Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested RT-PCR trong xác định ARN Rubella

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014
ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KỸ THUẬT NESTED RT-PCR TRONG XÁC ĐỊNH
ARN RUBELLA
Nguyễn Duy Bắc*; Dương Thuận Thiên *; Lê Thị Dung*
Nguyễn Viết Trung*; Đặng Tiến Trường*; Trịnh Hải Tuấn
TÓM TẮT
Sốt phát ban Rubella hay “Sởi Đức” do virut Rubella gây nên, bệnh thường nhẹ, ít biến
chứng nhưng lại gây nhiều biến chứng đối với thai nhi, đặc biệt trong 3 tháng đầu của thai kỳ.
Chẩn đoán nhiễm Rubella sớm giúp kiểm soát tốt dịch, hạn chế biến chứng, đặc biệt đối với
phụ nữ có thai. Nghiên cứu này nhằm đánh giá độ chính xác của kỹ thuật nested RT-PCR đã
được công bố trước đây trong xác định ARN của virut. Kết quả cho thấy, kỹ thuật nested
-6
RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, ngưỡng phát hiện thấp 10 ng/ul. Kỹ thuật nested
RT-PCR giúp chẩn đoán nhanh, chính xác Rubella và kiểm soát dịch hiệu quả. Sử dụng kỹ
thuật này cho chẩn đoán trước sinh Rubella sẽ giúp hạn chế số ca nhiễm Rubella bẩm sinh.
* Từ khóa: Virut Rubella; Nested RT-PCR; ARN; Độ nhạy; Độ đặc hiệu.

SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF NESTED RT-PCR
IN DETECTION OF RUBELLA RNA
Summary
Typhus rubella or "German measles" caused by Rubella virus is a mild disease with fewer
complications but does more harm to fetus in pregnant women, especially in the first 3 months
of pregnancy. Early diagnosis can control Rubella epidemic, limitation of losses, especially for
pregnant women. This study aimed to evaluate the accuracy of previously published nested
RT-PCR technique in determining RNA viruses. Results showed that nested RT-PCR technique
-6
had high sensitivity and specificity (100%), a low detection threshold 10 ng/ul. Thus, nested RT-PCR
help diagnose Rubella rapidly and accurately and control the epidemic effectively. Using this
technique for prenatal diagnosis of Rubella will limit cases of congenital Rubella infection.
* Key words: Rubella virus; Nested RT-PCR, RNA; Sensitivity; Specificity.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sốt phát ban Rubella hay “Sởi Đức” do
virút Rubella gây nên, hay gặp chủ yếu ở
trẻ em, thiếu niên và những người trẻ tuổi
[4]. Bệnh thường nhẹ, ít biến chứng. Tuy
nhiên, phụ nữ mang thai nhiễm Rubella
có thể gây nhiều biến chứng như: sẩy thai,

thai chết lưu, dị tật thai nhi… Thai phụ
mang thai nhiễm Rubella, thai nhi có nguy
cơ bị nhiễm Rubella bẩm sinh (Congenital
Rubella Infection - CRI) và bị hội chứng
Rubella bẩm sinh (Congenital Rubella
Syndrome - CRS) [11].

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc ()
Ngày nhận bài: 15/12/2013: Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/01/2014
Ngày bài báo được đăng: 11/02/2014

16


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014

Chẩn đoán Rubella bằng lâm sàng khó
chính xác vì Rubella chỉ là một trong số
rất nhiều nguyên nhân gây sốt có phát
ban khác như virút sởi, dengue, parvovirus
B19, Chikungunya [5]. Chẩn đoán nhiễm

Rubella cấp tính chủ yếu dựa vào phương
pháp phát hiện hiệu giá kháng thể IgM,
chuyển đảo huyết thanh từ IgG (-) sang
IgG (+). Gần đây, một số kỹ thuật đã được
ứng dụng để chẩn đoán virut Rubella
bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Chúng tôi
xây dựng kỹ thuật nested RT-PCR và áp
dụng trong nghiên cứu tại Trung tâm
Nghiên cứu Y Dược học Quân sự [1].

Thời điểm đó, số lượng mẫu chứng và
mẫu bệnh chưa đủ lớn nên chưa đánh
giá được độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ
thuật. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trên
thế giới đã đánh giá kỹ thuật nested RTPCR có độ chính xác cao và được Tổ
chức Y tế Thế giới khuyến cáo sử dụng
trong chẩn đoán nhiễm Rubella trước và
sau sinh [5, 9, 10].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến
hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu
của kỹ thuật nested RT-PCR trong xác
định ARN của virut Rubella đã được công
bố trước đây.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu.
60 mẫu bệnh phẩm virut Rubella được chẩn đoán xác định bằng phương pháp
phân lập virut và 60 mẫu bệnh phẩm nhiễm các loại vi khuẩn và virut khác gây triệu
chứng phát ban như Rubella gồm: 12 mẫu sởi (ARN), 20 mẫu dengue (ARN), 3 mẫu
parvovirus B19 (ADN), 8 mẫu Chikungunya (ARN) 16 mẫu Coxsackie A (ARN), 01 mẫu

adeno virut (ADN) do Viện Vệ sinh Dịch tễ TW và Pasteur Nha Trang cung cấp.
2. Primer cho phản ứng nested RT-PCR.
Bảng 1: Trình tự các primer phục vụ nhân ADN của virut Rubella.
Ru1-F
Ru1-R
Ru2-F
Ru2-R

CAACACGCCGCACGGACAAC
CCACAAGCCGCGAGCAGTCA
CTCGAGGTCCAGGTCCYGCC
GAATGGCGTTGGCAAACCGG

8807 ± 8826
8991 ± 8972
8826 ± 8845
8968 ± 8949

66
66
68
64

185bp
143bp

3. Tách chiết ARN.
Tách ARN của virut từ 140 μl dịch chứa tế bào nhiễm virut sau nuôi cấy bằng bộ kit
Qiagen ARN mini, theo quy trình chuẩn của nhà sản xuất (Qiagen, Đức), ARN tách
0

chiết được lưu trữ ở -80 C cho tới khi sử dụng.
4. Phản ứng khuếch đại gen nested RT-PCR.
- Phản ứng RT-PCR:
Bảng 2: Thành phần phản ứng RT-PCR
[1].
9


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014

µl

1.

10

3.

QIAGEN OneStep RT-PCR
enzyme Mix
QIAGEN OneStep RT-PCR
buffer 5X
Q - Solution

4.

dNTP mix 10 mM

2

5.

R1-F

1

6.

R1-R

1

7.

ARN mẫu

2

8.

Nước sạch

22

2.

2

10

50 µl

Tổng

Chu trình nhiệt gồm các giai đoạn sau:
chuyển đổi ARN thành cADN ở 50°C
trong 30 phút, sau đó biến tính 95°C ở 15
phút; thực hiện 30 chu kỳ gồm các giai
đoạn: biến tính ở 94°C trong 30 giây, bám
mồi 60°C trong 30 giây, kéo dài 72°C
trong 1 phút. Cuối cùng là giai đoạn kéo
dài 72°C trong 10 phút.
- Phản ứng nested PCR:
Bảng 3: Thành phần phản ứng nested
PCR [1].
µl

1
2
3
4
5
6
7

2+

10X Buffer (15 mM Mg )
Kapa Taq ADN polymerase

(5U/µl)
dNTP mix 25 mM
R2-F
R2-R
Sản phẩm RT-PCR (µl)
H2O
Tổng

kéo dài 72°C trong 1 phút. Cuối cùng là
giai đoạn kéo dài 72°C trong 10 phút.
Thực hiện phản ứng PCR trên máy PCR
Ependoft AG.
Sau khi nhân ADN đích, điện di sản
phẩm ADN trên agarose gel 2% và phân
tích kết quả. Sản phẩm ADN của phản ứng
nested RT-PCR theo lý thuyết là 143 bp.
Thiết bị nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên
cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân
y. Hóa chất nghiên cứu gồm Qiagen ARN
mini kít, Kit Qiagen onestep, primer do Hãng
Invitrogen tổng hợp, nước khử ion, agarose,
thang ADN chuẩn do Hãng Sigma cung cấp.
Phân tích kết quả chẩn đoán dựa vào
bảng 2x2 để xác định độ nhạy và độ đặc
hiệu của kỹ thuật.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Kết quả xác định ARN Rubella bằng
phản ứng nested RT-PCR.

200 bp

100 bp
143 bp

5
0,2

7
NC2

0,8
1
1
4
38
50

Chu trình nhiệt gồm các giai đoạn sau:
biến tính 95°C ở 15 phút; thực hiện 30 chu
kỳ gồm các giai đoạn: duỗi xoắn ở 94°C
trong 30 giây, bám mồi 61°C trong 30 giây,

6 5 4

3

2 1

M
NC1

M: marker 100; NC1: chứng âm của NC
của phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa
chất vòng 2; 1 - 7 lần lượt là các băng
sản phẩm của phản ứng ở Ta lần lượt là
570C, 580C, 590C, 600C, 610C, 630C, 640C.

20


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014
Kết quả tối ưu hóa trên máy Eppendorf AG được thể hiện ở hình 1. Từ kết quả này
chúng tôi lựa chọn được nhiệt độ gắn primer của phản ứng nested PCR là 61oC.
2. Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật nested RT-PCR trong chẩn đoán nhiễm virut
Rubella.
* Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật:
Bảng 4: Kết quả chẩn đoán trên 120 mẫu bằng kỹ thuật nested RT-PCR.

Rubella

+
60

0

60

Virut khác

0

60

60

Cộng

60

60

120

Chúng tôi tính được độ nhạy (Se) và độ đặc hiệu (Sp) của kỹ thuật:
- Độ nhạy của kỹ thuật nested RT-PCR: Se = [60:(60 + 0)] x 100% = 100%.
- Độ đặc hiệu của kỹ thuật nested RT-PCR: Sp = [60:(60 + 0)] x 100% = 100%.
Kết quả tính toán cho thấy, độ nhạy 100% và độ đặc hiệu của kỹ thuật 100%. Bên cạnh
đó, các cặp primer của phản ứng nested RT-PCR không có phản ứng chéo với hệ gen của
các loại virut khác gây triệu chứng phát ban như Rubella.
N2

M
N1

1 - 12

P

C

M

13 - 27

Hình 2: Kết quả chẩn đoán mẫu ARN của Rubella bằng nested RT-PCR.
M: marker 100; NC1: chứng âm của phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2;

1-

27 là các băng sản phẩm từ các mẫu ARN Rubella.

21


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014

1 - 12

N2 N1

P

M

C

M
13 - 27

Hình 3: Kết quả chẩn đoán mẫu nhiễm virut không phải Rubella.
M: marker 100; NC1: chứng âm của phản ứng RT-PCR; NC2 chứng âm hóa chất vòng 2;
27 là các băng sản phẩm từ các mẫu nhiễm virut không phải Rubella.

1-

* Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR:
Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật bằng ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR đối
với ARN virut Rubella. Để xác định ngưỡng này, chúng tôi sử dụng quy trình nested RT-PCR
đã tối ưu hóa chẩn đoán trên mẫu ARN Rubella. Pha loãng các mẫu này theo hệ số 10. Sử
dụng 01 mẫu chứng dương, tách chiết ARN, đo trên máy Nano drop. Tiến hành pha loãng
thành dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/µl. Tiếp tục pha loãng dần mẫu ARN của virut
Rubella có nồng độ 100 ng/µl (tương đương 105 pg/µl) theo cấp số nhân với hệ số 10-1
thành các dung dịch ARN có nồng độ 100 ng/µl, 10 ng/µl, 1 ng/µl, 10-1 ng/µl, 10-2 ng/µl, 103 ng/µl, 10-4 ng/µl, 10-6 ng/µl, 10-7 ng/µl, 10-8 ng/µl.

11 10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

M
NC

Hình 4: Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RT-PCR.
M: marker 100; NC: chứng âm của NC của phản ứng RT-PCR; 1-11 lần lượt là các băng sản
phẩm của mẫu 100 ng/µl, 10 ng/µl, 1 ng/µl, 10-1 ng/µl, 10-2 ng/µl, 10-3 ng/µl, 10-4 ng/µl, 10-6 ng/µl,
10-7 ng/µl, 10-8 ng/µl.

Kết quả hình 4 cho thấy, thực hiện kỹ
thuật nested RT-PCR có thể phát hiện
mẫu có chứa nồng độ ở mức 10-6 ng/µl,
tương ứng 0,1 pg/µl. Điều này cho thấy
ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested RTPCR rất thấp.

BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, chu trình nhiệt
của phản ứng RT-PCR và nested PCR đã
được hiệu chỉnh lại trên máy Eppendorf
AG nên có sự khác biệt so với chu trình
22


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014
nhiệt được tối ưu hóa trên máy ABI 9700
đã công bố trước đây.
1. Độ nhạy của kỹ thuật.
Kết quả nghiên cứu này cho thấy, kỹ
thuật nested RT-PCR có độ nhạy 100%.

Độ nhạy của kỹ thuật còn được thể hiện ở
ngưỡng phát hiện ARN của virut rất thấp
(10-6 ng/µl). Theo Thanapal AR và CS
(2008), phương pháp RT-PCR được cho
có độ nhạy và ổn định hơn so với
phương pháp real time PCR [10]. Cũng
theo Bosma và CS (1995), RT-PCR có độ
nhạy tương đương với 2 copies [6]. Trong
khi đó, nghiên cứu của Kiyoko Okamoto
và CS (2011) khẳng định phương pháp
real time PCR khi sử dụng kit Taqman và
chạy trên máy của hãng ABI chỉ cho chẩn
đoán dương tính khi có tối thiểu 10 copies
ARN của Rubella trong mẫu [8]. Điều này
cho thấy kỹ thuật RT-PCR ưu thế hơn so
với kỹ thuật real time PCR về độ nhạy.
2. Độ đặc hiệu.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy
độ đặc hiệu của kỹ thuật nested RT-PCR
100%. Kết quả phân tích trên các mẫu
virut khác gây triệu chứng phát ban như
Rubella không có phản ứng chéo với
những loại virut này. Phản ứng chéo
không xảy ra ở cả virut có bản chất ARN
giống Rubella và ADN không giống Rubella.
Các nghiên cứu khác trên thế giới cũng
cho thấy nested RT-PCR có độ đặc hiệu
cao (100%) [6].
3. Phạm vi áp dụng của kỹ thuật
nested RT-PCR trong chẩn đoán Rubella.

Nested RT-PCR chẩn đoán dựa trên
cơ sở xác định vật chất di truyền của virut
Rubella. Kỹ thuật này có thể tiến hành trên
nhiều loại mẫu khác nhau: mẫu máu, mẫu
dịch họng, mẫu thủy tinh thể ở trẻ sơ sinh
trong chẩn đoán sau sinh và mẫu dịch ối
trong chẩn đoán trước sinh.
Theo Bosma và CS (1995), nested RTPCR là phương pháp chẩn đoán nhanh,
với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, xác định

ARN của Rubella trong nhiều loại mẫu
bệnh phẩm khác nhau. Kết quả xét nghiệm
nhận được trong vòng 24 giờ kể từ khi
nhận mẫu, ngược lại, phương pháp phân
lập virut phải mất 3 - 4 tuần. Như vậy, RTPCR ưu việt hơn hẳn so với phương
pháp phân lập virut về thời gian, ít phức
tạp hơn, đòi hỏi thiết bị đơn giản hơn
[6, 7]. Ưu điểm này giúp kỹ thuật có thể
áp dụng trên phạm vi rộng, nhiều địa
phương hơn. Hơn nữa, phân lập virut
cũng gặp khó khăn nh- nồng độ virut thấp
dễ dẫn tới âm tính giả. Phương pháp
huyết thanh học phát hiện IgM và IgG
kháng virut Rubella phát hiện nhanh, dễ
sử dụng, không đòi hỏi kỹ thuật viên có
trình độ cao và có thể làm ngoài labo.
Nhưng kỹ thuật huyết thanh học cần được
chỉ định đúng thời gian, tránh hiện tượng
âm tính giả do chỉ định quá sớm hoặc quá
muộn (chẩn đoán bằng IgM), dẫn tới bỏ

sót người mắc bệnh. Bên cạnh đó, kỹ
thuật huyết thanh học có nhiều nhược
điểm như chỉ có thể áp dụng ở tuổi thai >
22 tuần, tỷ lệ âm tính giả vẫn còn cao do
nồng độ kháng thể thấp trong máu cuống
rốn của thai nhi và bắt buộc phải lấy máu
cuống rốn của thai nhi, kỹ thuật phức tạp
nên chỉ được tiến hành tại một số ít bệnh
viện chuyên khoa về sản khoa [6].
Nested RT-PCR có nhiều ưu điểm so
với cả phương pháp phân lập virut và
phương pháp huyết thanh học về cả độ
chính xác, thời gian trả kết quả nhanh hơn,
đặc biệt, có thể áp dụng trong chẩn đoán
trước sinh nhiễm Rubella bẩm sinh trên
mẫu dịch ối. Kỹ thuật có độ đặc hiệu cao
và độ nhạy tốt hơn kỹ thuật RT-PCR [10].
KẾT LUẬN
Qua nghiªn cøu trªn 120 mÉu kết quả
cho thấy kỹ thuật nested RT-PCR có độ
nhạy và độ đặc hiệu 100%. Kỹ thuật có
thể được sử dụng phục vụ kiểm soát dịch
Rubella ở mức độ phân tử.
23


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Duy Bắc và CS. Nghiên cứu xác
định ARN virut Rubella bằng kỹ thuật nested

RT-PCR. Tạp chí Y học Việt Nam. 2013, 470,
tr.138-142.
2. Nguyễn Văn Thường, Triệu Thị Thái,
Phùng Nhã Hạnh, Nguyễn Văn Bàng. Hội chứng
Rubella bẩm sinh tại Hà Nội sau vụ dịch đầu
năm 2011. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 2012.
4. Nguyễn Vũ Trung. Virut Rubella. Vi sinh
y học. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2007,
tr.304-307.
5. Banatvala J. E., Brown D. W. Rubella.
Lancet. 2004, 363 (9415), pp.1127-37.
6. Bosma T. J, Corbett K. M, Eckstein M. B,
O'Shea S, Vijayalakshmi P, Banatvala J. E,
Morton K, Best J. M. Use of PCR for prenatal
and postnatal diagnosis of congenital rubella. J
Clin Microbiol. 1995, 33 (11), pp.2881-2887.
7. Cutts F. T, Robertson S. E, Diaz-Ortega
J. L, Samuel R. Control of Rubella and
congenital Rubella syndrome (CRS) in developing
countries. Part 1: Burden of disease from
CRS. Bull World Health Organ. 1997, 75 (1),
pp.55-68.

8. Kiyoko O et al. Development of a novel
TaqMan RT-PCR assay for detecting rubella
virus RNA. Journal of Virological Methods.
2011, 168, pp.267-271.
9. Kazumi K, Kaneko M, Sameshima H et
al. Rubella outbreak on Tokunoshima Island in
2004: a population-based study of pregnant

women. J Obstet Gynaecol Res. 2010, 36 (5),
pp.938-943.
10. Thanapal AR et al. Laboratory confirmation
of congenital Rubella syndrome in infants: An
eye hospital based investigation. Journal of
Medical Virology. 2008, 80, pp.536-546.
11. WHO. Controlling rubella and preventing
congenital Rubella syndrome - global progress.
2009. Wkly Epidemiol Rec. 2010, 85 (42),
pp.413-418

24