Bước đầu áp dụng kỹ thuật multiplex PCR tìm đột biến mất đoạn trên vùng AZF của nhiễm sắc thể Y ở một số bệnh nhân nam vô sinh vô căn

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TÌM ĐỘT BIẾN
MẤT ĐOẠN TRÊN VÙNG AZF CỦA NHIỄM SẮC THỂ Y
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NAM VÔ SINH VÔ CĂN
Nguyễn Minh Hà*

TÓM TẮT
Mở đầu: Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y là một nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ
không nhỏ mà hiện nay đã có thể phát hiện được và Phòng xét nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử
Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch đã hoàn thiện được một số điều kiện kỹ thuật của xét nghiệm này.
Mục tiêu: Bước đầu áp dụng kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến mất đoạn vùng AZF cho một số bệnh
nhân nam vô sinh.
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Bệnh nhân nam vô sinh vô căn, người Việt Nam (hoặc gốc Việt
Nam). DNA bộ gen được ly trích từ bạch cầu và được chạy 2 phản ứng Multiplex PCR cùng lúc, mỗi phản ứng
khuếch đại 5 đoạn DNA đích. Các cặp mồi sử dụng phát hiện được 95% trường hợp mất đoạn trên các vùng
AZF. Chứng nam, chứng nữ và chứng nước được chạy song song với mỗi mẫu DNA bệnh nhân.
Kết quả: Áp dụng kỹ thuật xét nghiệm trên 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu và tìm
được 9 bệnh nhân nam đột biến (tỷ lệ 12,8%). 8 trường hợp mang đột biến tại vùng AZFc, chỉ có 1 trường hợp
đột biến tại AZFb.
Kết luận: Đây là một xét nghiệm có độ tin cậy tốt, tính ứng dụng cao, có thể tiến hành làm thường quy ở
các phòng xét nghiệm tại nước ta để chẩn đoán, tiên lượng và phòng ngừa cho bệnh nhân nam vô sinh.
Từ khóa : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor)

ABSTRACT
INITIAL APPLYING OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE TO DETECT AZF MICRODELETION
OF Y CHROMOSOME IN IDIOPATHIC INFERTILE MEN
Nguyen Minh Ha * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 217 - 219
Background: The AZF microdeletion of Y chromosome is a frequently infertile cause that can be detected

now. The laboratory of Biochemistry and Molecular biology Department-Pham Ngoc Thach Medical University
has optimized some technical conditions of this test.
Objectives: Initial applying Multiplex PCR technique to detect AZF microdeletion of Y chromosome in
some idiopathic infertile men.
Method: Vietnamese idiopathic infertile male patients. Genomic DNA is extracted and purified from
leucocytes and is run two multiplex PCR. Each PCR amplifies five target sequences. The primers detect 95% of
AZF microdeletion cases. Male, female and blank control are run at same time with each DNA sample.
Results: Detection of 9 microdeletion cases in 70 idiopathic infertile males (12.8%). 8 patientss have the
AZFc microdeletion and only 1 patient has AZFb microdeletion.
Conclusion: The test is reliable and high applicable. As the results that we can run it routinely at our
laboratories for diagnosis, prognosis and prevention for infertile male patients.
Keywords: Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor)
∗

Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Minh Hà
ĐT: 0989001581.

Chuyên Đề Ngoại Khoa

Email:

217


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đột biến mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc
thể Y đã được xác định có liên quan đến tình
trạng rối loạn sinh tinh và gián đoạn trưởng
thành tinh trùng. Trước đây chưa có kỹ thuật
phát hiện thường quy loại đột biến này cho các
bệnh nhân nam đến khám tại các khoa Hiếm
muộn và Nam khoa. Bên cạnh đó, theo một số
nghiên cứu tại Châu Á, tần suất đột biến này
trong khoảng 8-10% (trong quần thể bệnh nhân
nam vô sinh vô căn)(1,2,3,6,7). Vì vậy, đây là một
nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ không nhỏ
mà hiện nay đã có thể phát hiện được. Phòng xét
nghiệm Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử
Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch đã
hoàn thiện được một số điều kiện kỹ thuật của
xét nghiệm này. Do đó, trước khi áp dụng
thường quy tại các phòng xét nghiệm ở nước ta,
chúng tôi tiến hành kỹ thuật Multiplex PCR để
tìm đột biến mất đoạn vùng AZF cho một số
bệnh nhân nam vô sinh.

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bệnh nhân nam người Việt Nam (hoặc gốc
Việt Nam), bị vô sinh vô căn, được chẩn đoán tại
khoa Hiếm Muộn BV. Từ Dũ. Tiêu chuẩn chẩn
đoán: bệnh nhân bình thường về lâm sàng và
nhiễm sắc thể đồ (46,XX), chẩn đoán vô sinh dựa
trên tiền căn (vợ chồng trong độ tuổi sinh sản
sau 1 năm (vợ < 35 tuổi) hoặc 6 tháng (vợ ≥ 35
tuổi) chung sống thực sự, không áp dụng biện

pháp tránh thai nào mà vẫn không thể có thai và
sinh con) và tinh dịch đồ (không thỏa tiêu chuẩn
bình thường nào của tinh dịch đồ. Tinh dịch đồ
được thực hiện hai lần cách nhau 2 tuần với thời
gian kiêng xuất tinh trước thử từ 3 đến 5 ngày.
Mẫu tinh dịch được hướng dẫn lấy đúng quy
cách và được tiến hành đánh giá tại Phòng Xét
Nghiệm Tinh Trùng (Khoa Hiếm Muộn BV Từ
Dũ) theo tiêu chuẩn WHO năm 1999.
Bệnh nhân được gửi đến Phòng xét nghiệm
Bộ môn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường
Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch để làm xét
nghiệm. 3mL máu ngoại biên được chống đông

218

bằng EDTA. Ly trích DNA bộ gen từ tế bào bạch
cầu với tỷ số tinh khiết từ 1,8 – 2,0. Mỗi mẫu
DNA được chạy 2 phản ứng Multiplex PCR
cùng lúc, mỗi phản ứng khuếch đại 5 đoạn DNA
đích (gồm 2 đoạn gen ZFY, SRY là chứng nội tại
và 3 đoạn gen thuộc 3 vùng AZFa, b, c). Các cặp
mồi sử dụng phát hiện được 95% trường hợp
mất đoạn trên các vùng AZF. Chứng nam,
chứng nữ (DNA của một người nam và người
nữ bình thường) và chứng nước được chạy song
song với mỗi mẫu DNA bệnh nhân. Nồng độ
trong một phản ứng của Mg2+ là 6,5mM, của mồi
là 2µmol mỗi loại và của dNTPs là 0,3mM.
Lượng DNA sử dụng là 200ng/phản ứng. Chu

kỳ nhiệt phản ứng là 950C 6’ , 940C 30’’ , 550C
30’’, 720C 60’’ , 35 chu kỳ, 720C 10’. Chạy điện di
ở 100V , 40 phút , gel agarose 2,5% , chất phát
quang ethidium bromide, thước đo 100 đôi base.
Đọc kết quả dưới đèn UV và chụp hình lưu lại.
Bảng 1: Các đoạn gen được khuếch đại trong phần
phản ứng
Đoạn khuếch đại

Phản ứng 1

Phản ứng 2

ZFY ( chứng)
SRY (chứng)
sY86 ( AZFa)
sY127 ( AZFb)
sY254 (AZFc)
ZFY ( chứng)
SRY (chứng)
sY84 ( AZFa)
sY134 ( AZFb)
sY255 (AZFc)

Kích thước (đôi
base)
495
472
320
274

380
495
472
326
301
126

KẾT QUẢ
Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật xét nghiệm
trên 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn
chọn mẫu và tìm được 9 bệnh nhân nam đột
biến (tỷ lệ 12,8%). 8 trường hợp mang đột biến
tại vùng AZFc, chỉ có 1 trường hợp đột biến tại
AZFb.
Bảng 2:
ZFY
SRY

495 bp
472 bp

ZFY
SRY

495 bp
472 bp

Chuyên Đề Ngoại Khoa

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
sY86 (AZFa)
sY127 (AZFb)
sY254 (AZFc)

320 bp
274 bp
380 bp

sY84 ( AZFa)
sY134 (AZFb)
sY255 (AZFc)

326 bp
301 bp
126 bp

Hình 1: Kết quả xét nghiệm trên DNA bệnh nhân.
M: thước đo 100 đôi base – Giếng 1: DNA bệnh nhân
không mất đoạn - Giếng 2: DNA bệnh nhân mất đoạn
AZFc - Giếng 3: DNA bệnh nhân mất đoạn AZFb Giếng 4: chứng nam – Giếng 5: chứng nữ - Giếng: nước
cất

Ở hình 1, giếng số 1, DNA bệnh nhân có
đủ 5 vạch tương ứng 5 đoạn được khuếch đại
trên mỗi phản ứng, do đó bệnh nhân không bị
đột biến. Ở giếng số 2, DNA bệnh nhân mất
vạch ở vị trí khoảng 380 đôi base (tương ứng
sY254 của AZFc) trên phản ứng 1 và vạch ở vị
trí khoảng 126 đôi base (tương ứng sY255 của

AZFc) trên phản ứng 2. Do đó bệnh nhân bị
mất đoạn tại AZFc. Ở giếng số 3, DNA bệnh
nhân mất vạch ở vị trí khoảng 274 đôi base
(tương ứng sY127 của AZFb) trên phản ứng 1
và vạch ở vị trí khoảng 301 đôi base (tương
ứng sY134 của AZFb) trên phản ứng 2. Do đó
bệnh nhân bị đột biến tại AZFb.

Chuyên Đề Ngoại Khoa

Nghiên cứu Y học

KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã áp dụng thành công kỹ thuật
Multiplex PCR để tìm đột biến mất đoạn cho 70
bệnh nhân nam vô sinh vô căn và tìm được 9
trường hợp đột biến (8 trường hợp mất đoạn
vùng AZFc, 1 trường hợp mất đoạn vùng
AZFb). Với kết quả trên, chúng tôi nhận thấy
đây là một xét nghiệm có độ tin cậy tốt, tính ứng
dụng cao, có thể tiến hành làm thường quy ở các
phòng xét nghiệm tại nước ta để chẩn đoán, tiên
lượng và phòng ngừa cho bệnh nhân nam vô
sinh. Chúng tôi hy vọng rằng kỹ thuật này sẽ
được đón nhận bởi các bác sỹ khoa Hiếm Muộn
và Nam khoa, hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp
theo xác định nguyên nhân di truyền trong vô
sinh nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Carvalho C.M., Zuccherato L.W. et al (2006). Study of AZFc
partial deletion gr/gr in fertile and infertile Japanese males. J
Hum Genet. 51 : 794-799.
Chiang H.S., Yeh S.D., Wu C.C. et al (2004). Clinical and
pathological correlation of the microdeletion of Y
chromosome for 334 patients with azoospermia and severe
oligoasthenospermia. Asian J Androl. 6 : 369 – 375.
Dada R., Gupta N. P. and Kucheria K. (2007). Molecular
screening for Yq microdeletion in men with idiopathic
oligozoospermia and azoospermia ; J. Biosci. 28: 163 – 168.
Simoni M., Bakker E., Krausz C. (2004). EAA/EMQN best
practice giudelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal
microdeletions. State of the art 2004. Int. J. Andro. 27:240-249.
WHO (1999). WHO laboratory manual for the examination of
human semen and sperm-cervical mucus interaction ( 14th
edition).

Yang Y., Zhang S.Z et al (2003). Studies on molecular
epidemiology of Y chromosome azoospermia factor
microdeletions in Chinese patients with idiopathic
azoospermia or severe oligozoospermia. Zhonghua Yi Xue Yi
Chuan Xue Za Zhi.5 : 385 – 389.
Yung-Ming L., Ying-Hung L., Yen-Ni T. et al (2008). Genebased creening for Y chromosome deletions in Taiwanese
men presenting with spermatogenic failure. Fertil. Steril. 77 :
897 – 903.

219