Nghiên cứu định lượng nồng độ ADN BK polyomavirus bằng kỹ thuật Tagman probe real-time PCR

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG NỒNG ĐỘ ADN BK
POLYOMAVIRUS BẰNG KỸ THUẬT TAQMAN PROBE
REAL-TIME PCR
Hoàng Xuân Sử*; Trịnh Thị Mỹ Anh**; Nguyễn Sỹ Lánh***
Phan Quốc Toản****; Nguyễn Giang Hòa****; Đinh Thị Thu Hằng*
TÓM TẮT
Mục tiêu: thiết lập được kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK
polyomavirus ADN. Vật liệu và phương pháp: kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng
nồng độ BK polyomavirus ADN trong công trình này được nghiên cứu thiết lập với cặp mồi,
probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus, Bioedit và đánh giá
bước đầu trên bộ mẫu chuẩn ADN cùng mẫu huyết tương, nước tiểu của 10 bệnh nhân sau
ghép thận có BK polyomavirus (+) và 10 mẫu máu ngoại vi của người hiến máu tình nguyện BK
polyomavirus (-). Kết quả và kết luận: phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X
QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 0,05
o
μ probe, 5 μl ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion đủ thể tích 20 μl, chu trình nhiệt: (50 C/2
o
o
o
o
phút) (95 C/15 phút) (94 C/15 giây, 58 C/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7 C. Kỹ thuật Taqman
probe real-time PCR đạt ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel mẫu với độ tin cậy 95%, bước
đầu đánh giá cho kết quả tương đương khi so sánh với kit RealStar® BKV PCR 1.0 trên
20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, góp phần chủ động trong việc theo dõi và giám sát BK
polyomavirus ở bệnh nhân sau ghép thận ở Việt Nam.
* Từ khóa: BK polyomavirus; Bệnh thận do B
Taqman probe real-time PCR.

polyomavirus; Định lượng; Ghép thận;

Quantification of BK Polyomavirus Load in Vietnamese Renal
Transplant Recipients by an In-house Taqman Probe Real-time
PCR Assay
Summary
Objectives: To establish an in-house real-time PCR assay using Taqman probe for detection
and quantification of BKV DNA load in renal transplant recipients. Materials and methods: An inhouse quantitative real-time PCR assay was established with specific primer pairs and Taqman
probe targeting VP1 gene of BKV using Primer3plus and Bioedit. We also initially evaluated
performance of the developed assay on 10 fold serial dilutions of plasmid DNA inserted VP1
gene sequence of BKV as well as clinical specimens collected from 10 recipients infected with
* Học viện Quân y
** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia
*** Bệnh viện Việt Đức
**** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng ()
Ngày nhận bài: 27/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/05/2018
Ngày bài báo được đăng: 30/05/2018

29


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
BKV after renal transplantation and peripheral blood samples from 10 healthy blood donors
negative for BKV DNA. Results and conclusion: The optimization of real-time PCR assay had
the following components: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Germany); 0 05 μM
probe, 5 μl DNA template, and deionized H2O equals to 20 μl, was performed using the Rotoro
o
GeneQ instrument with the cycling conditions as follows: 50 C for 2 mins, denaturation at 95 C
o
o

for 15 mins, followed by 45 cycles of amplification at 94 C for 15s, 58 C for 60s. In the
developed assay, the limit of detection is 1 copy/µl on DNA panel at 95% confidence. In
conclusion, this Taqman probe real-time PCR assay achieved a concordant result with the
RealStar BKV PCR 1.0 kit on 20 clinical specimens contributes to monitoring and surveilance
of BKV of kidney transplant recipients in Vietnam.
* Keywords: BK polyomavirus; BK polyomavirus-associated nephropathy; Quantification;
Renal transplantation; Taqman probe real-time PCR.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hơn 40 năm đã qua kể từ khi B
polyomavirus (BKV) lần đầu tiên được
phân lập từ nước tiểu của một bệnh nhân
(BN) ghép thận (viết tắt là BK) bị hẹp niệu
quản [2], nhưng loài virut cơ hội này vẫn
cần được nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ
chế bệnh học của nhiều bệnh liên quan.
BKV là thành viên của nhóm nhỏ
Polyoma của Papovaviruses, bao gồm
BKV, JC virut và Simian 40 virut (SV-40),
là một loại virut khá phổ biến với tỷ lệ
huyết thanh dương tính ở trẻ em trung
bình 80% [4].
Nhiễm B V thường không có triệu
chứng lâm sàng, tuy nhiên một số triệu
chứng cũng được ghi nhận là sốt và viêm
đường hô hấp trên thể nhẹ [5]. Sau khi
nhiễm nguyên phát, B V vẫn còn tiềm ẩn
ở nhiều cơ quan trong cơ thể, đặc biệt
trong các tế bào biểu mô niệu đạo và biểu
mô thận. hi cơ thể trong tình trạng bị ức

chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch qua
trung gian tế bào có liên quan đến tái hoạt
động và sao chép của virut, dẫn đến kích
hoạt một chuỗi phản ứng và phân giải tế
bào [6]. Ở BN ghép thận, sau khi BKV
nhân lên, đi vào các mao mạch, xuất hiện
trong nước tiểu (viruria) và tấn công bộ
30

phận ghép, dẫn đến tổn thương khác
nhau. hoảng 1/3 số BN có viruria sẽ
phát triển B V trong máu (viremia), nếu
không được can thiệp kịp thời sẽ phát
triển thành bệnh thận do B V (B Vassociated nephropathy, B VN) với tỷ lệ
dao động 1 - 10%, dẫn đến thải ghép, mất
chức năng thận ghép [5]. Việc tái hoạt
động của BKV ở người nhận ghép thận
với dấu hiệu thường gặp là virut phát tán
trong nước tiểu với tỷ lệ 20 - 60% BN [6].
Trong khi đó, ở những người khỏe mạnh
hay BN có khả năng miễn dịch, hiện
tượng tái hoạt động của B V và xuất hiện
B V viruria rất hiếm. Ngoài liên quan đến
thận ghép, B V thường gặp ở người
nhận ghép tủy xương [7], hay một số báo
cáo cũng cho thấy B V và B V viruria ở
BN ghép tạng không phải thận như ghép
tim, phổi và gan. Nhìn chung, BKV có mặt
trong máu hoặc nước tiểu không liên
quan đến suy giảm chức năng thận ở

những BN này [4, 5, 8, 9].
Như vậy, đến nay BKV được khẳng
định là nguyên nhân quan trọng hàng đầu
dẫn đến B VN ở BN sau ghép thận 4].
Hiện tượng mất mô thận ghép thấy ở
45% BN BKVN [10]. Chính vì vậy, việc
chẩn đoán sớm và ức chế hoàn toàn BKV


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
nhân lên sau ghép thận là đích điều trị
cuối cùng nhằm hồi phục cả chức năng
và hình thái của thận ghép. Định lượng
nồng độ BKV ADN bằng real-time PCR có
giá trị trực tiếp trong phát hiện tái hoạt
động của virut cũng như giám sát điều trị
[1]. BKV với hệ gen là ADN dạng vòng,
kích thước 5,13 kb, trong đó gen VP1 mã
hóa cho viral protein 1 thường sử dụng
trong chẩn đoán. Cho đến nay, chưa có
nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về
B V được công bố ở Việt Nam. Một số
cơ sở y tế đã sử dụng kít thương mại như
Realstar BKV PCR (Altona Diagnostics,
Đức), Artus® BK Virus RG PCR Kit
(Qiagen, Đức)… xác định tải lượng BKV
ADN, tuy nhiên giá thành các kít này rất
cao, đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ
và chưa đề cập đến khía cạnh các kít này
có thể không phù hợp với một số chủng

BKV ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi
thực hiện công trình này nhằm: Thiết lập
được kỹ thuật Taqman probe real-time
PCR định lượng nồng độ BKV ADN, góp
phần chủ động trong việc theo dõi và
giám sát BKV ở BN sau ghép thận.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Mẫu bệnh phẩm.
Lựa chọn mẫu máu ngoại vi (06 mẫu,
ký hiệu PB 1, 2, 5, 7, 8, 10), nước tiểu
(04 mẫu, ký hiệu PBK3, 4, 6, 9) của
10 BN sau ghép thận có BKV (+), trong
đó 1 BN B VN (PB 10) được khẳng định
bằng mô bệnh học kết hợp với phân tích
trình tự gen VP1 của BKV, 9 BN còn lại
khẳng định bằng semi-nested PCR theo
Arthur và CS [11] (nhóm bệnh) và 10 mẫu
máu ngoại vi của người hiến máu tình

nguyện BKV (-) (nhóm chứng). Các mẫu
bệnh phẩm được cung cấp nhờ hợp tác
nghiên cứu giữa Viện Nghiên cứu Y
Dược học Quân sự, Học viện Quân y và
Khoa Thận, Lọc máu - Bệnh viện Quân y
103, Học viện Quân y, Bệnh viện Hữu
nghị Việt Đức và Bệnh viện Trung ương
Huế.
2. Thiết lập kỹ thuật Taqman probe
real-time PCR.

200 µl mẫu huyết tương, cặn nước
tiểu được sử dụng để tách chiết BKV
ADN theo quy trình bộ kit GeneJET
Whole Blood Genomic DNA Purification
Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ), thu
100 µl mẫu ADN. Cặp mồi, Taqman
probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1
sử dụng phần mềm Primer3plus và
Bioedit dựa trên trình tự tham chiếu của
gen VP1 BKV đã công bố trên Genbank
có tên qBK-F/R, qBK-Pr và đặt Hãng IDT,
Mỹ tổng hợp, có trình tự qBK-F: 5’TAGGCGCCAACCATTAGAC-3’; qB -R:
5’- ACGTAATGGCACTTGCTCG-3’; qB -Pr:
5’-FAM- GAGCAGCCGCAGCCCATATAGGCBHQ1-3’. Quá trình tối ưu kỹ thuật realtime PCR bao gồm khảo sát trên chu trình
nhiệt, trong đó lần lượt đánh giá nhiệt độ
gắn mồi khác nhau; tối ưu các thành
phần tham gia trên cơ sở phản ứng realtime PCR tiêu chuẩn. Phản ứng real-time
PCR có thành phần như sau: 1X
QuantiTect Probe PCR Master Mix
(Qiagen, Đức); 0,2 - 0,5 μ mồi xuôi, mồi
ngược mỗi loại, 0,05 - 0,3 μ probe, 5 μl
ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion
DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl.
Quá trình khuếch đại thực hiện trên máy
real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen,
Đức) với chu trình: (50oC/2 phút)
31


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

(95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 56 60oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.
Kết quả real-time PCR tối ưu được lựa
chọn tại giá trị khảo sát cho chu kỳ
ngưỡng thấp nhất.
3. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR
định ƣợng nồng độ BKV ADN.
* Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định
lượng nồng độ BKV ADN trên bộ mẫu
chuẩn ADN:
Bộ mẫu chuẩn ADN được thiết lập từ
mẫu plasmid tinh khiết pGEMT-VP1 pha
loãng trong nước khử ion tạo dải nồng độ
100 - 108 (copy/µl). Plasmid pGEMT-VP1
này thiết lập qua con đường tái tổ hợp,
chứa trình tự gen VP1 của BKV phân lập
từ BN BKVN và khẳng định bằng giải
trình tự [2]. Bộ mẫu chuẩn ADN là cơ sở
để đánh giá kỹ thuật real-time PCR thiết
lập cũng như xác định nồng độ BKV ADN.
* Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định
lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm
sàng:
Kỹ thuật real-time PCR được khảo sát
trên 10 mẫu BKV ADN của BN sau ghép
thận có BKV (+) và 10 mẫu BKV (-) là
huyết tương người khỏe mạnh hiến máu
tình nguyện đã xác định BKV (-) bằng
semi-nested PCR theo Arthur và CS [11].
Đồng thời, chúng tôi định lượng BKV
ADN đối chứng với bộ kít thương mại

RealStar® BKV PCR 1.0 (Altona
Diagnostics, Đức) có chứng chỉ CE-IVD
[12].
Tất cả các thử nghiệm tối ưu và định
lượng đều tiến hành lặp lại ít nhất 2 lần,
xác định giá trị trung bình, mỗi lần chạy
đều có chứng âm là nước khử ion và
chứng dương.
32

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Thiết lập và tối ưu kỹ thuật real-time
PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN.
Kỹ thuật real-time PCR được thiết lập
và tối ưu trên mẫu chứng dương là huyết
tương BN sau ghép thận bị BKVN. Sử
dụng phần mềm chuyên dụng để thiết kế
một bộ mồi, probe hoàn toàn mới cho kỹ
thuật Taqman probe real-time PCR có
khả năng xác định BKV ADN phù hợp với
các chủng của Việt Nam và quốc tế. Để
hiệu suất phản ứng real-time PCR lý
tưởng, chúng tôi lần lượt tối ưu các điều
kiện cũng như thành phần phản ứng.

a.

b
Hình 1: Biểu đồ khuếch đại tối ưu kỹ thuật
real-time PCR phát hiện BKV AND.

(A: Tối ưu nồng độ mồi. 1 - 4: Nồng độ
mồi tương ứng là 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 µM;
dc: Đối chứng âm là nước kh ion; B: Tối
ưu nồng độ probe từ 0,05 - 0,3 µM)


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Từ kết quả hình 1A cho thấy: nồng độ
mồi cho giá trị Ct sớm nhất 0,2 µ . Như
vậy, đây là nồng độ mồi tối ưu cho phản
ứng real-time PCR BKV. Trên cơ sở nồng
độ mồi tối ưu, nồng độ probe được khảo
sát ở các mức 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 µM. ết
quả cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM là

nồng độ thấp nhất mà vẫn cho kết quả
đáng tin cậy. Do đó, nồng độ probe tối ưu
được lựa chọn cho phản ứng real-time
PCR BKV ADN là 0,05 µM (hình 1B). Chu
trình nhiệt tối ưu được xác định như sau:
(50oC/2 phút) (95oC/15 phút) (94oC/15 giây,
58oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.

Bảng 1: Thành phần tối ưu của kỹ thuật real-time PCR.
Thành phần

STT

Nồng độ cuối

Thể tích (µ )

1X

10

1

QuantiTect Probe PCR master mix

2

qBK-F/R 5 µM

0,2 µM

0,8

3

Probe qBK-Pr 5 µM

0,05 µM

0,2

4

Nước khử ion DNA/RNAase free

-

4

5

BKV ADN

5
Tổng

2. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR
định ƣợng nồng độ BKV ADN.
Trong công trình này, trên cơ sở có
sẵn mẫu chuẩn dương plasmid tái tổ hợp
chứa gen đích VP1, lựa chọn mẫu
plasmid có nồng độ, độ tinh sạch cao
(nồng độ 1010 copies/µl, A260/280: 2,01
được xác định bằng máy đo quang phổ
Nanodrop ND-1000) làm mẫu chuẩn.
Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ
đồng bộ cao nhất và có thể pha loãng
thành các nồng độ chính xác, cũng là
hướng thiết lập được WHO và NIBSC
(National
Institute
for
Biological
Standards and Control, Viện Quốc gia về
Kiểm chuẩn Sinh học) khuyến cáo. Các

mẫu plasmid có dải nồng độ 100 - 108
(copies/µl) được chia nhỏ thành nhiều

20

ống, mỗi ống chứa ADN plasmid đủ
dùng cho 1 phản ứng, bảo quản ở điều
kiện -20oC. Kỹ thuật real-time PCR sau
khi tối ưu đánh giá trên bộ mẫu chuẩn
BKV ADN này cho hiệu suất phản ứng
PCR đạt 103,7%, sai số 0,005 - các giá
trị gần như lý tưởng, cho thấy quy trình
tối ưu real-time PCR cũng như thao tác
kỹ thuật tốt, bộ mẫu chuẩn đạt nồng độ
có độ chính xác cao. Theo tính toán,
ngưỡng phát hiện của kỹ thuật real-time
PCR trên mẫu chuẩn ADN thiết lập này
có thể đạt 1 copy/µl với độ tin cậy 95% ngưỡng đạt được ở một số kít thương
mại hiện nay (dữ liệu không trình bày).
Đây là cơ sở để đánh giá kỹ thuật realtime PCR định lượng nồng độ BKV ADN
trên các mẫu lâm sàng (hình 2).
33


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018

Hình 2: Biểu đồ khuếch đại định lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm sàng và
đường chuẩn standard curve bằng kỹ thuật real-time PCR phát triển.
(SK2-SK4: 3 mẫu chuẩn với nồng độ lần lượt là 103; 102; 101 (copies/µl); PBK1-PBK3:
Các mẫu bệnh phẩm BK (+); NC: Đối chứng âm là nước kh ion)

Bước đầu, chúng tôi đã đánh giá đồng thời kỹ thuật real-time PCR phát triển (đặt
tên là kít LDA_BK) và bộ kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0 (Hãng Altona) trên
các mẫu lâm sàng gồm 10 mẫu bệnh phẩm dương tính với BKV và 10 mẫu âm tính.
Kết quả giá trị trung bình các lần thử nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm B V dương tính
được thống kê theo bảng 2, còn 10 mẫu âm tính đều không xuất hiện tín hiệu huỳnh
quang với cả 2 bộ kít.
Bảng 2: Nồng độ các mẫu bệnh phẩm B V dương tính.
Nồng độ copy/ m
STT

Mã

Kít
LDA_BK

Kít Altona

Log copy/ ml
Kít
LDA_BK

Kít Altona

Sự khác
biệt ( og)

Hệ số biến
thiên
CV% (log)

1

PBK1

1.88E+04

1.36E+04

4.27

4.13

0.14

2.37

2

PBK2

2.90E+04

1.69E+04

4.46

4.23

0.24

3.84

3

PBK3*

9.98E+08

5.1E+08

9.00

8.71

0.29

2.33

4

PBK4*

1.10E+07

1.01E+07

7.04

7.00

0.04

0.39

5

PBK5

5.16E+03

5.13E+02

3.71

2.71

1.00

22.1

6

PBK6*

9.45E+08

2.08E+08

9.98

9.32

0.66

4.82

7

PBK7

1.70E+03

1.35E+03

3.23

3.13

0.10

2.23

8

PBK8

1.13E+06

3.67E+05

6.05

5.56

0.49

5.95

9

PBK9*

2.48E+05

1.21E+05

5.39

5.08

0.31

4.2

10

PBK10

3.24E+04

1.70E+04

4.51

4.23

0.28

4.53

(*: Mẫu nước tiểu)
34


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
Từ kết quả đánh giá cho thấy, kỹ thuật
real-time PCR định lượng nồng độ BKV
ADN được phát triển đã xác định trên 10
mẫu bệnh phẩm BKV (+), kết quả tương
đương so với kít thương mại RealStar®
BKV PCR 1.0, thể hiện qua khác biệt về
số log giữa 2 giá trị nồng độ (sử dụng
2 kít khác nhau) và hệ số biến thiên
(CV%) cùng một mẫu. Giá trị nồng độ được
xác định bằng kít LDA_BK từ 103 - 108
copies/ml. Chỉ có một mẫu PBK5 nồng độ
khác biệt là 1 log, CV 22,1%, điều này có
thể được lý giải do 2 bộ kít khác nhau về
chiến lược thiết kế mồi, các bộ mẫu
chuẩn, cũng như sai khác giữa những lần

thao tác. Đồng thời, do số lượng mẫu
đánh giá trong công trình này còn hạn
chế nên chưa thể khẳng định sự khác
biệt của một mẫu là PB 5 có ý nghĩa
thống kê hay không.
Phát hiện B V viremia bằng kỹ thuật
real-time PCR được khẳng định có giá trị
chẩn đoán dương tính và giá trị chẩn
đoán âm tính cao hơn cho B VN so với
phát hiện viruria bằng xét nghiệm tế bào
decoy hay PCR. Tuy nhiên, tương tự như
xét nghiệm real-time PCR trong theo dõi
tải lượng virut khác, hiện có sự khác biệt
đáng kể trong cách phát triển kỹ thuật dẫn
đến khó khăn khi so sánh kết quả giữa
phòng thí nghiệm khác nhau cũng như
xác định một giá trị ngưỡng trong chẩn
đoán và điều trị B VN. Tuy nhiên, Hirsch
và CS đã xác định mức nồng độ B V
ADN > 104 copies/ml huyết tương trong
hơn 4 tuần ở BN sau ghép thận có liên
quan đến B VN với độ đặc hiệu 93% 9],
giá trị này được nêu trong các hướng dẫn
gần đây 6 . huyến nghị này cũng được
các trung tâm trên thế giới sử dụng và

khảo nghiệm, sai khác về nồng độ được
chấp nhận ít nhất 1 log.
Ghép thận là phương pháp điều trị
thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho BN

bệnh thận mạn giai đoạn cuối. Ở nước ta
ước tính có khoảng 80.000 BN bị bệnh
thận mạn giai đoạn cuối và mỗi năm
khoảng 4.000 BN có nhu cầu ghép thận.
Việc theo dõi điều trị BN sau ghép thận
đóng vai trò quan trọng trong duy trì chức
năng thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy
cơ mất mô ghép hay suy chức năng thận
ghép. Nguyên nhân dẫn đến suy chức
năng của thận ghép đồng loại chủ yếu do
BKV nhân lên trong tế bào biểu mô ống
thận, làm tổn thương, hoại tử ống thận
trực tiếp. Ống thận hoại tử tỷ lệ với BKV
nhân lên, tuy nhiên khi BKV nhân lên bị
giới hạn trong vùng tủy thận sẽ không làm
ảnh hưởng đến chức năng thận ghép. Do
đó, ở giai đoạn sớm này của bệnh rất khó
xác định biểu hiện của BKVN. Chỉ khi
BKV bắt đầu nhân lên xảy ra ở vùng vỏ
thận, có mối liên quan rõ với hoại tử tế
bào biểu mô ống thận và nồng độ
creatinin huyết thanh tăng. Cơ chế dẫn
đến rối loạn chức năng mô ghép thận
đồng loại được xác định là do rò rỉ và
nước tiểu chảy ngược từ ống thận bị tổn
thương vào khoang kẽ và mao mạch
quanh ống thận. Do đó, tổn thương và
hoại tử ống thận cấp là dấu hiệu quan
trọng của BKVN.
BKV hoạt động và BKVN phát triển

phụ thuộc vào hiệu quả điều trị giảm liều
thuốc ức chế miễn dịch và đáp ứng miễn
dịch kháng virut của cơ thể chủ. Diễn biến
của tái hoạt động BKV phát hiện trực tiếp
bằng xác định tải lượng BKV ADN hỗ trợ
phát hiện gián tiếp qua theo dõi đáp ứng
35


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018
miễn dịch đặc hiệu với B V. Do đó, sử
dụng kỹ thuật real-time PCR tối ưu xác
định tải lượng BKV ADN giúp theo dõi,
giám sát chỉ số này trong máu và nước
tiểu, là công cụ rất có giá trị trong tiên
lượng BKVN, cần được nghiên cứu phát
triển ở Việt Nam.

renal transplantation. Lancet. 1971, 1 (7712),
pp.1253-1257.

KẾT LUẬN

5. Sharma R et al. BK virus in kidney
transplant: Current concepts, recent advances,
and future directions. Exp Clin Transplant.
2016, 14 (4), pp. 377-384.

Đã thiết lập thành công kỹ thuật
Taqman probe real-time PCR định lượng

nồng độ BKV ADN trong huyết tương,
nước tiểu ở BN sau ghép thận với
ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel
mẫu, độ tin cậy 95%. Phản ứng real-time
PCR tối ưu có thành phần: 1X QuantiTect
Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức);
0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại,
0,05 μ probe, 5 μl ADN khuôn, nước
khử ion DNAase/RNAse free đủ thể tích
20 μl, với chu trình nhiệt được thực hiện
trên máy real-time PCR Rotor-Gene Q
(Qiagen, Đức). Kỹ thuật real-time PCR
này bước đầu được đánh giá cho kết quả
tương đương so với kít RealStar® BKV
PCR 1.0 trên 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

3. Reploeg M.D, G.A Storch, D.B Clifford.
BK virus: a clinical review. Clin Infect Dis.
2001, 33 (2), pp.191-202.
4. Sawinski D. S. Goral. BK virus infection:
an update on diagnosis and treatment. Nephrol
Dial Transplant. 2015, 30 (2), pp.209-217.

6. Pavlakis M. A, Haririan, D.K. Klassen.
BK virus infection after non-renal transplantation.
Adv Exp Med Biol. 2006, 577, pp.185-189.
7. Loeches B et al. BK virus in liver
transplant recipients: a prospective study.
Transplant Proc. 2009, 41 (3), pp.1033-1037.
8. Remund K.F, M Best,

J.J. Egan.
Infections relevant to lung transplantation.
Proc Am Thorac Soc. 2009, 6 (1), pp.94-100.
9. Hirsch H.H et al. Polyomavirusassociated
nephropathy
in
renal
transplantation: critical issues of screening
and management. Adv Exp Med Biol. 2006,
577, pp.160-173.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

10. Bohl D.L, D.C. Brennan. BK virus
nephropathy and kidney transplantation. Clin J
Am Soc Nephrol. 2007, 2 Suppl 1, pp.S36-46.

1. Đinh Thị Thu Hằng, Hoàng Xuân S .
Đặc điểm kiểu gen của BK polyomavirus trên
bệnh nhân sau ghép thận ở miền Bắc Việt
Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN. Khoa học
Y Dược. 2018, tập 34, số 1 tr.1-6.

11. Arthur R.R, S. Dagostin, K.V. Shah.
Detection of BK virus and JC virus in urine
and brain tissue by the polymerase chain
reaction. J Clin Microbiol. 1989, 27(6): pp.
1174-9.

2. Gardner S.D et al. New human

papovavirus (B.K.) isolated from urine after

12.
RealStar®
BKV
PCR
Kit
1.0_. 2016.

36