Xây dựng phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa bụp giấm bằng quang phổ UV-VIS

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL
TOÀN PHẦN TRONG ĐÀI HOA BỤP GIẤM
(Hibiscus sabdariffa L.) BẰNG QUANG PHỔ UV-VIS
Trần Huy Hoàng*; Phạm Văn Hiển*; Đặng Trường Giang*
Nguyễn Hoàng Ngân*; Vũ Bình Dương*; Phạm Quốc Bình**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài
hoa Bụp giấm bằng quang phổ UV-VIS. Phương pháp: định lượng polyphenol toàn phần bằng
phương pháp đo quang dựa trên phản ứng tạo màu với thuốc thử folin-ciocalteu; thẩm định
phương pháp định lượng theo Hướng dẫn của ICH. Kết quả: đã thẩm định phương pháp trên
các tiêu chí: tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác.
Các tiêu chí đều đáp ứng yêu cầu của phương pháp định lượng theo quy định. Kết luận: đã xây
dựng và thẩm định được phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa Bụp
giấm bằng quang phổ UV-VIS.
* Từ khóa: Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.); UV-VIS; Polyphenol toàn phần.

UV-VIS Spectrometry Quantification of Total Polyphenols from
Calyces of Hisbicus Sabdariffa L.
Summary
Objectives: To validate a quantitative analysis procedure of total polyphenols in the calyces
of Hisbicus sabdariffa L. using UV-VS method. Methods: Determining total polyphenols using
UV-VIS method based on reaction between polyphenols and folin-ciocalteu reagent; validate
this procedure according to ICH guidelines. Results: The quantitative analysis was performed by
reaction between total polyphenols and folin-ciocalteu reagent with detective wavelength of 765
nm; the method was ensured to the system suitability testing, precision, linearity, recovery,
accuracy. Conclusion: The quantitative analysis procedure of total polyphenols from Hisbicus
sabdariffa using UV-VIS method was validated.
* Keywords: Hibiscus sabdariffa L.; UV-VIS; Total polyphenol total.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Bụp giấm có tên khoa học Hibiscus
sabdariffa L., họ Bông (Malvaceae). Người
ta thường dùng đài hoa có vị chua làm
gia vị thay giấm, chế nước giải khát, siro.
Lá dùng như chất thơm, kết hợp với đài

hoa, quả để trị bệnh Scorbut. Theo nghiên
cứu ban đầu của chúng tôi, nhóm hoạt
chất chính trong đài hoa Bụp giấm là
polyphenol. Kết quả này cũng phù hợp
với nghiên cứu của các tác giả trên thế giới
[2]. Polyphenol là nhóm hợp chất quan trọng,

* Học viện Quân y
** Học viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương2978 ()
Ngày nhận bài: 10/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/09/2017
Ngày bài báo được đăng: 26/09/2017

7


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
có nhiều tác dụng: chống oxy hóa, chống
ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp [3].
Cây Bụp giấm được sử dụng nhiều trong
thời gian gần đây ở Việt Nam. Tuy nhiên,
dược liệu này chưa có chuyên luận trong
Dược điển Việt Nam IV. Việc định lượng

polyphenol toàn phần trong đài hoa Bụp
giấm có ý nghĩa quan trọng trong kiểm
tra, kiểm soát chất lượng của dược liệu.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị.
Nguyên liệu
Đài hoa cây Bụp giấm (Hibiscus
sabdariffa L.,) do Công ty TNHH Hồng
Đài Việt, Quận 4, TP. Hồ Chí Minh cung
cấp, đạt TCCS.
* Hóa chất và dung môi:
- Chất chuẩn axít gallic, hàm lượng
≥ 98% (Công ty Sigma Aldrich, Mỹ).
- Thuốc thử folin-ciocalteu (Công ty
Sigma Aldrich, Mỹ).
- Các dung môi, hóa chất trong phòng
thí nghiệm: ethanol, natri carbonat… đạt
tiêu chuẩn phân tích.
* Thiết bị:
- Tủ sấy dược liệu.
- Máy đo hàm ẩm tự động SHIMADZU
MOC 63u (Nhật).
- Máy đo quang UV-Vis Biochrom Libra
S70 PC (Anh).
- Cân phân tích Metler độ chính xác
0,1 mg (Thuỵ Sỹ).
- Máy chiết siêu âm gia nhiệt Sineo,
Uwave - 1.000 (Trung Quốc).
- Pipet chính xác, bình định mức các loại.

- Cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm
các loại và dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn
phòng thí nghiệm.
8

2. Phương pháp nghiên cứu.
Định lượng polyphenol toàn phần
trong dịch chiết dược liệu bằng phương
pháp đo quang sau khi phản ứng với
thuốc thử folin-ciocalteu [4, 5]. Hàm
lượng polyphenol toàn phần được tính
theo axít gallic.
- Dung dịch chuẩn axít gallic: cân
chính xác 10,0 mg axít gallic chuẩn, hòa
tan trong nước cất để được 100 ml dung
dịch chuẩn gốc (nồng độ 100 µg/ml).
- Dung dịch thử: cân 0,5 g dược liệu
(độ ẩm 9,34%) cho vào bình cầu, chiết
bằng thiết bị chiết siêu âm ở nhiệt độ
600C, thời gian 30 phút bằng 60 ml nước
cất. Lọc thu dịch chiết, định mức 50 ml
bằng nước cất (dung dịch thử T).
- Phản ứng với thuốc thử folinciocalteu: hút chính xác 1,0 ml dung dịch
thử cho vào ống nghiệm, thêm 5,0 ml
thuốc thử folin-ciocalteu đã chuẩn bị ở
trên, lắc đều trong 2 phút. Để yên ở nhiệt
độ phòng trong 10 phút. Thêm 4,0 ml
dung dịch Na2CO3 7,5%. Lắc đều trong
2 phút, đậy kín, để yên ở nhiệt độ phòng
trong 60 phút.

* Thẩm định phương pháp:
Thẩm định theo quy định của ICH [6]
các chỉ tiêu sau:
+ Độ chọn lọc đặc hiệu.
+ Tính tương thích hệ thống.
+ Xác định khoảng tuyến tính: trên một
dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 10 50 µg/ml. Xây dựng phương trình hồi quy
biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa
nồng độ và độ hấp thụ.
Yêu cầu: R2 ≥ 0,99.
+ Độ đúng: sử dụng phương pháp
thêm chuẩn, sau đó xác định độ thu hồi.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
Tỷ lệ % tìm lại chuẩn được xác định theo công thức:
Tỷ lệ (%) tìm lại =

=

+ Độ chính xác: chuẩn bị các mẫu chuẩn ở 3 mức nồng độ. Mỗi nồng độ chuẩn bị
3 mẫu. Xác định nồng độ theo đường chuẩn của mẫu trong cùng 1 ngày và khác ngày.
+ Tính toán kết quả: từ độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ polyphenol toàn
phần trong các dung dịch thử theo axít gallic.
Hàm lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa Bụp giấm theo axít gallic được tính
theo công thức:

Cthực x V x k x 103

Hàm lượng polyphenol toàn phần (mg/g) =

x 100

m x (100-H)
Trong đó:
Cthực: nồng độ polyphenol toàn phần trong dung dịch thử (µg/ml).
V: thể tích dung dịch thử (ml).
k: hệ số pha loãng.
m: khối lượng của dược liệu (g).
H: hàm ẩm của bột dược liệu đài hoa Bụp giấm (%).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thẩm định phương pháp.
* Tính tương thích hệ thống:
Pha dung dịch axít gallic chuẩn có
nồng độ 10 µg/ml từ dung dịch chuẩn
gốc. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch này,
thực hiện phản ứng với thuốc thử folinciocalteu. Đo độ hấp thụ ở bước sóng
765 nm. Thực hiện đồng thời 5 mẫu. Độ
hấp thụ đo được là 0,158 ± 0,00084 (RSD
= 0,53%). Kết quả này cho thấy: độ lệch
chuẩn tương đối (RSD) về độ hấp thụ của
dung dịch chuẩn sau khi phản ứng với
thuốc thử folin-ciocalteu < 2%. Như vậy,
phương pháp phân tích này tương thích
với hệ thống quang phổ UV-VIS.

* Xác định khoảng tuyến tính:
Lấy chính xác 1, 2, 3, 4, 5 ml dung
dịch chuẩn gốc cho vào các bình định
mức 10 ml. Định mức tới vạch bằng nước

cất. Lắc đều, thu được các dung dịch có
nồng độ thay đổi tương đương 10, 20, 30,
40, 50 µg/ml axít gallic. Hút chính xác
1,0 ml các dung dịch trên cho vào ống
nghiệm được đánh số từ 1 - 5 tương ứng.
Thực hiện phản ứng với thuốc thử folinciocalteu. Song song làm một mẫu trắng.
Đo độ hấp thụ của các mẫu ở bước sóng
765 nm. Mối tương quan giữa nồng độ và
độ hấp thụ của axít gallic chuẩn được thể
hiện trong bảng 1 và hình 1.
9


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
Bảng 1: Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn ở các nồng độ (n = 3).
STT

C (µg/ml)

1

10

0,156 ± 0,001

2

20

0,301 ± 0,001

3

30

0,445 ± 0,002

4

40

0,578 ± 0,002

5

50

0,708 ± 0,001

A(

± SD)

Hình 1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ axít gallic chuẩn.
Kết quả: độ hấp thụ và nồng độ axít gallic có tương quan tuyến tính chặt với hệ số
tương quan R2 = 0,9994 và phương trình hồi quy tuyến tính là A = 0,0138 x
C - 0,0231.
Trong đó: A: độ hấp thụ của dung dịch; C: nồng độ của dung dịch axít gallic
chuẩn (µg/ml).
2. Khảo sát độ đúng của phương pháp.

Thực hiện theo phương pháp thêm chuẩn. Thêm lần lượt 1,0 ml dung dịch chuẩn có
nồng độ là 10, 20 và 30 (µg/ml) vào các ống nghiệm chứa 1,0 ml dung dịch thử T. Mỗi
mức nồng độ thêm làm 3 mẫu. Thực hiện phản ứng với thuốc thử folin-ciocalteu, sau
đó đo quang. Dựa vào phương trình đường chuẩn, tính lượng chuẩn tìm lại. Từ đó,
xác định phần trăm tìm lại chuẩn.
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp.

10

TT

Lượng thêm vào (µg)

Lượng tìm lại (µg)

Tỷ lệ (%) tìm lại

1

10,00

10,05

100,50

2

10,00

10,07

100,70

3

10,00

10,07

100,70

4

20,00

20,58

102,90

5

20,00

20,57

102,85


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
6

20,00

20,61

103,05

7

30,00

29,86

99,53

8

30,00

29,84

99,47

9

30,00

29,88

99,60

= 101,03%

RSD = 1,49%

Phương pháp định lượng có độ đúng cao với tỷ lệ % chất chuẩn tìm lại từ 99,47 103,05%, trung bình 101,03% và RSD = 1,49%.
3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
Bảng 3: Kết quả đánh giá độ chính xác trong ngày và khác ngày.
Độ chính xác

MC1 (7,5 µg/ml)

MC2 (17,0 µg/ml)

MC3 (35,0 µg/ml)

7,46 ± 0,13*

17,17 ± 0,07*

34,80 ± 0,17*

± SD, µg/ml)

RSD = 1,68%

RSD = 0,42%

RSD = 0,48%

Khác ngày (n = 6)

7,37 ± 0,14*

17,11 ± 0,13*

34,58 ± 0,29*

RSD = 1,91%

RSD = 0,73%

RSD = 0,85%

Trong ngày (n = 3)
(

(

± SD, µg/ml)

(*: Nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn)
Chuẩn bị các mẫu chuẩn ở 3 mức nồng độ (7,5; 17,0; 35,0 µg/ml). Mỗi nồng độ
chuẩn bị 3 mẫu. Xác định nồng độ theo đường chuẩn của các mẫu trong cùng 1 ngày
và khác ngày. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối ở các điểm khảo sát trong
ngày và khác ngày đều < 2%. Như vậy, phương pháp có độ chính xác cao và đạt yêu
cầu phân tích.
4. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong mẫu đài hoa Bụp giấm.
Bảng 4: Hàm lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa Bụp giấm.
STT

Hàm lượng polyphenol toàn phần

1

28,51

2

29,86

3

29,69

± SD

29,35 ± 0,73

Áp dụng quy trình đã thẩm định để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần trong
mẫu dược liệu nghiên cứu. Kết quả thực nghiệm cho thấy, hàm lượng đạt 29,35 ±
0,73 mg/g (theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối) tính theo axít gallic.
11


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
BÀN LUẬN
Polyphenol là nhóm hợp chất có hoạt
tính sinh học mạnh, có nhiều tác dụng
như chống oxy hóa, kháng virut, chống

ung thư, giảm lipid máu, có mặt trong
nhiều loài dược liệu [7]. Polyphenol là
hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tồn tại
trong thực vật có tác dụng bảo vệ cơ thể,
giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh
khác nhau do gốc tự do gây ra. Đặc điểm
chung của chúng là trong phân tử có
vòng thơm (vòng benzen) chứa một hoặc
nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp
vào vòng benzen. Tùy thuộc vào số
lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm
OH với bộ khung hóa học mà tính chất lý
- hoá học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi
[1]. Nhiều nghiên cứu cho thấy
polyphenol là thành phần chính trong dịch
chiết nước và ethanol của đài hoa Bụp
giấm [8]. Dịch chiết polyphenol của đài
hoa Bụp giấm có tác dụng hạ lipid máu,
hạ đường huyết trên động vật thực
nghiệm và trên người [9]. Do đó, hàm
lượng polyphenol toàn phần là tiêu chí
quan trọng để đánh giá chất lượng của
dược liệu này.
Để xác định hàm lượng polyphenol
toàn phần, có thể sử dụng nhiều phương
pháp như HPLC, đo quang. Tuy nhiên,
chúng tôi đã sử dụng phương pháp đo
quang để xác định hàm lượng polyphenol
toàn phần vì dễ thực hiện, nhanh chóng
và tính chính xác cao. Ngoài ra, so với

phương pháp HPLC, đo quang còn ít tốn
kém hơn.
Kết quả thẩm định cho thấy phương
pháp đã xây dựng có độ đúng cao
12

(101,63%) và độ lặp lại tốt (RSD =
3,89%). Do vậy, phương pháp này có thể
được ứng dụng để xây dựng chỉ tiêu định
lượng dược liệu và các chế phẩm từ đài
hoa Bụp giấm.
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp
quang phổ UV-VIS dựa vào phản ứng tạo
màu với thuốc thử folin-ciocalteu để định
lượng polyphenol toàn phần trong đài hoa
Bụp giấm. Phương pháp xây dựng phù
hợp với hệ thống quang phổ UV-VIS,
đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu, độ đúng
cao với tỷ lệ thu hồi 101,63% và độ chính
xác cao (RSD < 2,0%). Áp dụng phương
pháp đã xây dựng ở trên để xác định hàm
lượng polyphenol toàn phần trong mẫu
đài hoa Bụp giấm, cho thấy hàm lượng
polyphenol toàn phần trong dược liệu này
đạt 29,35 ± 0,73 mg/g tính theo axít gallic
(theo dược liệu khô tuyệt đối).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Thông. Nghiên cứu cấu
trúc, khả năng chống oxy hóa của một số

polyphenol và dẫn xuất trên nền fullerene
(c60) bằng phương pháp hóa tính toán. 2016,
tr.5-9.
2. Fakaye T. Toxicity and immunomodulatory
activity of fractions of Hibiscus sabdariffa Linn
(family Malvaceae) in animal models. African
Journal of Traditional, Complementary and
Alternative Medicines. 2008, 5 (4), pp.394-398.
3. Dickel M.l, Rates S.M.K, Ritter M.R.
Plants popularly used for loosing weight
purposes in Porto Alegre, South Brazil.
Journal of Ethnopharmacology. 2007, 109 (1),
pp.60-71.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
4. Blainski A., Lopes G.C., De Mello J.C.P.
Application and analysis of the folin-ciocalteu
method for the determination of the total
phenolic content from Limonium Brasiliense L.
Molecules. 2013, 18 (6), pp.6852-6865.
5. Meda A. et al. Determination of the total
phenolic, flavonoid and proline contents in
Burkina Fasan honey, as well as their radical
scavenging activity. Food chemistry. 2005, 91
(3), pp.571-577.
6. ICH Guide. Validation of analytical
procedures: Methodology. International Conference
on Harmonization. Fed. Reg. 1997, 62 (2643).

7. Herranz-López M. et al. Synergism of
plant-derived polyphenols in adipogenesis:
perspectives and implications. Phytomedicine.
2012, 19 (3), tr.253-261.
8. Ramirez‐Rodrigues et al. Physicochemical
and phytochemical properties of cold and hot
water extraction from Hibiscus sabdariffa.
Journal of Food Science. 2011, 76 (3).
9. Peng C.H. et al. Hibiscus sabdariffa
polyphenolic extract inhibits hyperglycemia,
hyperlipidemia, and glycation-oxidative stress
while improving insulin resistance. Journal of
agricultural and food chemistry. 2011, 59 (18),
tr.9901-9909.

13