/MeOH/H 2O = 13/7/2 (lớp
dưới); n-Butanol/AcOEt/H 2O = 4/1/5 (lớp
trên);

chloroform/AcOEt/MeOH/H2O
=
15/40/22/10.
Dựa vào kết quả, giá trị Rf và phổ tử
ngoại-khả kiến trên sắc ký đồ, lựa chọn
pha động phù hợp sao cho tách ginsenoside
Rb1, Re, Rg 1 cho các peak gọn và cân
xứng nhất.
* Khảo sát và lựa chọn bước sóng xác
định ginsenoside Rb1, Re, Rg1:
Dựa vào phổ hấp thụ tử ngoại của
saponin khi phun thuốc thử hiện màu, tiến
hành quét phổ UV mẫu thử và mẫu chuẩn
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 tại nhiều bước
sóng trong khoảng từ 200 - 800 nm. Trên
cơ sở phổ UV của saponin kết hợp với phổ
của mẫu chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1
tại nhiều bước sóng khác nhau, lựa chọn
bước sóng sao cho cường độ tín hiệu peak
của ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lớn nhất.
* Xây dựng phương pháp định lượng
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng HPTLC:
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
sắc ký:
Chấm 5 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 lên bản mỏng đã
chuẩn bị sẵn và tiến hành sắc ký theo điều
kiện lựa chọn. Ghi diện tích peak thu được.
Đánh giá độ thích hợp của hệ thống sắc ký
trên cơ sở xác định sai số tương đối của 5

lần chấm mẫu thử phải < 5%.

* Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:

14


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích
peak.
Pha một dãy 5 dung dịch chuẩn có nồng
độ biến thiên trong khoảng từ 51,1875 g/ml
đến 450,1875 g/ml (đối với ginsenoside Rb1),
20,0635 g/ml đến 100,3125 g/ml (đối
với ginsenoside Re) và 51,475 g/ml đến
651,425 g/ml (đối với ginsenoside Rg1).
Dựa trên điều kiện sắc ký đã chọn, chấm
lần lượt 20 l mỗi dung dịch lên bản mỏng
đã được chuẩn bị sẵn. Ghi diện tích peak
thu được.
- Xác định giới hạn định tính, định lượng
của phương pháp:
Chấm 5 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 có các nồng độ
tương ứng: 51,1875 g/ml; 20,0625 g/ml;
51,475 g/ml lên bản mỏng đã chuẩn bị sẵn
và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.
Ghi diện tích peak thu được.

- Khảo sát độ lặp lại của phương pháp:
Dung dịch chuẩn hỗn hợp ginsenoside
Rb1, Re, Rg1 trong ethanol tuyệt đối.

Hình 1: Phổ HPTLC của hỗn hợp
(Rb1, Re, Rg1) từ 200 - 800 nm (3D).
(Hệ dung môi: chloroform/AcOEt/MeOH/
H2O = 15/40/22/10).
Trên sắc phổ thu được tại bước sóng
275 nm, các peak tách gọn, cân xứng và
cường độ tín hiệu của peak ginsenoside
Rb1, Re, Rg1 lớn nhất. Vì vậy, chúng tôi
chọn bước sóng này.
* Kết quả khảo sát và lựa chọn pha động:

Chấm hỗn hợp dung dịch chuẩn ginsenoside
Rb1, Re, Rg1 lên bản mỏng sắc ký đã chuẩn
bị sẵn, tiến hành sắc ký trong điều kiện đã
chọn. Ghi diện tích peak thu được trên sắc
đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng.
Đánh giá độ lặp lại trên cơ sở xác định
độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử
song song.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1. Kết quả khảo sát và lựa chọn điều
kiện sắc ký.

Hình 2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn Rb1, Re,
Rg1 ở bước sóng 275 nm (3D).

* Kết quả khảo sát và lựa chọn bước sóng
xác định ginsenoside Rb1, Re, Rg1:

(Hệ dung môi: cloroform/AcOEt/MeOH/
H2O = 15/40/22/10).

15


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

Kết quả khảo sát hệ dung môi cho thấy: có sự tách rõ rệt giữa các vết ginsenoside Rb1,
Re, Rg1 trong mẫu thử và cho peak gọn. Có thể sử dụng hệ dung môi này để định tính và
định lượng các ginsenoside.
2. Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng
HPTLC.
* Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký:
Bảng 1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
DIỆN TÍCH PEAK (AU)
STT

Ginsenoside Rb1

Ginsenoside Re

Ginsenoside Rg1

1

187,1300

82,5000

300,4500

2

175,2300

79,4600

292,4900

3

198,8100

76,8400

320,2500

4

186,2600

74,0200

328,6200

5

190,0300

80,0200

318,0900

187,4920

78,5680

311,9800

SD

8,4638

3,2417

14,9617

RSD%

4,5142

4,1260

4,7957

Hệ thống có tính thích hợp tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 5%, phù hợp với yêu
cầu của Dược điển Trung Quốc (2005), bảo đảm định tính và định lượng ginsenoside Rb1,
Re, Rg1 trong dược liệu.
* Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng:
Bảng 2: Kết quả xác định khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak.
GINSENOSIDE Rb1
DUNG
DỊCH

GINSENOSIDE Re

GINSENOSIDE Rg1

Nồng độ
(g/ml)

Diện tích pic
(AU)

Nồng độ
(g/ml)

Diện tích pic
(AU)

Nồng độ
(g/ml)

Diện tích pic
(AU)

1

51,1875

41,5800

20,0629

14,3300

51,4750

54,3400

2

150,9375

239,7667

40,1250

100,2433

200,5750

351,7767

3

250,6875

411,3633

60,1875

178,8933

351,4500

636,6433

4

350,4375

597,0800

80,2500

248,66

500,5500

952,7067

5

450,1875

767,6867

100,3125

332,4133

651,4250

1257,9900

Phương trình hồi quy: ginsenoside Rb1: Y1 = 1,8141X1 - 43,267; ginsenoside Re:
Y2 = 3,9107X2 - 60,467; ginsenoside Rg1: Y3 = 2,0055X3 - 53,455.
Hệ số tương quan r1 = 0,9997; r2 = 0,9994; r3 = 0,9998

16


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

Kết quả trên cho thấy: trong khoảng nồng
độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính
giữa nồng độ các ginsenoside Rb1, Re và
Rg1 với diện tích peak với hệ số tương
quan bằng 0,9997; 0,9999 và 0,9998. Các
khoảng tuyến tính của 3 ginsenoside Rb1,
Re, Rg1 phù hợp để định lượng chúng.

* Kết quả xác định giới hạn định tính, định
lượng của phương pháp:

Xác định giới hạn định tính (LOD) và giới
hạn định lượng (LOQ) dựa trên đáp ứng
của dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất
trong khoảng tuyến tính và hệ số góc của
đường hồi quy.

Bảng 3: Kết quả xác định độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu chuẩn có nồng độ 51,1875 g
ginsenoside Rb1 trong ethanol.
STT
Diện tích peak

1

2

3

4

5

44,4400

39,5400

43,5400

42,2400

41,0800

Thống kê

Trung bình = 42,1680; SD = 1,9455 RSD = 4,6137

Bảng 4: Kết quả xác định hệ số góc (a) của đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và
nồng độ ginsenoside Rb1.

1

0.9997

1.8141

43.2670

2

0.9987

1.8217

32.6710

3

0.9980

1.822

35.4880

4

0.9991

1.7258

39.5520

5

0.9985

1.8531

35.1450

Trung b×nh = 1,8073
SD = 0,0480
RSD = 2,6549

Giới hạn định tính và định lượng của ginsenoside Rb1 là: 3,2368 g/ml và 10,6814 g/ml.
* Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp:
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại.

STT

LƯỢNG
CÂN THỬ

(gam)

DIỆN TÍCH PEAK (AU)

HÀM LƯỢNG (%)

Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside Ginsenoside
Rb1

Re

Rg1

Rb1

Re

Rg1

1

1,0333

992,8900

190,2800

1437,0200

1,1055

0,1241

1,4385

2

1,0253

954,9300

177,3400

1384,7900

1,0733

0,1186

1,3989

3

1,0254

958,8700

180,3000

1390,8800

1,0775

0,1201

1,4047

17


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2013
(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

4

1,0541

1064,9000

199,4900

1533,6700

1,1590

0,1261

1,5015

5

1,0309

977,4600

186,6400

1415,9800

1,0916

0,1226

1,4215

1,0338

989,8100

183,8100

1432,4680

1,1014

0,1223

1,4330

SD

44,6498

8,7309

60,2851

0,0346

0,0030

0,0413

RSD%

4,5109

4,7499

4,2085

3,1434

2,4676

2,8822

Kết quả khảo sát trên cho thấy: Độ lặp lại của hệ thống sắc ký phù hợp với yêu cầu phân tích
định lượng của Dược điển Trung Quốc (2005) với RSD < 5%.
KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Đã xây dựng phương pháp định lượng 3
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với cỏc điều kiện sau:
+ Bản mỏng: HPTLC silica gel 60F254.
+ Hệ dung mụi: chloroform/AcOEt/MeOH/
H2O = 15/40/22/10.
+ Bước súng:  = 275 nm.
- Đã xacs định được tính thích hợp của hệ
thống sắc ký HPTLC, khoảng tuyến tính, giới
hạn định tớnh, giới hạn định lượng, độ lặp lại
và khoảng tuyến tính của phương pháp.
Phương pháp này có thể ứng dụng để định
lượng các ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong
nhân sâm.

1. Viện Dược liệu. Cây thuốc và động vật làm

thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật. Tập II, 2004, tr.704-710.
2. Viện Dược liệu. Nghiên cứu thuốc từ thảo
dược. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 2006,
tr.434-450, 493-513.
3. Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW. Đảm bảo chất
lượng thuốc và một số phương phỏp kiểm nghiệm.
2007, tr.107-120, 372-392.
4. Kurt Randerath. Sắc ký lớp mỏng. Nhà xuất
bản Y học. Người dịch: Nguyễn Hữu Bảy, Trần
Trung Nam. 1974.
5. Pharmacopoeia of the Peoples’ Republic of
China. English Edition, Vol I. Chemical Industry
Press, 2005, pp.205-207, 223-225. Appendix VI,
A 38-40.

Ngày nhận bài: 10/9/2012
Ngày giao phản biện: 10/10/2012
Ngày giao bản thảo in: 28/12/2012

18